三种血虚证小鼠模型的总抗氧化能力比较

三种血虚证小鼠模型的总抗氧化能力比较

2002207108 时良慧 02中基（七）

摘要：目的：观察血虚模型总抗氧化能力的变化以及观察中药对血虚小鼠模型总抗氧化能力的影响。方法：将四十只小鼠随机分四组，每组十只，分别为正常对照组、环磷酰胺组、乙酰苯肼组、四物汤组。造模后挖眼取血，测其血清的总抗氧化能力。结果：环磷酰胺组与正常组的总抗氧化能力无显著差异。乙酰苯肼组及四物汤组的总抗氧化能力与正常组、环磷酰胺组比较，均显著性升高。乙酰苯肼组和四物汤组的比较，无显著差异。结论：用乙酰苯肼造模能使小鼠总抗氧化能力升高，环磷酰胺造模后，小鼠总抗氧化能力没有显著改变。

关键词：环磷酰胺乙酰苯肼四物汤总抗氧化能力

乙酰苯肼可以使红细胞发生溶血。单用乙酰苯肼（APH）造模可使白细胞显著上升，红细胞减少。APH能较专一地对红细胞有缓慢性的进行性氧化性损伤作用[1]，最终造成血液中红细胞数明显减少，网织红细胞病理性代偿增高和白细胞数量代偿性升高[2-4]。

环磷酰胺是一种临床广泛应用的抗肿瘤药物，在治疗恶性肿瘤中取得了显著的疗效，但环磷酰胺在抗肿瘤的同时，又会产生许多毒副作用，其中引起贫血是最常见的毒副反应之一。

四物汤是一补血活血调经的经典名方,由熟地黄、当归、白芍、川芎组成,具有确切的疗效。本实验观察其对乙酰苯肼血虚模型小鼠的纵抗氧化能力影响。

1、原理、材料与方法

1.1实验原理：机体内的许多抗氧化物质，它能使三价铁还原成二价铁，二价铁可与实验试剂中的菲啉类物质形成稳固的络合物，然后通过比色可测出其总抗氧化能力的高低。

1.2实验动物与材料：

昆明种小鼠，雄性，40只，随机分组：正常组、环磷酰胺组与乙酰苯肼组、四物汤组各10只。

材料：EF管（1.5ml）若干；一次性试管若干；移液器(P20ul,P100ul,P1000ul)各一把；玻璃比色皿（3ml,1cm光径）4只；温浴箱；722分光光度仪计（上海精密科学仪器有限公司）；UV-7504紫外可见分光光度计（上海新戊仪器有限公司，出厂编号5040511012）；漩涡混匀器；台式离心机，型号TDL80-2B（上海安亭科学仪器制造厂）。

药物和试剂：试剂盒组成及配置：（50T）

试剂一：液体60ml*2瓶，4度保存。

试剂二：粉剂*2支，用时每支加双蒸水至120ml，室温保存。

试剂三：黄色贮备液10ml*1瓶避光冷藏保存，贮备液的稀释液60ml*1瓶。试剂三应用液的配制：临用前取贮备液以稀释液稀释，比例为1：19。需多少配多少。

试剂四：溶液24ml*1瓶

试剂五：溶液24ml*1瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可使用）。——测组织中总抗氧化能力使用到，测血清时用不到。

1.3血虚证造模

组别造模及给药

A 腹腔注射同C组造模药物等量的生理盐水，第1、2日各1次。

皮下注射同B组造模药物等量的生理盐水，第1、4日各1次。

B 皮下注射2％乙酰苯肼溶液，1.7mg/10g/只，第1、4日各1次。

腹腔注射同C组造模药物等量的生理盐水，第1、2日各1次。

C 腹腔注射10mg/ml环磷酰胺注射液，1mg/10g/只，第1、2日各1次。

皮下注射同B组造模药物等量的生理盐水，第1、4日各1次。

D 皮下注射2％乙酰苯肼溶液，1.7mg/10g/只，第1、4日各1次。

腹腔注射同C组造模药物等量的生理盐水，第1、2日各1次。

1.4测定方法：

样本处理：取全血，3500转/分离心15分钟得血清待测。

单位：ml 对照管 测定管

试剂一

0.5 0.5 血清

0.1 试剂二

1.0 1.0 试剂三

0.25 0.25 漩涡混匀器充分混匀，37度水浴30分钟

试剂四

0.05 0.05 蒸馏水

0.1 漩涡混匀器充分混匀，室温放置10分钟，蒸馏水调零，1厘米光径，520nm 处测各管吸光度。

2.结果与分析

2.1实验动物数量分析 实验过程中四物汤组有两只小鼠死亡，其他三组小鼠均纳入数据分析。

2.2总抗氧化能力测定 2.2.1第一次测定：

组别 组别

Sig 正常组 环磷酰胺组

0.924 乙酰苯肼组* 0.000 四物汤组*

0.048环磷酰胺组 乙酰苯肼组*

0.000 四物汤组*

0.040乙酰苯肼组 四物汤组

0.109第一次测定：正常组与环磷酰胺组比较均无显著性差异；正常组、环磷酰胺组与乙酰苯肼组和四物汤组比较均有统计学意义，乙酰苯肼组和四物汤组的总抗氧化能力有所升高；乙2007年3月28日第二次实验：

Sig 组别 组别

0.451 正常组 环磷酰胺组

乙酰苯肼组* 0.025 四物汤组*

0.013 0.004 环磷酰胺组 乙酰苯肼组*

四物汤组*

0.002 0.815 乙酰苯肼组 四物汤组

第二次测定：正常组与环磷酰胺组比较均无显著性差异；正常组与乙酰苯肼组和四物汤组比较均有统计学意义；环磷酰胺组与乙酰苯肼组和四物汤组比较均有统计学意义；乙酰苯肼组和四物汤组比较无统计学差异。

两次测定比较：

第一次、第二次实验结果在统计学分析上结果是一致的，正常组与环磷酰胺组比较无显著性差异；与乙酰苯肼组和四物汤组比较有显著统计学差异。环磷酰胺组与乙酰苯肼和四物汤组相比有统计学差异。乙酰苯肼组和四物汤组的比较没有统计差异。

通过上面的统计分析我们可以知道：在总抗氧化能力强弱方面，环磷酰胺组与正常组的总抗氧化能力无统计学差异。乙酰苯肼组及四物汤组的总抗氧化能力与正常组、环磷酰胺组比较，均显著性升高。乙酰苯肼组和四物汤组的比较没有统计学意义，所以我们也不能比较出它们的总抗氧化能力的高低。 总抗氧化能力 正常组 环磷酰胺组 乙酰苯肼组 四物汤组

平均值1

11.489 11.419 14.326 13.063 平均值2

9.931 9.145 12.318 12.531 时间因素的比较：两次实验的样本及使用的试剂一样，但第二次测定的总抗氧化能力总组别 管号

正常组 6，7，10 9

环磷酰胺组 乙酰苯肼组 1，2，5，8 四物汤组

3，5

第一次实验数据去溶血试管经统计学分析：只有乙酰苯肼组与正常组、环磷酰胺组有显著性差异；乙酰苯肼组与四物汤组比较无统计学意义。第二次实验数据去溶血试管经统计学分析：四物汤组与正常组有统计学差异、与环磷酰胺组比较有显著的差异；乙酰苯肼组与四物汤组比较无统计学意义。

3.实验讨论

用乙酰苯肼造的两组血虚模型总抗氧化能力为什么比正常组高呢？有实验证明：溶血性贫血患者血清中LPO、MDA的含量明显高于正常对照组；而SOD与总抗氧能力的含量却明显低于正常对照组[6]。

按照别人的经验，我们的实验结果，应该乙酰苯肼造的两组血虚模型总抗氧化能力比正常组低。但为何实际与理论为什么不相符合？一方面与我们的实验操作有关，另一方面与用乙酰苯肼造模也有关系。

乙酰苯肼是通过溶血达到造模目的的。溶血简单来说就是红细胞的破裂。乙酰苯肼作用于红细胞的细胞膜，红细胞破裂后大量的血红蛋白释放到血浆当中。血红蛋白（Hb）由珠蛋白和亚铁血红素结合而成，所以红细胞的破裂会使的乙酰苯肼组及四物汤组的样本中有比较多的亚铁离子，是测得的总抗氧化能力升高。这也可能是造成乙酰苯肼组、四物汤组总抗氧化能力值会高于正常组和环磷酰胺组的原因之一。另一方面血红蛋白的分解产物胆红素是体内最丰富的抗氧化物质，这也将是造成乙酰苯肼组、四物汤组总抗氧化能力值会高于正常组和环磷酰胺组的另一原因。

四物汤组与乙酰苯肼组没有统计学差异。四物汤就没有治疗效果么？其中：我们不能忽略灌胃对小鼠消化吸收的影响。四物汤组少了两个数据，这对统计分析也有一定的影响，毕竟样本越多误差越小。虽然传统上认为中药多无毒副作用,治疗剂量范围宽。有研究提示大剂量四物汤可能影响血虚证小鼠的胃肠功能或其它系统的功能,一定程度上减弱其增强造血作用。这句话的意思是：如果四物汤用多了的话，它的造血作用不能淋漓尽致的发挥，又影响消化系统的功能，所以也有可能是造成四物汤组与乙酰苯肼组没有统计学差异原因之一。

环磷酰胺组与正常组的总抗氧化能力无差异。说明环磷酰胺组的总抗氧化能力没有什么显著的改变。环磷酰胺(CY)和乙酰苯肼不同，它对小鼠是化学损伤的作用，但其对红细胞作用不如其对白细胞的作用明显，且作用持续时间较短，模型动物的血象即自然恢复，甚至出现反跳现象[2]。

组间比较：两次实验的样本及使用的试剂一样，但第二次测定的总抗氧化能力总体有所下降，说明时间对总抗氧化能力有一定的影响，趋势是使之降低。这是为什么呢？我认为，样本被搁置了一周，其中有一部分亚铁离子被氧气氧化成三价铁，造成了二价铁的减少，所以总抗氧化能力值也随之降低。

关于去溶血试管再数据分析，这是不太严谨的。因为乙酰苯肼本省就是通过溶血来达到血虚目的的，而且对于乙酰苯肼组来说，被去掉的试管最多，即留下的样本很少，这可能会增大实验数据的分析的误差。另一方面，评价是否溶血有确定的标准么？我们实验时使用肉眼观察的，这其中有很大的主观因素，不同的人观察会有不同的结果，这又是一个误差的来源。

4.误差分析：

（1）.造模灌胃的影响：灌胃有两个小鼠死掉，数据不足。

（2）.本组实验操作的影响：从试剂配置、取样，加试剂：都是有不同的人、用不同的移液器完成，这当中必然会有误差产生。加样时：移液器没有垂直加入，样本可能没有被充分利用，产生误差。

（3）.分光光度计的使用：分光皿没有进行润洗。因为样本量较少，不能用样本润洗；利益方面用蒸馏水润洗的话会稀释测定样本，使OD值减小。

5.结论

用乙酰苯肼造模，能使小鼠总抗氧化能力升高。环磷酰胺对小鼠的总抗氧化能力没有明显影响。四物汤对乙酰苯肼血虚证小鼠的总抗氧化能力没有明显改善。

参考文献：

[1] Azen E A．，et a1．Extravas~Lar d~truction of Acetylpheny1．hydmzL腿darI1aded erythrocytes in the rats。J] J Lab Clin Med 1964，63：122

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[3] 贲长恩血虚动物模型的进一步探讨[J]中援杂志，1981，(6)：69—72．

[4] 丁钰熊溶血性贫血动物外周血象和{妻循环观察及人参、鹿茸、当归朴血注射液的治疗作用 J]中草药．1986，17(5)：44

[5]马增春,高月等.四物汤对环磷酰胺所致血虚证小鼠造血细胞作用的研究.中国实验方剂学杂志. 2001.7(5) 13—15

[6]赵成艳，王忠利，何晓琳.溶血性贫血患者血清中SOD、总抗氧能力、LPO及MDA含量检测的临床价值.大连医科大学学报.2002.24（4）283-284