蛋白质的纯化方法

蛋白质的纯化方法
蛋白质的纯化方法

蛋白质纯化的方法

蛋白质的分离纯化方法很多,主要有:

(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。

(二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。

(三)根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。

1、电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解

质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法

离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见层析技术章)

(四)根据配体特异性的分离方法-亲和色谱法

亲和层析法(aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)

和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。

5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。

蛋白质的纯化方法

蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多,主要有: (一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤: (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二)蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法: 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化

蛋白纯化的一般原则及方法选择

随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可 以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果, 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2.1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果,在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2.2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来,毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想办法脱盐,可用的方法有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液,并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达到平衡,若增加对蛋白溶液的压力,还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱,柱内的填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流出,从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失,缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上,剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2.3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用,通过选择不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂(能结合带负电荷的分子)结合,也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种:二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂;羧甲基用于弱的阳离子交换树脂;季铵用于强阴离子交换树脂;甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成,氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH(pH6~8)下带负电荷,需用阴离子交换柱纯化,极端的pH下蛋白会变性失活.应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同,与树脂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值,因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制,所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比,离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较便宜。值得一提的是,即便是用最精确控制的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,还需要其他的纯化步骤。

Protocol蛋白质纯化步骤

Protocol 蛋白质纯化方法(镍柱) 柱前操作 1.IPTG诱导后,收菌,8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer(BB)溶解(每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min(工作:5s,停止:5s),1500r/m离心10min,去除杂质; 3.取上清,12000r/m离心20min, 得包涵体; 4.用含2M尿素的BB洗包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳);??? 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳); 6.对照电泳结果,将上清或包涵体溶解液上柱; 平衡柱子(柱体积:V) 7. 3V(3倍柱体积)ddH2O(洗乙醇); 8. 5V Charge Buffer(CB); ??? 9. 3V BB; 柱层析 10.上样; 11. 10V Washing Buffer(WB); 12. 6V Elute Buffer(EB); 13.分管收集,每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑),pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素:60.06×6=360.36g

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

分离纯化蛋白质的方法及原理

(二)利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有:1、溶液的pH;2、离子强度;3、介电常数;4、温度。但在同一的特定外部条件下,不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀:原理:蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时,他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时,蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥,阻止了单个分子聚集成沉淀,因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点,利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理,可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来,那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象,能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强,因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出,这就是因为透析除去了盐类离子,使蛋白质分子之间的相互吸引增加,引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时,蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象,能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳,在水中的溶解度很高,而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法:与水互溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性,如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下,然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂,以防局部浓度过高,那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此控制有机溶剂浓度也可以分

蛋白质纯化方法

含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化 一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂:1M IPTG 1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接,构成重组质粒并转化相应的 表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板,37℃培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。 2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落,接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中,37℃通气培养过夜。 3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中(各 10份),适当的温度(20-37℃)震荡培养4小时,至对数中期(A550 =0.1-1.0)。 4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中,剩余培养物 中加入IPTG至终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5, 5.0mM相同的温度继续通气培养。 5.在诱导的1,2,3,4,5个小时取1ml样品于Ep管中。 细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量,诱 导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加 重细菌合成系统的负担,导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大 肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑 制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过 试验确定最佳的培养条件是很必要的。 6.将所有样本室温最高速度离心1分钟,弃上清,沉淀重悬于100微升 1×SDS蛋白上样缓冲液中,100℃加热5分钟,室温最高速度离心1 分钟,取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶,用SDS-PAGE 观察表达产物条带,从而确定优化的培养条件。 二.大量表达靶蛋白 1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的 LB培养液中,在100毫升锥形瓶中,300rpm,37℃通气过夜培养。

蛋白质纯化方法总结

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。 1.前处理:分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态(如果做不到呢?比如蛋白以包涵体形式存在),不丢失生物活性。为此,动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染,油料种子最好先用低沸点(为什么呢)的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况,选择适当的方法,将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁,一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦,因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子,非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后,选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。 如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等,则可利用差速离心的方法将它们分开,收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当介质提取。 2. 粗分级分离:当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大,又不适于用沉淀或盐析法浓缩,则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 3.细分级分离:样品经粗分级分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化,一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小,但分辨率很高。 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的,但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化,而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白,因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质分离纯化的方法: 一、根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 2、密度梯度离心 3、凝胶过滤 二、利用溶解度差别的纯化方法 1、等电点沉淀和pH控制 2、蛋白质的盐析和盐溶 3、有机溶剂分级分离法 4、温度对蛋白质浓度的影响 三、根据电荷不同的纯化方法

His蛋白纯化原理方法和问题分析

组氨酸(His)标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性,无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱(IMAC)纯化。 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et 年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子,可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白,1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强,此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽,1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽,无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果,此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍,相对而言,不带标签的蛋白纯化就非常困难,所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化,而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果,这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化,同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽,应用非常广泛。 Ni柱中的氯化镍可以与有HIs(组蛋白)标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合。 步骤是:过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM。。。。100mM 这样洗脱(当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候)我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用400mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里。 市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种: 一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤: 大肠杆菌的破碎方法: 1)收集培养发酵液,4度7000-8000g离心10分钟,收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻,但是最好能保存成小块或者薄片,这样好用。) 2)取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液(的50mM磷酸缓冲液含NaCl,ml溶菌酶,1mM PMSF,1mM MgCl2,ml Benzonase,其中的菌酶,1mM PMSF,ml Benzonase现加)在冰上混合45分钟,如果pH不在7-8,需要用NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟.

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

蛋白质纯化原理

蛋白质的纯化原理 一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。 (二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。 (三)根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理 (一)利用分子大小 1、透析:原理:利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法:将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题: 如何加快透析过程 (1)加大浓度差,及时更换透析液 (2)利用磁力搅拌器 常用的半透膜:玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤:原理:利用压力和离心力,强行使其他小分子和水通过半透膜,而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析:原理:当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构,排阻在凝胶珠以外,在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内,这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果:大分子先被洗脱下来,小分子后被洗脱下来 (二)利用溶解度差别 4、等电点沉淀:原理:不同蛋白质具有不同的等电点,当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加,足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析

(三)根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理:通过加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也解离为单亚基,处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的,分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析:原理:氨基酸分离常用阳离子交换树脂,树脂被处理成钠型,将混合氨基酸上柱,氨基酸主要以阳离子形式存在,在树脂上与钠离子发生交换,而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力,决定亲和力的因素有:(1)主要是静电吸引力(2)氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是: 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是: 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法

蛋白质纯化试题整理

名词解释 1. 截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO):不能通过膜的最小分子量 2. 超滤:选择合适孔径的超滤膜,在离心力或较高压力下,使水分子和其他小分子物质通过超滤膜,而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜,从而增加蛋白样品浓度,达到浓缩效果的方法 3、陶南效应:离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳IE表面的微环境中,H+被吸引而OH-被排斥,交换剂表面pH比周围低1个pH单位;而阴IE表面的微环境中,H+被排斥,交换剂表面pH比周围高1个pH单位 4、离子交换剂的有效(实际)交换容量:指在一定的实验条件下,每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量 5. 聚沉(coagulation)是指在聚沉剂的作用下,溶液中的蛋白质相互聚集为较大在聚沉物(>1mm)的过程 ?常见的聚沉剂:无机盐类(如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铝),聚合无机盐(聚合铝、聚合铁等) ?聚沉条件:-20℃以下,pH3~6,较高离子强度,高多价金属离子(Fe3+、Al3+) 6. 絮凝(flocculation)是指在絮凝剂的作用下,通过吸附、交联、网捕,把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程 ?常见的絮凝剂:淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生物 ?絮凝作用一般在聚沉作用之后使用;絮凝剂的选择应根据成本、毒性等具体情况考虑;应通过试验筛选获得最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件 7、盐溶:蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随着盐浓度的增高而上升 8、盐析:但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出 9、透析:利用小分子能通过,而大分子不能透过半透膜的原理,把不同性质的物质彼此分开的一种方法。对于蛋白质样品,透析过程中因蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中,因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐(如硫酸铵) 10、排阻极限:指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量 11、凝胶颗粒的分级范围:指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围 12、过滤:利用多孔介质(滤纸、滤膜等)阻截大的颗粒物质,而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。主要用于悬浮液的分离,最简单、最常用 13、离子交换剂的电荷密度:指IE介质颗粒单位表面积的功能基团数量,它决定着离子交换剂的总交换容量 14、离子交换剂膨胀度(吸水值):指干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成的体积膨胀程度。用每克干离子交换剂吸水膨胀后的体积表示(ml/g) 15、梯度洗脱:进行梯度洗脱时,洗脱缓冲液的pH或离子强度是连续发生变化的,洗脱剂的洗脱能力也是连续增加的 16、阶段洗脱:指在一个时间段内用一固定pH或I的条件进行洗脱,而在下一个时间段内用另一固定pH或I的条件进行洗脱的分段式洗脱方式 也分为pH阶段洗脱和I阶段洗脱 17、亲和层析:利用蛋白质与其专一性配体之间的特异性生物学亲和力作用,对蛋白质进行分离纯化的层析技术。 18、等电聚焦电泳:利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一

蛋白质的纯化方法

蛋白质的纯化方法 蛋白质在外加电场作用下,带电的蛋白质颗的纯粒在电场中移动的速度(v)取决于化电场强度E,所带的净电荷q,蛋方白质的分子量、分子形状以及与介质法的摩擦系数f。几种常用的电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳) 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦IEF 双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法电影聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳蛋法,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰白质胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的的多孔网状凝胶。纯不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品化胶。方法 PAGE分辨率很高。电泳过程 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子型表面活性剂,它能够与蛋白质多肽蛋链中的氨基酸残基按大约1 比例白结合。质每一个蛋白质分子都因为结合了许多的的SDS而带有大量的负电荷,而蛋白质纯化分子原有的电荷则可以忽略。该法主方要利用了蛋白质分子量大小不同而分法离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准,则可以估算出不同蛋白质的分子量。等电聚焦将两性电解质eg:pH3-9,pH5-7同蛋白质样品一起加入到已经灌好的蛋凝胶中,在电场下,两性电解质首白质先达到它的等电点而平衡,蛋白质的样品根据它自身的等电点分别向两纯化极移动,最后也达到平衡。方等电聚焦:这种按等电点的大小,生物法分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称等电聚焦。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度,使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦,从而达到分离、测定和鉴定的目的。蛋白质双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色连续电泳几种常用的层析法吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析柱层析离子交换层析法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物,将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。蛋离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素白质如羧甲基纤维素CM纤维素)等,阴离子交的换纤维素如二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纯纤维素)等。化带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强,而方带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。法用不同浓度的阳离子洗脱液,如NaCl溶液进行梯度洗脱,通过Na的离子交换作用,可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法蛋白质的纯化方法凝胶过滤法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或蛋聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的白内部是多孔的网状结构。质的 Sephadex G10-G200葡聚糖凝胶纯

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