白藜芦醇对内毒素诱发的乳腺炎大鼠抗氧化能力的影响

重庆医科大学学生创新实验项目

申请书

项目名称:白藜芦醇对内毒素诱发的乳腺炎大鼠抗氧化能力的

影响

申请者:廖冰洁、唐成莉、傅思华

指导教师:

单位:×××实验教学中心

电话:136********

申请日期:2011年12 月13 日

重庆医科大学实验教学管理中心

研究项目项目

名称

白藜芦醇对内毒素诱发的乳腺炎大鼠抗氧化能力的影响

所属

学科

生物实验

申请

金额

5400元

起止

时间

2011年月至年月项目性质学生自选研究课题型

科研小组成员

姓名性别年级电话及电子邮箱

廖冰洁女2010级136******** 758839529@http://m.360docs.net/doc/info-02327bd128ea81c758f578be.html 傅思华女2010级136******** 1215637915@http://m.360docs.net/doc/info-02327bd128ea81c758f578be.html 唐成莉女2010级136******** 592697063@http://m.360docs.net/doc/info-02327bd128ea81c758f578be.html

指导教师

研究内容和意义简介(400 ~500字)

乳腺炎(Mastitis)是奶牛最常见的一种疾病,是导致奶牛业损失最严重的疾病之一。不仅严重制约了奶牛业的发展,同时也威胁着人类的健康。目前,防治奶牛乳腺炎的方法很多,其中抗生素一直是乳腺炎治疗的主要手段,但长期大量使用抗生索引发了许多新的问题,如耐药菌株增加、乳中抗生素残留等。近年来,提高奶牛的天然抗病能力和奶牛乳腺炎的非抗生素疗法,已成为国内外学者研究的热点。

白藜芦醇(trans—resveratro1,RES)属于非黄酮类多酚化合物,广泛存在于种子植物中,在葡萄皮中含量最高。白藜芦醇的结构中有三个酚羟基,在机体中可以竞争性结合自由基,从而减少自由基含量,达到清除自由基的作用。而发生乳腺炎时机体的抗氧化机能受到破坏,理论应有白藜芦醇能提高机体的抗氧化能力,从而降低乳腺感染的风险。丙二醛(malon—dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dis—mutase,SOD)是检测自由基的重要参数。大量研究表明,机体在炎症发生时,血清SOD活力下降,MDA含量有所上升。

本实验通过给大鼠灌喂不同剂量的白藜芦醇,探究白藜芦醇对内毒素诱发的试验性乳腺炎大鼠的抗氧化能力的影响,从而探究白藜芦醇对乳腺炎的作用。如果白藜芦醇具有抑制乳腺炎的作用,那么,既可以开发奶牛饲料添加剂用以防治奶牛乳腺炎的发生,从而为奶牛乳腺炎的防治提供一条新的思路和一定的理论依据,以促进奶牛业的发展。又可以利用葡萄皮提取其有效成分用于临床防治乳腺炎,为临床乳腺炎的研究提供新方向。

一、立论依据(项目的研究意义和国内外研究现状分析,附参考文献)

自由基是指分子、原子或基团中有不配对电子的一类物质,因为他们都具有氧原子或氧分子,故又称为活性氧或氧自由基(R0S)。其反应能力特别强,可以攻击生物膜和组织的脂质、蛋白质。机体在代谢过程中产生的活性氧及其他氧自由基能攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用,并形成脂质过氧化物,脂质过氧化物在过氧化条件下是不稳定的,能分解生成有细胞毒性的丙二醛(MDA),损伤组织细胞。

炎症是机体受到外界微生物入侵后的一种保护性反应,病原菌一旦侵入乳腺,中性粒细胞(PMN)和巨噬细胞即被动员起来,向乳腺移动,并吞噬这些侵入细菌。这时会出现氧消耗急剧增加的“呼吸猝发”现象,活性氧生成也随之增加,继而引发自由基反应,参与杀灭被吞噬的病原菌。由此可见,中性粒细胞在吞噬细菌的过程中,细胞内会随之生成大量的过氧化物质。虽然,这些过氧化物质也参与杀灭细菌,但它也会对细胞和组织带来损伤,破坏细胞的正常结构,而且酶促反应产生的羟自由基(‘OH)可导致溶酶体的溶细胞作用以及细胞膜脂质过氧化作用,使炎症进一步加重。中性粒细胞(PMN)是乳腺中最重要的防御细胞,与炎症的发生及乳腺的保护密切相关。PMN的杀菌作用主要是通过氧依赖过程实现的,PMN通过释放大量高毒性的活性氧(如O 、H 0:、HOC1等)共同发挥杀菌作用。但是发生乳腺炎时机体的抗氧化机能遭到破坏,大量高毒性的活性氧在杀灭病原微生物的同时也会引起组织损伤。正常情况下,机体的抗氧化能力与不断产生的氧自由基的氧化能力之间保持着动态平衡,不会引起组织损伤,若自由基产生异常增多或机体的抗氧化能力下降,将导致组织的氧化损伤,引发疾病。

有实验表明乳腺炎奶牛机体存在自由基蓄积,并处于过氧化状态。这是由于奶牛乳腺受到感染,产生炎症时,中性粒细胞、吞噬细胞汇集到乳腺吞食入侵细菌,出现氧消耗剧增,活性氧生成增加,由于代谢过程中产生的大量活性氧能够攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,形成脂质过氧化物及其分解产物MDA,导致机体及其乳腺组织细胞受到一定氧化损伤。而且证实了乳房炎奶牛乳腺组织受到氧化损伤,自由基参与了乳腺炎的发生过程。

当给机体灌注一定剂量的细菌内毒素,机体的抗氧化活性下降,而PMN释放大量的活性氧则造成组织细胞代谢紊乱,结构和功能异常。丙二醛(MDA)作为脂质过氧化代谢的产物,其水平高低间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度,总超氧化物歧化酶(SOD)能清除超氧阴离子,保护细胞免受损伤,其水平的高低可间接反映机体清除自由基的能力。大量研究表明,机体在炎症发生时,血清SOD活力下降,MDA含量有所上升。所以理论上当给大鼠灌喂白藜芦醇时机体的血清SOD活力应上升,MDA含量应有所下降。

白藜芦醇(trans—resveratro1,RES)

在1940年首次发现白藜芦醇,20世纪70年代首次发现葡萄中含有这种物质,后来人们发现虎杖、花生、桑椹等植物中也含有这种成分。天然白藜芦醇是一种天然活

性成分,它能以游离态(顺式、反式) 和糖苷结合态(顺式、反式)2种形式在植物(如中药材虎杖)中分布及生物合成,且均具有抗氧化效能,其中反式异构体的生物活性强于顺式,是葡萄中的一种重要的植物抗毒素。20世纪80年代,世界卫生组织调查发现,尽管法国人偏爱奶酪等高脂肪食物,但冠心病发病率和死亡率低于其他西方国家,其原因可能是与法国人常饮含白藜芦醇的葡萄酒有关。此后,白藜芦醇备受关注。

研究表明,白藜芦醇(trans—resveratro1)具有抗癌、抗炎、抗菌、调节血脂,影响骨代谢,预防心血管疾病等生物学作用.同时体外实验表明白藜芦醇具有抑制自由基水平上升,减轻氧化损伤的作用。在正常机体内会有少量的自由基存在,病理状态下,自由基含量会增加,直接造成细胞各成分损害,引起其代谢和功能障。白藜芦醇(trans—resveratro1)属于非黄酮类多酚化合物,广泛存在于种子植物中.结构中有三个酚羟基,在机体中可以竞争性结合自由基,从而减少自由基含量,达到清除自由基的作用。

在一定浓度范围内,白藜芦醇有较强的清除自由基和抑制脂质过氧化的作用,能提高和诱导生物体内抗氧化酶类如SOD的活性来消除体内的过量自由基,抑制自由基反应所致的过氧化脂质(终末产物MDA)的生成。所以当灌喂白藜芦醇给内毒素诱发乳腺炎的大鼠时,血清SOD的活力应提高,MDA含量应有所降低。

既然白藜芦醇具有抗氧化能力,而乳腺炎时机体的抗氧化能力下降,故理论上白藜芦醇应对乳腺炎有预防作用。本实验过程中,将对内毒素诱发的乳腺炎大鼠灌喂不同剂量的白藜芦醇,再检测大鼠乳腺组织和血清丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(SOD)的含量变化,从而的出白藜芦醇对内毒素诱发乳腺炎的大鼠的影响。如果实验成功,那么将对奶牛乳腺炎的发生有一定的预防作用,提高奶牛业的经济效益,而且也可用于人类乳腺炎的临床研究,为药物的研究方面提供一定的理论依据。

二、研究方案

研究目标

?1、探讨白藜芦醇对内毒素(LPS)诱发的试验性乳腺炎大鼠抗氧化机制的影响。

?2、探讨白藜芦醇是否能通过提高机体自身的抗氧化能力而降低乳腺感染的风险。

研究内容

为研究视黄醇对内毒素诱发乳腺炎大鼠的抗氧化能力的影响,将40只孕鼠随机分为正常对照组(Con,n=8)、阳性对照组(P,n=8)和试验组(T,n=24)。自怀孕第10天起,试验组分别灌喂视黄醇(溶解于大豆油)4 000 IU/(kg’d)(L,n=8)、8 000 IU/(kg·d)(M,n=8)、16 000 IU/(kg·d)(H,n=8),对照组灌喂等量的大豆油,连续10 d。产后72 h分别灌注灭菌生理盐水(Con组)和10 g大肠杆菌内毒素(Escherichia coli endotoxin,LPS)(P和T组)到大鼠第4对乳腺内,12 h处死大鼠,收集血清及乳腺组织。通过观察乳腺组织病理切片和测量血清中丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T—SOD)、总抗氧化能力(T—AOC)的含量,来探究白藜芦醇是否对内毒素诱发的大鼠乳腺炎有抗氧化作用。理论上应有白藜芦醇可以通过改善机体的抗氧化机制,对LPS诱发的试验性大鼠乳腺炎发挥一定的预防作用。

研究方法

1、试验动物

60只清洁级健康SD大鼠,其中雌鼠40只,体重260~300 g,均未孕;雄鼠20只,体重350~400 g。适应性饲养1周后,将雌鼠与雄鼠按2:1同笼饲养,使之交配受孕。大鼠确认怀孕后,随机分为正常对照组(C)(n=8)、阳性对照组(P)(n=8)和试验组(T)(n:24)。怀孕第1O天起,开始灌喂白藜芦醇(溶解于大豆油中) J,连续10 d;试验组分为3个剂量亚组,分别灌喂白藜芦醇4 000 IU/(kg*d)(低剂量,L)、8 000 IU/(kg·d)(中剂量,M)、16 000 IU/(kg·d)(高剂量,H);对照组灌喂等量的大豆油。大鼠产后72 h 经乳头管注入内毒素10 g/侧到大鼠第4对乳腺(双侧)内,正常对照组注入等量灭菌的生理盐水。12 h后,颈静脉放血处死动物,收集血清,采集乳腺组织,部分中性甲醛液固定,部分放入一70℃中用于后续分析。

2 、主要试剂

内毒素(endotoxin)即脂多糖(1ipopolysaccharide,LtX5)由O :B 血清型大肠杆菌分离提纯,丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T—SOD)、总抗氧化能力(T—AOC)检测试剂3 、测定指标及方法

3-1:组织匀浆及蛋白浓度的测定取适量乳腺组织按1:6(m:V)加入生理盐水,冰浴匀浆后以12 000 r/rain于4℃离心30 min,收集上清一20℃保存备用。使用前用Bradford法测定蛋白浓度。

3-2: 乳腺组织的病理组织学检查打开大鼠腹腔,观察乳腺病理变化,迅速取部分乳腺组织固定于中性甲醛液中,石蜡包埋,切片,H.E.染色后光学显微镜下进行病理组织学观察。病理切片应观察到:对照组乳腺组织无可见病理变化,腺泡结构清晰可见,腺泡腔内乳汁充盈;P组乳腺组织腺泡腔内乳汁分泌显著下降,腺泡壁皮细胞肿胀、变性、出血严重,大量炎性细胞(以中性粒细胞为主)浸润其中,致使腺泡结构模糊难辨;试验组同阳性对照组相比,病变明显减轻,以L组和M组效果较为明显,

表现为L组和M组腺泡内仅见少量中性粒细胞浸润,乳汁分泌明显增多;H组乳腺组织内有大量中性粒细胞浸润,腺泡壁上皮细胞肿胀、变性明显。

3-3: 乳腺组织及血液抗氧化能力的测定用试剂盒分别检测MDA、T—SOD、T—AOC 的含量。各含量应有:乳腺组织中,同正常对照组相比,阳性对照组MDA有升高的趋势,灌喂视黄醇使MDA水平有所降低(同阳性对照比),但差异均不显著;血清中,与正常对照组相比,阳性对照组与试验组MDA水平均无显著变化。阳性对照组与试验组大鼠乳腺组织中MDA均无显著变化,与正常对照组相比,P组、H组大鼠乳腺组织T—SOD活力显著下降;与P组相比,M组大鼠乳腺组织T—SOD活力显著上升。与乳腺组织中结果一致,与正常对照组相比,P组、H组血清中T—SOD显著下降,L组血清中T~SOD与P组相比显著上升。与正常对照组相比,P组大鼠乳腺组织T—AOC有所下降;与P组相比,L组、M 组大鼠乳腺组织T—AOC显著升高。血清中T—AOC变化规律与乳腺组织一致,与正常对照组相比,P组T—AOC显著下降;与P组相比,L组、M组大鼠血清中T—AOC显著升高。

4、数据处理

用SPSS 13.0进行数据处理分析,统计结果以平均数±标准误( ±5)表示。

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拟解决的关键问题:白藜芦醇是否对乳腺炎中氧化损伤有减弱作用

研究的技术路线:

孕鼠模型的建立

不同剂量的白藜芦醇灌胃

通过注射内毒素建立乳腺炎孕鼠模型

处死大鼠并解剖

↙↓↘

Bradford法测定蛋白浓度病理组织学观察试剂盒分别检测

↘↓↙

统计学分析

结果分析讨论

可行性分析:

(1)实验时间的可行性:经过实验方案的完善和修改,每天需进行实验的时间都控制在了每人可自由支配的业余时间内,完全可以保证实验的顺利

进行。

(2)实验操作的可行性:小组成员都已熟练掌握基本实验方法和操作技能,对实验表现出极大的热情。查阅了大量的资料和准备了充分的实验条

件。

(3)实验理论的可行性:我们的实验猜想和所有的实验步骤均建立在正确的理论及实验方法之上。

(4)实验设备的可行性:实验所需设备为常用设备,实验室均能提供。

(5)经济可行性:实验所需试剂在市场上均有销售,我们有与相关实验的供应商保持联系。所需试剂价格便宜,质量有保证。且在实验步骤上有所

精化,避免了资金的浪费,因此在经济上是可行的。

技术关键:

①对大鼠进行正确科学的采血方法,尽量取得较多的可用的血液,并保存妥当。

②病理切片的观察得当和试剂盒检测MDA、T—SOD、T—AOC的含量的得当与否对整个实验的结果起着重要作用。

研究工作进度安排:

在实验的资金到位之后,我们将马上开始实施实验。拟定2011年X月X日开始。2011年X月X日~2011年X月(X+7)日,大鼠前期饲养,使之交配受孕。

2011年X月(X+10)日~2011年X月(X+20)日,灌喂不同剂量的白藜芦醇给实验组的三个亚组,灌喂等量的大豆油给对照组。

2011年(X+1)月X日,大鼠产后72 h经乳头管注入内毒素10 g/侧到大鼠第4对乳腺(双侧)内,正常对照组注入等量灭菌的生理盐水。

2011年(X+1)月X日,12 h后,颈静脉放血处死动物,收集血清,采集乳腺组织。

2011年(X+1)月(X+1)日,乳腺组织的病理切片观察,乳腺组织及血清MDA、T—SOD、T—AOC活力的变化的检测。

2011年(X+1)月(X+2)日,实验的数据统计得出结论,完成论文。

本实验特色和创新:

奶牛乳腺炎是一种复杂的乳腺疾病,包括乳腺感染、乳腺炎症、微循环和免疫障碍,给乳业生产造成了严重的经济损失。传统的抗生素疗法出现了许多弊端,因此,如何增强机体自身的防御机制是目前国内外研究的热点。本研究通过灌喂不同剂量的白藜芦醇观察其对大鼠试验性乳腺炎的预防作用,为奶牛乳腺健康的营养调控提供新的思路。而且,在人类也存在着乳腺炎,所以,为临床乳腺炎的研究提供了方向,也为药物的制作方面提供理论依据,为广大女性提供了预防乳腺炎和健康的保证。

极具创新之处:

虽然目前对白藜芦醇的研究已广泛,对奶牛乳腺炎的研究也广泛,但是,针对白藜芦醇对乳腺炎的研究还没有。而且,白藜芦醇在植物中广泛存在,所以来源广泛且价廉,所以可以广泛地应用,对奶牛业的发展极其有益。

预期研究结果:

1.如预期的一样,机体的血清SOD活力上升,MDA含量有所下降。

2.白藜芦醇对内毒素诱发的乳腺炎大鼠有抗氧化能力。

三、研究基础

1. 1.与本项目有关的工作基础

2.通过之前实验课的经验积累及积极学习,本课题组各成员都掌握了必

要的操作技能。

3. 2.已具备的实验条件

4.本实验中各项实验操作都可在相应实验室完成:取血、剥离乳腺组织

并保存,可在机能学实验室进行;制作HE切片可在显微形态学实验室进行;通过ELISA检测盒测SOD,MAD浓度等可在学生创新实验室进行。

5. 3.尚缺少的实验条件

6.实验相关试剂、ELISA抗卵巢抗体检测盒及实验动物,可通过网上购买

7. 4.拟解决的途径

。积极联系试剂销售商,在不影响质量的情况下,尽量节省实验经费。

四、经费预算

申请资助金额

5400元

自筹经费来源及金额 学校 支 出 科 目 金 额

计 算 根 据 及 理 由

合 计 5400元 进口的ELISA 试剂盒96T 售价为2400元 60只SD 大鼠,每只40元,2400元 白藜芦醇550 元/公斤,购1Kg ,550元 试管每只0.14元,买100只 购买大鼠所用笼子60元

实验材料费 74元 SD 大鼠

2400元 ELISA 试剂盒 2400元 白藜芦醇 550元

其他 26元

五、申请者承诺

我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助,我与本项目组成员将严格遵守重庆医科大学学生创新实验的有关规定,切实保证研究工作时间,按计划认真开展研究工作,按时报送有关材料,按时接受中期检查和结题验收。

全体申请者签字:

年月日

教学实验室意见:

主任签章

年月日

实验教学中心意见

主任签章:

年月日实验教学管理中心意见

主任签章:

年月日教务处审批意见

负责人签章:

年月日

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