发酵乳杆菌菌株的多相分类鉴定
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发酵乳发酵乳杆杆菌菌株的多相分类鉴定
杨振宇，高学军，王庭柱
东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030）
E-mail: lili820416@https://www.360docs.net/doc/055900950.html,
摘 要：对9株发酵乳杆菌菌株（2株德氏乳杆菌保加利亚亚种、1株德氏乳杆菌德氏亚种、 3株嗜酸乳杆菌、1株发酵乳杆菌、1株干酪乳杆菌、1株布氏乳杆菌）进行MRS 固体平板培养基划线分离和形态学比较观察，并采用生化试验和特异性PCR 以及RAPD 对其进行鉴定。通过菌体常规磷钨酸负染色标本的透射电镜观察，描述了各菌体的大小、形状以及裂殖方式；依据各菌种生化代谢差异及其代谢酶编码基因序列差异分别设计生化试验和菌种特异性PCR 引物，生化试验得到了6个发酵型，将其鉴定为6个菌群，，而特异性PCR 扩增在菌株水平上将其鉴定为9株菌（2株德氏乳杆菌保加利亚亚种、1株德氏乳杆菌德氏亚种、3株嗜酸乳杆菌、1株发酵乳杆菌、1株干酪乳杆菌、1株布氏乳杆菌），这得到了RAPD 鉴定结果（20个随机引物的RAPD 筛选也得到了9个不同的基因型）的验证。实验还获得了5个种特异性PCR 引物德氏乳杆菌保加利亚亚种的LbdbmanLF -R 、干酪乳杆菌的LbcmanNF-R 、嗜酸乳杆菌的LbarbsK1F -R、发酵乳杆菌的LbpmelAF-R 、德氏乳杆菌德氏亚种的LbddlacZF-R .以及可能是嗜酸乳杆菌菌株AS 1.2467的株特异性的PCR 引物LbamanNF-R 。
关键词关键词：：德氏乳杆菌保加利亚亚种，德氏乳杆菌德氏亚种，嗜酸乳杆菌，发酵乳杆菌，干酪乳杆菌，电镜，生化鉴定，PCR
1. 引 言
乳杆菌（Lactobacillus ），在全世界的工业应用中占有重要的作用，可作为发酵乳的发酵剂。有一些乳杆菌株是益生菌，常用于新鲜的发酵产品或囊形保健品（如冻干粉）中，在人和动物胃肠道以及许多食品、饲料和饮料的制作过程中起主要作用[1,2]。
德氏乳杆菌（Lact. delbrueckii ），依据生态学生境和发酵性能的差异，依据生态学生境和发酵性能的差异，可将其分为三个亚种：常用于蔬菜发酵的德氏亚种（Lact. d. delbrueckii ）以及目前用于乳品的保加利亚亚种（Lact. d. bulgaricus ）和乳酸亚种（Lact. d. lactis ），后两者与其它微生物，如嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus ）和嗜酸乳杆菌（Lact. acidophilus ）一起广泛地应用于Yogurt 、发酵乳以及乳酪的制造工业中[3,4] 。干酪乳杆菌（'Lactobacillus. casei '）群含有许多重要的益生菌株，如Lact. casei Shirota 和Lact. rhamnosus GG ，它们可见于初乳中，特别是在成熟乳酪中大量存在[5,6] 。布氏乳杆菌（Lact. buchneri ）是在酒发酵过程中的害菌或酸败菌，此外，Lact. buchneri 在酵母、发酵淀粉、乳酪、橄榄发酵和青贮饲料中也常见。近年来，越来越多的证据表明，食品工业和胃肠微生物学者需要灵敏可靠的方法，来确定和分析食品中及宿主胃肠道中微生物的含量，尤其是对LAB （特别是乳杆菌和双歧杆菌）的关注，这主要是因为：（i ）这些微生物有益于健康；
（ii）它们可包埋于许多食品中作为益生菌；以及（iii）满足立法、工业体和消费者的关于安全性及完整标示的需要。
传统的鉴定方法主要依赖于表型分析，其中有些技术已被证明适用于某些乳酸菌的鉴定，但表型分析存在一些缺点，例如重现率低、某些技术的不定性（主要是由细菌生长的可塑性引起的）、低辨识能力以及相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[6]。近年来，为了克服传统表型分类学方法的缺陷，已经建立了一系列的干酪乳杆菌和发酵乳杆菌分子鉴定方法，包括遗传探针技术和遗传指纹技术，PCR技术的创立打开了乳酸菌快速鉴定的大门，干酪乳杆菌菌种特异性引物[7,8]和发酵乳杆菌菌种特异性引物[9]已经建立，RAPD技术已经广泛地用于菌株水平的鉴别[10~12]，此外，还建立了许多PCR衍生的鉴定技术（如S-PCR、rep-PCR、AP-PCR、LCR和小卫星序列多态性）以及基于16S rRNA基因和16S~23S rRNA基因间隔区的PCR及其RFLP，即ARDRA技术[1,7,10,13]。
本试验即是进行表型特性及其分子水平的研究，包括形态学观察、生化试验、RAPD和特异性PCR。通过透射电镜观察各菌体，依据各菌种之间生化代谢的差异，设计生化试验，并比对其代谢酶编码基因的序列，尽可能设计菌种水平的较短的PCR引物，力求做出这些菌种不同菌株的PCR鉴定，另外也筛选了20个随机引物，进行菌株RAPD分析，并同生化鉴定及特异性PCR结果进行验证，为乳酸菌相关科学研究和工业化生产提供理论和技术基础。
2.材料和方法
2.1 菌株及其培养条件
试验所用株有德氏乳杆菌保加利亚亚种株AS 1.1863、AS 1.1482，德氏乳杆菌德氏亚种株AS 1.2624（ATCC 9649），嗜酸乳杆菌株AS 1.1854、AS 1.1878（ATCC 4395）、AS 1.2467，发酵乳杆菌株AS 1.1880（ATCC 14931），干酪乳杆菌株AS 1.29以及布氏乳杆菌AS 1.13（对照）。所用菌株是由东北农业大学食品学院于国萍和孟祥晨教授惠赠。
菌株的纯培养通过在无抑制作用的MRS平板培养基上反复划线获得；增殖培养在液体MRS培养基中过夜生长进行。
2.2 菌株的电镜观察
菌株增殖培养后，进行常规磷钨酸负染色透射电镜标本的制作[14]，置JEM-1200EX型电镜下观察并照相。
2.3 生化实验
据文献[15~17]，选取苦杏仁苷、阿拉伯糖、山梨醇、乳糖、核糖、蔗糖和甘露糖代谢为切入点，设计生化试验[17]，各反应体系均为3 ml；而苦杏仁苷和阿拉伯糖发酵试验采用细菌微量生化鉴定管（购自北京陆桥技术有限责任公司）。各菌株生化试验均各做10个平行。
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2.4 模板DNA的制备
采用CTAB法制备菌株DNA样品[18]，紫外（DU640型分光光度计，BECKMAN）测定OD260和OD280。选取纯度介于1.8和2.0之间的样品，稀释至浓度48 ng/μl作为模板备用。
2.5 RAPD
随机引物：：选取20种RAPD随机引物[18]，引物合成于上海英骏生物技术有限公司。
2.5.1 随机引物
2.5.2 随机引物的PCR筛选
筛选：：
扩增反应的体积为25μl，其中含Taq DNA聚合酶1.25 U，10×PCR reaction buffer 2.5μl，模板DNA 1μl，dNTP浓度为200 μmol/L，MgCl2浓度为1.5 mmol/L，随机引物浓度为800 μmol/L，补充去离子水至25 μl。扩增反应执行于96孔梯度PCR仪（Biometra）中，程序为改进靳淼等[20]的方法，即复性温度为34℃。取10 μl扩增产物进行电泳，电压为100Ｖ，琼脂糖凝胶为1%（含EB 0.5μg/l），用GDS-8000凝胶成像系统（UVP）观察电泳结果，筛选出合适的引物后，以提取的各菌株DNA为模板，分别进行PCR扩增和凝胶电泳，并拍照。PCR相关试剂均购自天根生化科技（北京）有限公司。
2.6 特异性PCR
引物设计：：选取甘露糖、乳糖、核糖代谢为切入点，查找其代谢关键酶(编码基因)[20]，2.6.1引物设计
分别为甘露糖磷酸转移酶IIAB（manL)、甘露糖磷酸转移酶IID (manN)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、α-半乳糖苷酶（melA）、核糖激酶(rbsK)，应用DNAman软件比对相应核苷酸序列，Oligo6.0设计菌种特异性PCR引物，详见表1,合成于上海英骏生物技术有限公司。
表1所设计引物的信息
引物名称序列（5’～3’）靶基因扩增子大小退火温度LbdbmanLF TGGGCGACGGTCACATTAAGAT manL 263(bp) 57.1℃LbdbmanLR AAACAACAAGAAGGCGTGCGTAG
LbcmanNF GCTGGGAGCAAGATTACCGAAGA manN 417(bp) 56.9℃LbcmanNR CATCAAGCCGACAACGTGGAAGACA
LbamanNF ATGGCGTTGA manN 685(bp) 41.6℃LbamanNR ACGGGTAACCT
LbarbsK1F AGTGAAGGCGGCTATATTACTC rbsK 685(bp) 51.1℃LbarbsK1R ATGGTTGGGCACCTAAAC
LbbdrbsK2F AGGCGGCTATA rbsK 287(bp) 44.7℃LbdbrbsK2R TGGGCACCTAA
LbpmelAF ACCAACTCTACGAACGCCTAA melA 416(bp) 58.1℃LbpmelAR CGGTGTCTGGACTGTCAATC
LbddlacZF CAATGAATACTACCCGAACCA lacZ 480(bp) 54.2℃LbddlacZR TTAGCGGAAGCAACGAAT
扩增：：PCR反应体系为25 μl，其中含Taq DNA聚合酶2.5 U，10×PCR reaction 2.6.2特异性PCR扩增
buffer 2.5 μl，模板DNA 1 μl，dNTP浓度为200 μmol/L，MgCl2浓度为1.5 mmol/L，每对引物浓度为400 μmol/L，补充去离子水至25 μl。扩增程序如下：94℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，退火温度复性30 min，72 ℃延伸30 min，进行30个循环后72 ℃延伸7 min。取9 μl
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扩增产物进行电泳，电压为100 Ｖ，琼脂糖凝胶为1%（含EB 0.5 μg/l ），用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。
3. 结果
3.1 菌株的分离纯化
菌株经过反复平板划线基本得到纯化，无论是从菌落形态还是镜检观察均为均一的形态。共得到9株乳酸菌，即AS 1.1863、AS 1.1482、AS 1.2624、AS 1.1854、AS 1.1878、AS
1.2467、 AS 1.1880 、AS 1.29 、AS 1.13。
3.1.1菌株的菌落特征描述菌株的菌落特征描述：：
9株菌菌落均粗糙，无色素。其中，AS 1.1863、AS 1.1482、AS 1.2624、AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467、AS 1.29菌落为白色到浅灰色，直径1-3mm ，AS 1.29倾倒平板培养基的深层菌落光滑，透镜成菱形，AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467菌落在显微镜下，一般显示缠绕或微毛状物，从似暗影的菌堆中心放射伸出，深层菌落呈放射或分枝形的不规则；AS 1.1880、AS 1.13菌落为近乎透明，菌落通常扁平，圆形或不规则。
3.1.2 菌株的光镜观察菌株的光镜观察：：
9株菌均为G ＋
性菌，菌体细胞为杆状，大多数单个或成对或者短链，但AS 1.29大多数成链，少见成对；大多两端呈圆形，而AS 1.29菌体细胞两端呈方形。
3.1.3 菌株的电镜观察菌株的电镜观察：：
11株菌中，在裂殖方式上均为二等分裂殖，其中AS 1.1863 、AS 1.1482为长杆状；其它菌体细胞呈短杆状，AS 1.29两端呈方形。电镜照片（×40K ）见图1。
AS 1.2624 AS 1.1880 AS 1.13 AS 1.1863 AS 1.1482
AS 1.1480 AS 1.1854 AS 1.1878 AS 1.29 图1 菌株的电镜照片（×40K ）
3.2生化实验
9株菌的生化鉴定，苦杏仁苷的发酵实验AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467、AS 1.29为阳性；甘露醇AS 1.29为阳性；阿拉伯糖AS 1.1854、AS 1.13为阳性；半乳糖AS 1.1863、
AS 1.1482、AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467、AS 1.1880为阳性；核糖AS 1.29、AS 1.13、AS 1.1880为阳性；甘露糖AS 1.2624、AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467、AS 1.1880、AS 1.29为阳性。判定的结果是，尽管AS 1.1854在阿拉伯糖发酵结果不符外，其余都与各自菌种在文献中所描述的相对应。
3.3菌株的RAPD分型
筛选20个随机引物，发现引物BA63（GGGGGTCTTT）可得到最好的多态性，并可对各菌株做出最大限度的鉴别，见图2，所以引物BA63的RAPD将这些菌株鉴别为9株。
图2 随机引物BA63的RAPD图谱
泳道M为DNA MarkerⅤ，泳道1～9分别为AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467、AS 1.2624、AS 1.1863、
AS 1.1482、AS 1.29、AS 1.1880、AS 1.13。
3.4 特异性PCR鉴定
3.4.1基于rbsK的特异性PCR鉴定
鉴定：：基于rbsK设计了2个引物,分别是LbarbsK1F-R和LbbdrbsK2F-R，前者是嗜酸乳杆菌种特异性的，PCR扩增只有菌株AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467获得了685bp的特异性的唯一条带，其余菌株均无带，见图3；后者是德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株特异性的，只有AS 1.1863、AS 1.1482有287bp的特异性条带，且AS 1.1863、AS 1.1482均有一条>100bp的非特异性条带，AS 1.1482有三条带，多出的一条是>300bp大小的片段，见图4。
图3 引物对LbarbsK1F-R的特异性PCR图谱
泳道M（左）为DNA Marker II，M（右）为DNA Marke rⅠ，泳道1～9同图2，泳道
10为空白对照。
图4引物对LclrbsKF-R的特异性PCR图谱
泳道M为100 bp DNA Ladder，泳道1～10同图3。
鉴定：：基于lacZ设计了的引物
德氏乳杆菌德氏亚种种特异性PCR鉴定
3.4.2基于lacZ的德氏乳杆菌德氏亚
LbddlacZF-R，只有AS 1.2624获得了480bp的特异性的唯一条带，其余菌株均无带，见图
5。
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图5引物对LbddlacZF-R 的特异性PCR 图谱
泳道M 为为DNA Marker II ，泳道1～10同图3。
3.4.3基于manL 的德氏乳杆菌德氏乳杆菌保加利亚亚种保加利亚亚种保加利亚亚种特异性特异性PCR 鉴定鉴定：：基于manL 设计的引物LbdbmanLF-R ，只有菌株AS 1.1863、AS 1.1482获得了263bp 的特异性的唯一条带，其余菌株均无带，见图6。
图6引物对LbdbmanLF-R 的特异性PCR 图谱
泳道M 为为DNA Marker II ，泳道1～10同图3。
3.4.4基于manN 的特异性PCR 鉴定鉴定：：基于manN 设计了2个引物对，分别是LbcmanNF-R 和LbamanNF-R ，前者是干酪乳杆菌种特异性的，PCR 扩增仅有AS 1.29得到了417bp 的特异性唯一条带，其余均无带，见图7；后者是嗜酸乳杆菌菌株特异性的，扩增后有的菌株呈现一定的多态性，共鉴定出了3个基因型，只有AS 1.1854、AS 1.1878、AS 1.2467有675bp 的特异性条带，且只有AS 1.2467是唯一条带，另外2株还有与形成唯一条带的AS 1.2467一样大小的扩增子（>600bp ），AS 1.1854和AS 1.1878比AS 1.2467多一条带（<500bp ），而AS 1.1854有三条带，多出的一条是>900bp 大小的片段，见图8。
图7引物对LbcmanNF-R 的特异性PCR 图谱
泳道M 为DNA Marke rⅠ，泳道1～10同图3。
图8 引物对LbamaNF-R 的特异性PCR 图谱
泳道M （左）为DNA Marke rⅠ，泳道M （右）为DNA Marker II ，泳道1～10同图3。
3.4.5基于 melA 的发酵乳杆菌发酵乳杆菌特异性特异性PCR 鉴定鉴定：：依据 melA 基因设计的引物LbpmelAF-R ，只有菌株AS 1.1880获得了416bp 的特异性的唯一条带，其余菌株均无带，见图9。
图9引物对LbpmelAF-R 的特异性PCR 图谱
泳道M为DNA Marke rⅠ，泳道1～10同图9。
4. 讨论
生化试验将这9株菌鉴定为6个发酵型，即6个菌群，每一群与其在文献中描述的发酵型一致，可以做出亚种水平的鉴定，但是AS 1.1854除外，虽然在阿拉伯糖的发酵上与文献描述（90%以上的菌株阴性）的不相一致，但是进一步的特异性PCR和RAPD还是将其鉴定为嗜酸乳杆菌。本研究也说明生化试验在种水平的鉴定上尚有一定的指导意义。
在RAPD检测中，随机引物BA63得到了最好的多态性，最大限度的将9个菌株鉴别为9株菌，可见RAPD作为一项简单快速的指纹技术，对菌株水平的鉴别与鉴定依然有很大的优势。
在特异性PCR鉴定中，综合这7个图谱的结果，可以得出结论，即可对9个菌株进行菌株水平的鉴定，此外，本试验还发现了5个菌种特异性PCR引物，即嗜酸乳杆菌的LbarbsK1F-R，德氏乳杆菌德氏亚种的LbddlacZF-R，德氏乳杆菌保加利亚亚种的LbdbmanLF-R，干酪乳杆菌的LbcmanNF-R，以及发酵乳杆菌的LbpmelAF-R；另外，引物LbamanNF-R可能是菌株AS 1.2467的株特异性PCR引物，其变异后manN可能有核苷酸的丢失。并以1株布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）作为对照，以达到更加可靠的分类和鉴别。
综上所述，本试验中对菌株进行表型特性及其分子水平的鉴定研究，得到了菌株水平的鉴定结果，表明只有多相鉴定才能够做出乳杆菌菌株水平上的准确分类。经证实，所设计的特异性PCR引物是有效的，这种基于表型特性差异的分子水平鉴定方法是可靠的。本试验选取了5个代谢酶基因为靶标，而且有的引物也很长（远大于10-mer），没有得到较大的多态性，已将9株菌鉴定到了菌株的水平。如果选择足够多的代谢酶为靶标，据此设计足够多的PCR引物，并尽可能降低引物的长度，更可能将更多的细菌鉴定到菌株的水平，这对其他乳酸菌乃至其他微生物的分类鉴定也有一定的借鉴意义。
5.结论
本实验通过对9株发酵乳杆菌菌株进行多相分类鉴定得出如下结论：证实了形态学观察在细菌鉴定中的指示价值；证实了生化试验在种水平鉴定上的指导意义。验证了RAPD对菌株水平的鉴别与鉴定的巨大优势；在特异性PCR鉴定中，验证了对菌株进行表型特性的分子水平的研究，得到了菌株水平的鉴定结果，表明只有多相鉴定才能够做出乳杆菌菌种在菌株水平上的准确分类。此外，获得了5个种特异性PCR引物LbdbmanLF-R 、LbcmanNF-R、LbarbsK1F-R、LbpmelAF-R、LbddlacZF-R，以及可能是嗜酸乳杆菌菌株AS 1.2467的株特异性的PCR引物LbamanNF-R。
参考文献
[1]G. Giraffa, P. De Vecchi and L. Rossetti. Note: Identification of Lactobacillus delbrueckii subspecies
bulgaricus and subspecies lactis dairy isolates by amplified rDNA restriction analysis[J]Journal Appl Microbiol. 1998 Nov;85
[2]SOILE TYNKKYNEN, REETTA SATOKARI, MARIA SAARELA. et al. Comparison of Ribotyping,
- 7 -
Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis, and Pulsed-Field Gel Electrophoresis in Typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei Strains[J]APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1999, Sept, 65(9), 3908–3914.
[3]T. Guarneri, L. Rossetti and G. Giraffa. Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase
chain reaction[J]Letters in Applied Microbiology 2001, 33: 377-381.
[4]SANDRA TORRIANI, GIACOMO ZAPPAROLI, AND FRANCO DELLAGLIO1. Use of PCR-Based
Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp.
Lactis[J] APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1999, 65 (10): 4351–4356.
[5]L.J.H. Ward and M.J. Timmins. Giraffa. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and
Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction[J]Letters in Applied Microbiology. 1999, 29: 90–92.
[6]Collins, M.D., Phillips, B.A., and Zanoni, P. Deoxyribonucleic acid homology studies of Lactobacillus casei,
Lactobacillus paracasei sp. nov., subsp. paracasei and subsp. tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp. nov., comb. nov[J]Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 105-108.
[7]Ulrich RL, Hughes TA. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and
other Gram-positive bacteria[J]Lett Appl Microbiol, 2001, 32(1): 52-6.
[8]L.Cocolin, M. Manzano, C. Cantoni. et al. Development of a rapid method for the identification of
Lactobacillus spp. isolated from naturally fermented Italian sausages using a polymerase chain reaction–temperature gradient gel electrophoresis[J]Letters in Applied Microbiology. 2000, 30: 126–129. [9]Muller MR, Ehrmann MA, Vogel RF. Multiplex PCR for the Detection of Lactobacillus pontis and Two
Related Species in a Sourdough Fermentation[J] Appl Environ Microbiol. 2000 May;66(5):2113-6.
[10]P rodelalova J, Spanova A, Rittich B. Application of PCR, rep-PCR and RAPD techniques for typing of
Lactococcus lactis strains. Folia Microbiol (Praha), 50: 150-4, Feb, 2005.
[11]R ossetti L, Giraffa G. Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR
fingerprint databases. J Microbiol Methods, 63: 135-44, Feb, 2005.
[12]S amarzija D, Sikora S, Redzepovic S. Application of RAPD analysis for identification of Lactococcus lactis
subsp. cremoris strains isolated from artisanal cultures. Microbiol Res, 157: 13-7, Jan, 2002.
[13]Q uenee P, Lepage E, Kim WS. Minisatellite polymorphism as a tool to distinguish closely related Lactococcus
lactis strains. FEMS Microbiol Lett, 248: 101-9, Jan, 2005.
[14]袁肖寒，高学军，李霞. 浓缩嗜热链球菌的超微结构研究. 乳业科学与技术，110：16-18，2005.1.
[15]H olt J, Krieg N, Sneath P. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition. 1994.
[16]东秀珠，蔡妙英.《常见细菌系统鉴定手册》，北京：科学出版社，2001.
[17]凌代文，东秀珠. 《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，北京：中国轻工业出版社，1999.
[18]丛玉婷，高学军，刘衍芬等. EZAL-MY96乳酸菌种菌株分离鉴定. 生物技术，14：38-40，2004.6.
[19]靳淼，高学军，雷蕾. 引进直投型酸奶发酵剂乳杆菌的分离鉴定. 中国乳品工业，31：14-6，2003.4.
[20]h ttp://www.genome.jp/kegg/pathway.html和https://www.360docs.net/doc/055900950.html,/
Polyphasic taxonomy methods for identification of bacillus
strains from fermented milk
YANG Zhen-yu, GAO Xue-jun, WANG Ting-zhu
(The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural U niversity, Harbin 150030, China)
Abstract
In this paper, the isolation and identification of 9 bacillus strains(2 Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricu strains,1Lb. delbrueckii subsp. Delbrueckii strain,3Lb. acidophilus strains, 1 Lb. fermentum strain, 1 Lb. casei strain, 1 Lb. buchneri strains) were studied. The lactic acid bacteria were isolated by MRS plate streaking cultivation and morphological observation (light and electron microscope examination), and were identified by biochemical essay, specific PCR and RAPD technique. The result of plate streaking cultivation was 9 strains; The size, shape and schizogenesis styles of every strain which was negatively stained by PTA were obtained by TEM observation; The biochemical essay and the specific PCR primers were designed based on the differences of each strains at the level of species and between their genes coding these biochemistry metabolic enzymes respectively, and the result of biochemical identification had 6 distinct fermentation types which classified these strains as 6 microbial population. the PCR amplifications classified these strains as 9
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Key words: Lb. delbrueckii subsp , Lb. acidophilus, Lb. fermentum , Lb. casei ,Electron microscope, Biochemical identification, PCR
作者简介作者简介：：杨振宇（1982-），男（汉族），山东招远人，硕士，主要从事乳酸菌的生化与分子生物学研究。