ID2通过上调NOTCH3表达抑制乳腺癌上皮间质转化机制的研究

摘要.................................................................................................................................................. I ABSTRACT .................................................................................................. 错误！未定义书签。缩略词简表................................................................................................................................... V I 目录............................................................................................................................................ VIII 第1章前言.. (1)

1.1 本研究课题的学术背景 (1)

1.2 本研究课题的来源 (9)

1.3本研究的目标和主要内容 (9)

第2章材料与方法 (11)

2.1 质粒、菌株和细胞系 (11)

2.2 抗体 (11)

2.3 质粒DNA的鉴定： (12)

2.4 质粒小提操作步骤 (13)

2.5 质粒大提操作步骤 (14)

2.6质粒双酶切鉴定 (15)

2.7 细胞转染质粒构建高表达细胞株 (16)

2.8瞬时转染siRNA构建干扰id2、notch3、tcf3基因细胞株 (17)

2.9提取细胞蛋白 (18)

2.10 BCA蛋白浓度测定 (19)

2.11 免疫印迹（Western）实验步骤 (20)

2.12 TRIzol法提取总RNA (22)

2.13 总RNA逆转录成cDNA (22)

2.14 荧光定量PCR (23)

2.15 染色质免疫沉淀(ChIP) (24)

2.16 构建pGL3-NOTCH3-pro-luc质粒 (28)

2.17双荧光素酶报告基因检测 (31)

VIII

2.18 划痕实验 (33)

2.19迁移、侵袭实验 (33)

2.20 统计学处理 (33)

第3章结果与分析 (35)

3.1 ID2及NOTCH3在不同乳腺癌细胞系中的表达呈正相关性 (35)

3.2 ID2通过调控NOTCH3抑制乳腺癌细胞的EMT (36)

3.3 在MCF-7细胞系中沉默内源性id2表达在mRNA和蛋白水平下调NOTCH3、E-ca 表达，上调Vimentin表达 (41)

3.4 在MDA-MB-231过表达外源性ID2在mRNA和蛋白水平上调NOTCH3、E-ca表达，下调Vimentin表达 (42)

3.5在MCF-7或MDA-MB-231细胞系中沉默或高表达E2A后NOTCH3在mRNA和蛋白水平负相关变化 (43)

3.6染色质免疫沉淀分析确认E2A直接结合至notch3启动子区 (46)

3.7双荧光报告基因实验证实E2A抑制NOTCH-3启动子报告基因的活性，ID2逆转E2A 作用 (47)

3.8免疫共沉淀分析确认E2A与ID2结合 (50)

第4章讨论 (53)

第5章结论 (56)

参考文献 (58)

附录试剂配置 (61)

附录二硕士期间科研成果 (63)

个人简介 (64)

致谢 (65)

汕头大学医学院硕士学位论文

第1章前言

1. 1 本研究课题的学术背景

乳腺癌是一种常见恶性肿瘤，在女性病例中乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的第一位，因病死亡的病例中，乳腺癌则仅次于肺癌已升至癌症死亡率中的第二位[1]。乳腺癌转移与复发是造成死亡的重要原因，虽然早期乳腺癌患者通过规范化治疗5年生存率可以达到98%，但转移性乳腺癌患者的5年生存率只有26%[2]。肿瘤转移是很复杂的过程，近年来的研究表明，转移关键起始步骤很可能是肿瘤细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。因此，阐明乳腺癌EMT的分子机制抑制乳腺癌的复发与转移、提高乳腺癌患者的生存率重要靶点之一。ID2蛋白，即Inhibitor of DNA binding 2，或Inhibitor of differentiation 2，属于HLH（Helix-Loop-Helix）蛋白分子家族中ID蛋白的一员。HLH蛋白相对bHLH家族蛋白缺少N端可与DNA结合的碱基，因此ID 家族蛋白与bHLH家族蛋白形成的异二聚体结构可拮抗bHLH蛋白同二聚体与DNA的结合及转录功能，所以ID蛋白常表现为负性调控bHLH蛋白生物学功能[3]。ID2在生命发生发育过程对细胞周期与增殖分化、细胞凋亡衰老以及肿瘤生物学中都发挥着重要作用[4]。近年来，关于ID2在肿瘤EMT的研究也得一定的关注。ID2对肿瘤EMT转化的作用在不同肿瘤作用不同，在神经胶质瘤ID2促进EMT进展[5]，而在肾癌[6]和晶状体上皮细胞[7]EMT过程中则表现为抑制作用，在小鼠乳腺组织的EMT模型中ID2被报导通过多种机制抑制EMT，其中机制之一是阐述ID2通过抑制bHLH蛋白E2A对E-Cad的抑制作用来实现对EMT的抑制作用[8]。在人乳腺癌的研究中，2014年在Nature杂志发表的一篇综述报导了ID2在乳腺癌中提示预后良好[9]，Hitesh Appaiah也报道在MDA-MB-231细胞系株中CXCR4上调bHLH蛋白ITF2并促进细胞的侵袭转移性的研究中，同时检测到HLH 蛋白ID2在此过程表达下调，提示着ID2可能与人乳腺癌侵袭转移及EMT存在着负相关关性[10]。E2A蛋白由tcf3基因编码，经不同剪切形成E12和E47两个亚蛋白，属bHLH （Basic Helix-Loop-Helix）蛋白家族成员之一，通常以同源二聚体形式作用于靶基因启动子序列的E-box结构域在转录水平发挥促进或抑制作用[11]。E2A在生命的多个过程起重要作用，在多种生物组织广泛表达，对生命发生发育同样作用重要，特别在淋巴细胞分化和胸腺组织发育上起关键作用[11, 12]。E2A在肿瘤的EMT过程的研究，目前报导E2A可