抗体纯化

抗体纯化
抗体纯化

抗体的初步纯化与鉴定实验方案提要

第三组:组长:曹婷组员:聂莉、许春燕、吴永琴、周姣

一、实验主要内容

1.兔抗人IgG抗体及鼠抗BSA抗体的初步纯化硫酸铵分级沉淀法

一、材料与试剂配制

1、硫酸铵饱和溶液

将硫酸铵800g~850g 到 1 000ml H2O中

加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH3H2O调pH至7.0

2、0.01mol/L pH7.4的PB液

A液:0.10mol/L NaH2PO4液

称NaH2PO4·2H2O 15.60g,加入H2O至1000.ml

B液:0.10mol/L Na2HPO4液

称Na2HPO4·12H2O 35.80g,加入H2O至1 000ml

取A液19ml,B液81ml加水至1000ml即可。

3、1%BaCl2溶液:称取1gBaCl2溶于100ml水中即可

4、纳氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加H2O至500.00ml

溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。

5、生理盐水:称取9克氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。

6、透析袋:孔径为4KD的透析袋

操作步骤

1、动物血清的取得(1. 取血后,37℃下,让血液凝固1 到2 小时(不加抗凝剂);2. 4℃冰箱过夜(让血块固缩);3. 当血清自然析出后,4℃,3000 r/ min,离心10 min,分离血清,弃去不溶物;4. 将血清移至于灭菌后的100ml的烧杯中,并且估计血清的体积)假设获得的血清的体积为20ml(若体积有变化则按此比例进行适当的改变)

向20ml血清中,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。

2、将静置好的溶液置于50ml的离心管中,离心,3000r/min,20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白,并且获得上清液,将上清液置于100ml的烧杯中。

3、在上清液中再逐滴加(NH4)2SO4饱和溶液50ml,边加边搅拌,充分混合,使成50%(NH4)SO4溶液,静置30min。

2

4、将静置好的溶液置于两个50ml的离心管中,离心3000r/min离心20min,弃上清。

5、向沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,溶解后置于50ml的烧杯中,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。

6、将静置好的溶液置于50ml的离心管中,离心3000r/min,20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。

7、用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋(孔径4KD),将两端密封好。

8、透析除盐,在20倍体积纯水中透析过夜,再置于10倍体积生理盐水中于4℃透析24h,4

小时更换一次透析液。以1%BaCl2检查透析液中的SO42-,直至无SO42出现为止。

9、离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG,将上清液收集在50ml的离心管中,置于4℃冰箱保存。

二、纯化产物的鉴定

A.纯度的鉴定

SDS-PAGE:

准备工作

1. 小心清洗电泳槽玻板并干燥;

2. 正确安装固定玻板于电泳槽中;

3. 用融化的琼脂粉封住玻板周围的空隙;

4. 准确吸取凝胶溶液,灌胶.

凝胶溶液的配制(30ml)

凝胶贮液I: 10 ml

凝胶缓冲液II: 15 ml

蒸馏水: 3.34 ml

灌胶前加

10% TEMED 1.5 ml

10% APS 0.16 ml

混匀后迅速灌胶并插入梳子

实验步骤

凝胶溶液的配制(30ml)

灌胶

上样(点样)(10-20微升)

电泳(100V)

取胶

显色(染色)考马斯亮蓝R250染色

脱色

B.活性的鉴定

1.免疫双向扩散法。

1.材料和试剂

(1)PH8.6,0.1mol/L巴比妥——巴比妥钠缓冲液

巴比妥钠10.3 g

巴比妥1.84 g

蒸馏水加热溶解并定容至500ml

(2)1%预复琼脂

1g琼脂加蒸馏水100ml溶化即可。

(3)1.3%琼脂凝胶

1.3g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解(注意不要溢出且注意加入蒸发的水),然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀,置4℃保存备用。

(4)抗原及相应免疫血清。

2.设备和器材

玻璃板、模具,打孔器和挑针、滴管、有盖搪瓷盒(内铺有湿润的滤纸)、温箱(25℃)、三角烧杯、玻璃搅拌、微量加样器、其他常用器材。

操作步骤

1.预复琼脂玻板的制备

将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上,使之能将表面覆盖即可,放于温箱内干燥(或自然干燥),即可用以制备凝胶板。

2.凝胶板的制备

溶化琼脂,在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上,制成厚度约3~4mm的琼脂凝胶板,待冷却后根据所需形状打孔,孔径约3mm,孔间距10mm(注意不宜在室温下放置过久,尽量缩短操作时间,以免干燥)。

梅花型:

3.免疫扩散及结果观察

(1:0,1:1,1:2,1:4,1:8,)将抗原IgG10加入中心孔,将血清稀释,用PBS按以下比例进行稀释:

倍比稀释的免疫血清加入周围孔,每孔加入10,留1孔加10双蒸水,以作空白对照(注意:加样至孔满为止,不可外溢)。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中(如需要可重复加样,加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入,以免孔周围形成不透明的白色圈)。湿盒于37℃中,一般保温24~48h,观察抗原抗体产生的白色沉淀线。

免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。

如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时,抗原也可倍比稀释,多做几个梅花孔以作比较。

C.浓度的鉴定

方法:280 nm和260 nm的吸收差法

核酸对紫外光有很强的吸收,在280 nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克),但核酸在260 nm处的吸收更强,其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm处的消光系数是280 nm处的2倍;而蛋白质则相反,其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。通常:

纯蛋白质的光吸收比值:A280/A260 =1.8

纯核酸的光吸收比值:A280/A260=0.5

含有核酸的蛋白质溶液,可分别测定其A280和A260,由此吸收差值,用下面的经验公式,即可算出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度=1.45×A280 -0.74×A260 (mg/mL)

二、注意要点

1.硫酸铵分级沉淀的基本原理是什么?

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

2.纯度如何简单鉴定?

(1)区带电泳(玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳)

(2)琼脂双相双扩散鉴定

(3)免疫电泳鉴定

(4)圆盘电泳鉴定

3.为什么要进行活性鉴定?

抗体也属于蛋白质,如果抗体没有活性就失去了抗体的意义,就不能与抗原特异性结合,没有任何作用,因此要先进行活性鉴定,保证下一步实验的按时进行,以免破坏后面的结果,得到错误的结论。

4.活性鉴定和浓度测定尽量采用简单便行,损失最小的方法。

抗体的活性鉴定一般以琼脂扩散。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1:16以上。

指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散,彼此相遇后形成特异性的沉淀线。

将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内,使两者进行相互扩散,当抗原抗体浓度之比相适宜时,彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。

5.纯化产物如何保存?

直接保存于-20或是-70度比较好。最好分批保存,避免以后反复冻溶。

-20 度加入1:1 的甘油保存(加入甘油后,不会结冰,可以直接吸取)。

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些? 抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清,而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法: 基本原理:高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜,降低球蛋白的溶解性,是分离免疫球蛋白的常用方法,而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别,一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于:鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作: 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%,静置沉淀蛋白; 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解,用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐; 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱,PBS或硼酸盐(含0.02%叠氮钠)缓冲液洗脱; 5.电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度; 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜,-20℃保存不超过一个月,避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理:基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A和protein G结合到柱料上,通过亲和层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍:protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁,分子量42 kDa,由spa 基因编码,具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域

protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段(尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4,豚鼠,猕猴,鼠类IgG2a、兔)以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主,表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能,也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域,另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁,分子量65 kDa,由spg基因编码,可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域,其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白,是基因工程改造产物,是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性,能结合人和鼠的IgG所有亚型,不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于:人(IgG3除外)、兔、豚鼠、猪的抗体; 基本操作: 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2.调节pH到8.0:腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节; 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱,pH8.0 PBS洗杂; 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体(小鼠IgG1用pH6.5,IgG2a用pH4.5,IgG2b和IgG3用pH3.0),并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液; 5.用PBS透析;

抗体ProteinA纯化方法

抗体ProteinA纯化 一.P roteinA柱子的制备 1.配制溶液; 结合/洗涤缓冲液:NaCl,0.5M ;Na2HPO4,20mM ;PH8.0。 配制500ml的方法: 称取NaCl 4.383g,Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。 2. 制备空柱子 (1)先打开用过的PD-10上盖,拿掉上面的盖膜。盖上盖子,摇晃,倒去里面的填料,用PBS清洗3次。 (2)用胶带固定好PD-10空柱子,要求垂直放置。 (3)在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。 (4)ProteinA填料混匀,(10ml包装一小瓶)。 (5)加入5ml的ProteinA到柱子中。 (6) (7) (8) 二.纯化步骤 1.样品准备;将兔血清与结合缓冲液1:1混合,过滤(防止堵塞柱子)。 2.平衡柱子:用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。 3.上样:将准备好的血清样品上样,根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。 4.洗脱杂蛋白:用结合缓冲液冲洗柱子,直至结合液中不含蛋白。 5.收集抗体:用洗脱液过柱,同时收集漏出液(约3-4ml/管),直至漏出液中不含蛋白。 测定各收集管中的蛋白含量,合并蛋白管。(注意:收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液,防止抗体在过酸的环境下失活) 6.柱子再生:用5-10倍体积的再生液再生柱子。 7.PBS透析收集的抗体。 三.试剂的制备 1. 结合缓冲液1000ml 500ml 甘氨酸112.6g 56.3g 氯化钠175.2g 87.6g 氢氧化钠调PH至9.0 2. 洗脱缓冲液500ml

抗体纯化

一、抗体纯化部分 1、腹水/血清的亚型测定完成后,IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化;IgM 亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。 1.1 Protein G 抗体纯化步骤: (1)新柱子先用DDW 5ml过柱; (2)10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱; (3)抗体过柱,过程中要求缓慢过柱,以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上; (4)继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱; (5)5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体,并加入Tris-HCI(pH 9.0)中和甘氨酸,使pH保持为适合抗体保存的中性; (6)10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱; (7)5倍柱体积20%乙醇溶液过柱,于4℃条件下保存纯化小柱; (8)将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析,以彻底去除不相干离子。 其中所用试剂配方: DDW:超纯水 Binding Buffer(100ml):A液,0.2M磷酸氢二钠61ml B液,0.2M磷酸二氢钠39ml 磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g 甘氨酸-盐酸缓冲液:0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7 Tris-HCL缓冲液:1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0 1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤: (1)配制饱和硫酸铵溶液,再用氨水调节pH至8.5 (2)沉淀:a、腹水/血清离心去除细胞碎片,保留上清液并测定体积; b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀使蛋白充分沉淀; c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀,并用PBS溶液(pH 7.0)溶解; d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀使蛋 白充分沉淀; e、继续离心沉淀弃上清去沉淀,用PBS溶液(pH 7.0)溶解; (3)透析:每隔3-6小时换一次透析液,以彻底去除硫酸铵。 其中所用试剂配方: PBS缓冲液(1L pH 7.0):氯化钾0.2g 磷酸二氢钾0.2g 磷酸氢二钠3.35g 氯化钠8g

抗体分离纯化技术的研究进展

生物技术通报 BIOTECHNOLOGYBULLETIN ·技术与方法· 2008年第3期 收稿日期:2007-11-19 基金项目:内蒙古自治区自然科学基金重大项目(编号200408020402)作者简介:侯越(1982-),男,硕士研究生,研究方向:动物学生物技术通讯作者:吴应积,教授 引言 抗体是一种特殊的蛋白质分子,被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等,在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。尤其是抗体作为各种免疫分析的核心试剂,对免疫分析结果的灵敏度、 特异性起着至关重要的作用。在对一些与生命体功能关系密切的新基因产物的研究中,是否拥有相应的抗体以检测与鉴定新基因的产物蛋白质,是整个研究工作能否深入开展的关键。 抗体技术是免疫学领域中的一个重要方面,广泛应用于生命科学和医学各学科。从第一代抗体———血清多克隆抗体开始,它就在疾病治疗和体外诊断中发挥了很大的作用。由于免疫动物制备血 清抗体的免疫原性和非均质性,给抗体研究和应用造成了困难[1],激发了人们对抗体进行深入研究的热情。1975年Kohler和Milstein通过杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体即第二代抗体—— —单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb),是均质的异源抗体[2]。单克隆抗体具有高度均质性、高度特异性,促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性,是目前应用最广泛的抗体。单克隆抗体的出现,引起了生物学理论的革命,生物学技术的广泛应用提供了重要的工具[3]。20世纪80年代采用基因工程的手段研制抗体,并对抗体的基因进行改造和重组等,制备出第三代抗体——— 基因工程抗体(geneticengineeringantibodyGEAb)。基因工程抗体主要对现有的鼠源性单克隆抗体进行人工改造,并 抗体分离纯化技术的研究进展 侯越 罗奋华吴应积 (内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特010021) 摘 要: 制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败。抗体 的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。 关键词: 抗体 分离 纯化 ProgressinTechnologyofAntibodyPurificationandSeparation HouYueLuoFenhuaWuYingji (KeyLaboratoryofEducationMinistryofChinaforMammalianReproductiveBiologyandBiotechnology, UniversityofInnerMongolia,Hohhot010021) Abstract: Preparationofantibodiespossessedhighspecificityandaffinityisthebaseofimmunology.Thesuccess ofexperimentdependsonthequalityofantibodies.Preparingantibodieshastwoways:oneiscommonlycurrentmethod,tobeusedtoobtainpolyclonalantibodiesviaimmunizinganimalswithpurifiedantigen;theotherispreparationofmonoclonalantibodybyusinghybridomatechnique.Whatevertechnologyused,thepreparedantibodiesneedstobepurified.Itisessentialtochoosetheproperprocedureforisolationandpurificationofanantibody,accordingtopropertiesandsourceoftheantibody.Thisreviewisfocusedonthecurrentpurificationmethods. Keywords: AntibodiesIsolation Purification

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),简称单抗。 与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒(Georges Ko1er)和英国科学家米尔斯坦(Cesar Milstein)两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

多克隆抗体的制备,纯化及检测

实验九 多克隆抗体的制备,纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时,一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合,受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体,这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后,可刺激网状内皮细胞系统,尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示,实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱,尤其是针对于易代谢,可溶性的抗原。首次注射后大约7天,在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平,在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同,和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类,但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似:抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变,这种改变被称为免疫应答的成熟,具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平

成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒;刀片;25G针头;1ml注射器;20 ml 血液收集管;药铲;离心机以及塑料离心管;加样器及加样管;烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原;乙醇;20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂: 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体,因此在注射前通常采用一些经典的方法,比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带,抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中,处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部,观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后,退出针头并按压伤处以制止血流,再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统,再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落,将血液转移至塑料离心管中,4°C,10,000g离心10分钟,收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔,将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂,并加入1ml抗原溶液,剧烈震荡使之充分乳化,用3ml注射器抽取该乳化液,接上25G针头,排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处,在4个不同的部位进行皮下注射,两处在后背,两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤,将针头以相对皮肤15度的角度进针,进针深度为1cm-2cm,小心不要刺入肌肉中,在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后,将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出,并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原,并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较,检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液,但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部,用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液,若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处,再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处,轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。

单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定

单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定 一、实验目的: 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑,它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理: 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖,但不能分泌特异性抗体;而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体,但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞,继承了两个亲代细胞的特性,既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性,又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养,未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡;未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断,又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择,可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,在体内或体外培养,即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材: 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法: 1、抗原制备; 一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。 A.可溶性抗原(蛋白质)以1mg/ml~5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为~,间隔3~5周再同样注射一次,

10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原~,3~4天后,杀死小鼠取脾做融合用。 B. 颗粒性抗原如抗原来源方便,可以不加佐剂而增加免疫次数,缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0.2ml,每周2次,共免疫5~8次,取脾前3天,再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大,大到近于免疫耐受的程度更好。 2、免疫动物; 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/ c小白鼠应用最广,因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以8~12周龄为宜。 大白鼠也可,能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上,发展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。 免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。 正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞,一只纯种小白鼠估计能产生×107~×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合,只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会,必须加强免疫,使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。 B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合,而免疫以后7~8天,虽然是抗体产生的高峰时期,但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。 3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备; 脾细胞制备 (1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠,拉颈或用CO2处死小白鼠。 (2) 将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。

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抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵(NH4)SO4 ·饱和硫酸铵溶液(SAS) ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液(SAS) 将767g(NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1 mol/L, 25°C); 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1;

二、沉淀 1、样品(如腹水)20 000′g 离心30 min,除去细胞碎片; 2、保留上清液并测量体积; 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:1(v/v); 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min(4°C)。弃上清保留沉淀; 2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时(4°C),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨; 3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v); 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C); 3、3000′g 离心30 min(4°C),保留上清液; 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨; 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效的; 二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1); 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma

抗体纯化常见问题回答

用 户园地Q & A 30 鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相 互作用,使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析 即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体 纯化提供很好的解决方案。然而要得到高质量高纯度的抗 体,需要我们从样品处理,纯化介质的选择以及纯化方法 上悉心考虑,这里我们就这些大家常见的问题来讨论。 1,对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品, 有哪些样品处理的方法? 在纯化前,合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高 纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱,延长使用寿 命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂 蛋白,酚红,小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白,这些脂蛋白和脂 类物质会堵塞层析柱,最好能在纯化之前去除。方法一是 在二价离子存在的情况下,硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋 白,沉淀可以通过离心除去;方法二PVP能产生一个pH值 依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球 蛋白。很多时候,可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释 腹水,不仅保证样品的结合pH,还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然 并不直接的影响纯化,但是酚红可能结合到某些纯化介质 上,应该尽可能早的被除去,可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除,如 硫酸铵沉淀,羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐,把样品换到 合适的缓冲液中(PH和盐浓度),并除去没有用处的小分 子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。 2,实验室需要纯化小鼠的IgG1,我是选择ProteinG 还是ProteinA? 首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强 度”表(图1)来获取选择哪种配基的指导,针对小鼠的 IgG1, ProteinA结合相对弱,可以选择ProteinG配基的介 质。但由于Protein G结合力较强,因此有时需要pH低于2.0 才能有效洗脱,容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。 此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料,结合缓冲 液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力,目标抗体 在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。 若实验室有AKTA系统,那么Hitrap ProteinG HP是高分 辨率方便快捷的首选。 若没有AKTA系统,MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你 带来最大的快捷和便利,试剂盒含有一个Hitrap ProteinG HP1ml的预装柱,结合,洗脱和中和的缓冲液,一个具有 接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。 Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心 柱,和标准的小离心机一起使用,仅用20分钟就可以完成 一次小规模的抗体纯化。 ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。 3,面对ProteinA如此多的配基形式,它们有何区别 和应用? 蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系,它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域,可以特异性的和样品中的抗体分子结合,而使其他 杂蛋白流穿,具有极高的选择性,通常一步亲和层析就可 达到超过95%的纯度。 ProteinA sepharoseCL-4B,是将从金黄色葡萄球菌表 达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的 介质上,可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。 nproteinA sepharose4FF,nprteinA即为天然 (Native Protein A),表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。 rproteinA sepharose4FF,重组的蛋白A (rProtein A), 经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸,可以单一位 点定向偶联于琼脂糖骨架上,有效降低空间位阻,增加了 与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引 用人源的IgG,避免了人源IgG的污染风险。 rmpProteinA,多位点附着的技术,保证更低的配体 的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。 2005年我们推出了新一代的MabSelect ,是第一个使 用高流速琼脂糖凝胶 ( High ?ow Agarose) 作为骨架的新型 蛋白A层析介质,专为大规模抗体纯化而设计。相比传统 抗体纯化常见问题回答

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抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵(NH4)SO4 ·饱和硫酸铵溶液(SAS) ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液(SAS) 将767g(NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1 mol/L, 25°C); 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1;

二、沉淀 1、样品(如腹水)20 000′g 离心30 min,除去细胞碎片; 2、保留上清液并测量体积; 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:1(v/v); 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min(4°C)。弃上清保留沉淀; 2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时(4°C),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨; 3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v); 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C); 3、3000′g 离心30 min(4°C),保留上清液; 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨; 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效的; 二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1); 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 (一)动物的选择与免疫 1.动物的选择纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐 剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:① 将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 (二)细胞融合

单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的: 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑,它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理: 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖,但不能分泌特异性抗体;而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体,但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞,继承了两个亲代细胞的特性,既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性,又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养,未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡;未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断,又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择,可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,在体内或体外培养,即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材: 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法: 1、抗原制备; 一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。 A.可溶性抗原(蛋白质)以1mg/ml~5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为0.3ml~0.6ml,间隔3~5周再同样注射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验。

抗体的纯化:盐析法

抗体的纯化:盐析法 发布时间:2009-02-18 新闻来源: 精制抗体的方法很多。一般采用综合技术,避免蛋白变性。如分离IgG时,多结合使用盐析法与离子交换法,以求纯化。提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。 一、原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液,中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质,于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时,中性盐加入蛋白质溶液后,由于离子强度发生改变,蛋白质表面电荷大量被中和,更加导致蛋白溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 1、试剂 (1)正常人混合血清;灭菌生理盐水。 (2)饱和硫酸铵溶液的配制 称(NH4)2SO4(AR)400~425克,以50~80℃之蒸馏水500ml溶解,搅拌20分钟,趁热过滤。冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵,瓶底应有结晶析出。 (3)萘氏试剂配制 称HgI 11.5克,KI8克,加蒸馏水至50ml,搅拌溶解后,再加入20%NaOH 50ml。 (4)0.02M,PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制: 贮存液 A液:0.2M Na2HPO4:Na2HPO4·12H2O 71.64克,加蒸馏水至1000ml; B液:0.2M NaH2P4:NaH2P4·2H2O 3.12克,加蒸馏水至1000ml; 应用液:取A液81ml加B液19ml混合,再以生理盐水作10倍稀释即成。 (5)0.1M,PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer P配制 将上述A液取81ml与B液19ml混合,再以蒸馏水对倍稀释即成。 (6)20%磺基水杨酸。

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些? 抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料就是腹水与细胞培养上清,而通常经过免疫制备 : 抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDa IgG 150 50,25 IgM 900 65,25 IgM单体180 65,25 硫酸铵沉淀法: 基本原理:高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜,降低球蛋白的溶解性,就是分离免疫球蛋白的常用方法,而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别,一般用来分离抗体的硫酸铵饱与度在33~50%。 适用于:鼠抗所有亚类、其她种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作: 1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2、加入饱与硫酸铵至终浓度45%,静置沉淀蛋白; 3、沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解,用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐; 4、过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱,PBS或硼酸盐(含0、02%叠氮钠)缓冲液洗脱; 5、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度; 6、抗体保存浓度在0、1-30 mg/mL适宜,-20 ℃保存不超过一个月,避免反复冻融。 亲与层析法 基本原理:基因工程改造的protein A与protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A与protein G结合到柱料上,通过亲与层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍:protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁,分子量42 kDa,由spa基因编码,具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域

抗体制备-自己整理

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作,整个技术流程如图: 单克隆抗体制备(免疫2-3月,总周期4-6月) 准备抗原 动物免疫选择免疫动物 Elisa测抗血清 细胞融合(融合剂:PEJ) HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞 (三天内做完流式) 阳性克隆并扩大培养细胞冻存 扩大培养收集上清 单克隆抗体纯化保存 (一)抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。(二)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾

细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml,倍增时间通常为10~15h。 融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于 95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml,次日一般即为对数生长期细胞。在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(feedercell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻 果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细 胞作为饲养细胞的。在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml,提前一天或当天置板孔中培养。 (三)细胞融合 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入 PEG(融合剂)使细胞彼此融合。其后把培养液稀释PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等,常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。 ②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第1min滴加4.5ml培养液; 间隔2 min滴加5 ml培养液,尔后加培养液50ml。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。 (四)有限稀释法 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株,所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长,经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔),按Poisson法计算,应有36%的孔为1个细胞/孔。 细胞培养至覆盖0%~20%孔底时,吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。

硫酸铵纯化抗体

1.兔抗人IgG抗体的初步纯化 ( 硫酸铵沉淀法) 一、基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯 化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。 盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二、试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫 酸铵(NH4)2SO4 3. 饱和硫酸铵溶液4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三,操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。 (一)配制饱和硫酸铵溶液 1.将 767g (NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液(SAS)(4.1 mol/L, 25 ° C ). (二)沉淀 1.样品(如腹水)20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片; 2.保留上清液并测量体积; 3.边搅拌边慢慢加入等体积的

SAS 到上清液中,终浓度为 1 : 1 。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜(4 ° C ),使蛋白质充分沉淀。 (三)透析 1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心 30 min (4 ° C )。弃上清保留沉淀; 2.将沉淀溶于少量( 10-20ml ) PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 四,应用提示 (一)先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1. 边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v) ; 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或过夜 ( 4 ° C );3.3000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C ),保 留上清液;上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到 沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 4.上清 液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀 溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 5.杂蛋白与欲纯化蛋 白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是 非常有效 (二)为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析;硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。 纯化产物的鉴定: (1)效价测定 : 采用间接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1∶ 1

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