_嗜热枯草芽孢杆菌TT68产β-甘露聚糖酶发酵条件的优化
枯草芽孢杆菌-MBS发酵工艺设计
课程设计 姓名： 学院：生命科学学院 系别：生物工程 班级： 学号： 指导教师： 日期：2011年4 月 19日～5月31日
在畜禽养殖中使用益生菌不仅可避免长期使用抗生素所引起的肠道微生态平衡被破坏、产生耐药性及药物残留等问题 ,还能提高动物的生产性能和免疫力。枯草芽孢杆菌能改善肠道微生态环境 ,促进动物生长和提高抗病力 ,而且分泌各种消化酶类 (如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等 ) ,促进养分的消化、吸收 ,更重要的是枯草芽孢杆菌在不利环境条件下能形成芽孢 ,在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高活性。因此 ,枯草芽孢杆菌比其他有益微生物有着更多的优点而得到广泛的研究和应用。试验选择在实际畜禽饲养生产中效果较好的 1株枯草芽孢杆菌 - MBS为研究对象 ,对其成长条件及培养基成分进行优化 ,为标准化生产提供依据。 利用实验获得的最优条件依次在摇瓶中及一级种子罐中扩大培养，发酵罐中扩大培养以获得所需菌体。所得菌体经过进一步的加工处理得到菌剂等产物，以获得经济效益。 本设计为单批次液体发酵1吨枯草芽孢杆菌-MBS的发酵工艺设计，通过设计得出实际生产所需的设备及其规格要求，各理论的配比系数等参数，旨在应用到实际生产当中去。
设计任务书 (3) 1 设计题目：单批次液体发酵1吨枯草芽孢杆菌-MBS的发酵工艺设计 (3) 2 基本工艺流程： (3) 3 设计依据： (3) 4 设计结果： (3) 设计正文 (3) 1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.1生理特性 (3) 1.2作用机理 (3) 1.3应用范围 (3) 2设计依据 (4) 2.1基本发酵工艺流程 (4) 2.2总体发酵规模 (4) 2.3发酵工艺设计理论参数与及工艺环节参数的选择原则 (4) 3 发酵工艺流程与设备流程设计 (5) 3.1工艺环节参数推算过程 (5) 3.1.1接种量及装液系数 (5) 3.2工艺流程简图 (5) 3.3设备选型推算过程 (5) 3.3.1种子罐及发酵罐 (5) 3.3.2蒸汽发生器 (6) 3.3.3空气压缩机 (6) 3.3.4冷冻干燥机 (6) 3.4实际设计的发酵工艺参数汇总表1 (6) 3.5实际确定的发酵设备选型推算结果参数汇总表2 (6) 3.6设备流程简图 (6) 4 发酵最优条件简述 (7) 5 设备汇总图表 (8) 5.1 (8) 5.2 (8) 6 参考文献 (9)
甘露聚糖酶作用原理
β-甘露聚糖酶（endo-1,4-β-mannanase）是一种新型的酶制剂，属于一种半纤维素酶类，它除具有一般非淀粉多糖（NSP）酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外；近来很多研究表明，β-甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，因为它可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率。实际使用中还可看出，添加了β-甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。 NSP的其中一种组分是β-甘露聚糖（半乳甘露聚糖），其在豆粕中的含量高于其它常用的饲料原料。β-甘露聚糖除了消化率低之外，还对家禽具有多方面负面的生理影响。研究表明，即使是低浓度的β-甘露聚糖也可通过干扰胰岛素分泌和胰岛素样生长因子（IGF）生成而降低从肠道中吸收葡萄糖的速率和碳水化合物的代谢过程（Nunes和Malmlof,1992）。其它负面影响包括降低氮存留量、脂肪吸收率和氨基酸摄入量以及减少水的吸收而导致排泄物水分过多（Kratzer等，1967）。 -甘露聚糖在畜禽肠道细胞发育不完全，或在应激环境下，会过度刺激免疫反应，造成对生长性能的的伤害，引起不良免疫反应，摄食量下降，生长更加迟缓，造成体重轻的数量增加，群体均匀度变差。 表1 常见原料的β-甘露聚糖含量 β-甘露聚糖酶作用特点： ◆β-甘露聚糖酶是一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。 ◆消除饲料中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高豆粕的能量消化率，能给玉米豆粕型日粮提高100-150kcal/kg的代谢能。 甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染。减少肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡均匀度。 ◆降低肠道粘度，促进能量、蛋白、纤维素的消化和吸收。
枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验要点
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 化学与生命科学学院 摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 实验材料和方法 一、实验材料： （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液 葡萄糖 1% Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2 若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液 玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 % MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0
微生物发酵培养基的优化方法
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
脂肪酶产生菌发酵条件的优化
绵阳师范学院 本科生毕业论文（设计） 题目脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化专业生物技术 院部生命科学与技术学院 学号0811420218 姓名杜长蔓 指导教师李俊刚 答辩时间2012年5月 论文工作时间：2011 年7 月至2012 年5 月
脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化 学生：杜长蔓 指导老师：李俊刚 摘要：本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌 M-6-2的生长动力学和产酶动力学进行了研究；通过单因素实验和正交试验，对脂肪酶产生菌M-6-2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化，得出较佳的产酶培养基组成配方为：1.5%淀粉+0.5%酵母膏为碳源、4.5%豆饼粉 +1.5%硝酸铵为最佳的氮源、0.05%磷酸氢二钠和0.15%硫酸镁；最优的发酵条件为：初始pH7.5，接种量1.5 %，装液量20ml/250ml，发酵温度35℃，在转速180r/min 下，培养16h，经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15.60 U/ml,较优化前提高了49.57%。脂肪酶产生菌M-6-2与国内文献报道的产脂肪酶细菌相比产酶活力高。对该菌株发酵条件进行优化后，为生产性试验打下了基础。 关键词：脂肪酶产生菌M-6-2；脂肪酶；发酵条件；优化；正交试验；
Lipase to produce bacteria M-6-2 Optimization of fermentation conditions Undergraduate: Du Changman Supervisor: Li Jun Gang Abstract: In this paper, Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M-6-2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied; through single factor experiments and orthogonal test, the lipase to produce bacteria M-6-2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula: 1.5% starch and 0.5% yeast extract as carbon source, 4.5% of the soybean powder and 1.5% ammonium nitrate for the best source of nitrogen, 0.05% disodium hydrogen phosphate and 0.15% magnesium sulfate. Optimal fermentation conditions were: initial pH 7.5, 1.5% of the inoculum size, liquid volume 20ml/250ml, fermentation temperature 35 ° C, in the speed 180r/min next, cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49.57% to 15.60 U / ml, compared to before optimization. Lipase to produce bacteria M-6-2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production. Of the strain fermentation conditions optimized, laid the foundation for the production of test. Key words: Lipase producing strain M-6-2；lipase ；fermentation conditions； optimization ；orthogonal test
枯草芽孢杆菌的发酵
枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 姓名：姜霞
摘要 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等 关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数
甘露聚糖酶
Q/JCSW W 甘露聚糖酶 桂林精成生物科技有限公司发布
前言 本标准按GB/T 1.1- 2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》进行编写。 本产品适用于作饲料添加剂用。 本标准由桂林精成生物科技公司提出。 本标准起草单位：桂林精成生物科技公司。 本标主要起草人：李志双、王海珍、梁艳 本标准于2007年3月10日首次发布。
甘露聚糖酶 1 范围 本标准规定了饲用甘露聚糖酶的要求、试验方法、检验规则、以及标志、包装、运输、贮存、保质期。 本标准适用于本公司生产的作饲料添加剂用的甘露聚糖酶。 2 规范性引用文件 下列文件中的条文通过本标准中的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准大成协议的各方研究是否使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB／T 601 化学试剂滴定分析用标准溶液的制备 GB／T 602 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 5917 配合饲料粉碎粒度测定法 GB/T 6435 饲料水分的检测 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 10648 饲料标签 GB 13078 饲料卫生标准 GB/T 14699.1 饲料采样方法 GB/T 18823 饲料检测结果判定的允许误差 NY/T722 饲料用酶制剂通则 QB/T1803 工业酶制剂通用试验方法 国家质检总局[2005]75号令：定量包装商品计量管理办法 3 定义 3.1 甘露聚糖酶活力单位定义 在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1 mol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。 4 要求 4.1外观和性状 粉酶为浅黄色粉末状；颗粒酶为浅黄色均匀颗粒状。 4.2 水份含量：粉酶≤12.0% ；颗粒酶≤12.0% 4.3 粒度: 粉酶：95％以上通过孔径为420μm40目的分析筛； 颗粒酶：95％以上通过孔径为420μm 30-80目分析筛。 粗灰分：≤8% 4.4 产品成分分析保证值: 见表1
枯草杆菌生产_淀粉酶的研究
１０ 科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ ２０１０ ＮＯ．２９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ 研 究 报 告 科技创新导报α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。 目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。总产量上万吨。 近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。 本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产 α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。 １ 材料和方法 １．１实验材料 １．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。 １．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．２实验方法 １．２．１菌种激活 枯草芽孢杆菌在马铃薯固体培养基（简称ＰＤＡ）上３７℃培养１２ｈ后使用 １．２．２液体种子的制备 １００ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ马铃薯液体培养基（起始ＰＨ为自然ＰＨ），灭菌后接激活菌种悬液１．５ｍＬ，培养３６ｈ。 １．２．３发酵培养 在各淀粉液态培养基中加１．５ｍＬ液体种子，用电热恒温振荡培养箱培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。 １．２．４分析方法 酶活力测定，根据国家标准局发布的方法进行①。即１ｍＬ酶液于６０℃，ＰＨ４．８条件下，１小时液化１ｇ可溶性淀粉为１个活力单位。［①国家标准局颁布，ＧＢ８２７５－８７，１９８８－０２－０１实施］ ２ 实验结果与讨论 （１）培养温度对菌体生长和产酶的影响在不同温度下用电热恒温振荡培养箱（天津产ＳＨ６０００Ａ型）在２３℃至４４℃范围内培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），３６ｈ后测定α－淀粉酶活力。结果示于表１。菌体生长和产酶的最适温度均在３７℃。温度高于４４℃菌体生长和酶活力迅速下降。 （２）培养基对菌体生长和产酶的影响，同在最适温度３７℃下，相同的接种量、相同的种龄的枯草杆菌，比较不同比例的淀粉液体培养基产α－淀粉酶，结果见表２测定产α－淀粉酶的最适培养基为：淀粉∶水＝７５∶１００。 （３）培养时间对产酶的影响，在最适温度３７℃下，相同的接种量，淀粉与水的比例为：７５∶１００时１（最适产α－淀粉酶的淀粉液体培养基），测定枯草杆菌产α－淀粉酶最适培养时间为３６ｈ。 ３ 结论 α－淀粉酶是产量在，用途广的酶制剂 品种之一，我国目前枯草杆菌α－淀粉酶是主要品种之一，在行业应用具有重要价值。本实验采用枯草杆菌在淀粉液态培养基上产α－淀粉酶，其研究结果对以玉米或大米为主要原料的发酵造酒具有指导意义。１）在２３℃至４４℃范围内，振荡培养，起始ＰＨ为自然ＰＨ，产α－淀粉酶最适培养条件：培养温度３７℃。２）在温度３７℃下，用淀粉液体培养基发酵，当淀粉与水的比例为７５∶１００时，产α－淀粉酶酶活力最高。３）在最适温度３７℃，淀粉与水的比例为７５∶１００（即产酶最高的淀粉液体培养基）时，最佳培养时间为１２ｈ，此时α－淀粉酶活力最高。 参考文献 ［１］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验． 北京：高等教育出版社，２０００．［２］臧明玺，姜延程，李廷生．发酵助剂提高 枯草杆菌α－淀粉酶的活性研究．郑州粮食学院学报，１９９７． ［３］钟穗生等．枯草杆菌α－淀粉酶的活性 研究．太原工业大学学报，１９９７． 枯草杆菌生产α－淀粉酶的研究 哈申吐力古尔 （内蒙古通辽职业学院 通辽 ０２８０４５） 摘 要：以枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＦ７６５８）为实验菌株，以淀粉为主要原料，采用液态培养基摇瓶发酵，生产α－淀粉酶。结果表明：①在２３℃至４４℃内，培养基起始ＰＨ为自然ＰＨ，产酶最适培养温度为：３７℃②枯草杆菌在淀粉液态培养基中３７℃，振荡培养，其产酶最适淀粉水组成为：淀粉∶水＝７５∶１００；③在最适温度３７℃下，淀粉∶水＝７５∶１００时，最适培养时间为３６ｈ。关键词：α－淀粉酶 枯草杆菌 淀粉液体培养基中图分类号：Ｒ３１３文献标识 码：Ａ 文章编号：１６７４－０９８Ｘ（２０１０）１０（ｂ）－００１０－０１ 表１ 不同温度下所测糖度值 表２ 不同培养基对枯草杆菌产α－淀粉酶的影响
甘露聚糖酶的测定方法
甘露聚糖酶活性测定方法 一．原理 样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。 二．定义 一个甘露聚糖酶活性单位（MNU）被定义为：在测定条件下，1秒钟内从甘露聚糖中产生1 nmoL相应还原糖－甘露糖所需的酶量（1 MNU=1 nkat）。 三．适用范围与安全性 本方法适用于来源于木霉属（Trichoderma）的甘露聚糖酶样品的测定。当检测其它来源的酶活时，本测定方法的直线性需要校正。 本测定方法中的DNS试剂在吸入后，接触皮肤和眼睛，或被误服后，对人体有害。四．试剂与仪器 所有试剂溶液均用去离子水配制。 1. 柠檬酸缓冲液（0.05M,pH5.3） 溶解10.5 g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于800mL水中，并用1M氢氧化钠调节pH至5.3（消耗约110mL），再用水定容至1000mL。 2. 底物－0.3% 称取0.6 g刺槐豆胶（Sigma G-0753），溶于约80℃的柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌，加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。将不溶的沉淀物离心（1000rpm离心10min），并用柠檬酸缓冲液定容至200mL。将此底物溶液在-20℃下冰冻保存。临用前，将底物溶液在沸水浴中缓慢溶解至80℃左右后使用。 3. DNS试剂 溶解50.0 g3,5-二硝基水杨酸（Sigma D-0550）于4000mL水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0 g氢氧化钠，使之完全溶解，再继续磁力搅拌，分数次少量加入1500 g四水合酒石酸钾钠，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000mL。如果溶液不澄清，用Wheatman 1号滤纸过滤，然后室温保存于棕色瓶中。 4．仪器 恒温水浴锅50℃ 恒温水浴锅100℃ 试管旋涡磁力搅拌器 分光光度计 五．测定条件 底物半乳甘露聚糖 pH 5.3 温度50℃ 0.5℃ 保温时间5min 六．样品处理 用柠檬酸缓冲液稀释被检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。
枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法 注明：蓝色字体是已修改的 一、实验目的 1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法； 2、掌握测定酶活力的方法； 3、培养自行设计、实施实验的能力。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。 4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 三、实验材料 1、土壤样品 湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。 2、培养基 淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml 种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml
发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸 氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养 条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液 4、玻璃器皿 锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL） 10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备： 天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培 养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种 环等 四、实验步骤 1、样本采集 ①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。 ②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。在37℃摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。 在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。 3、初筛 将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到10-6，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。取出培养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。 4、划线分离 从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将于种子培养基上划线后，再将培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。 5、镜检 挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌
发酵工艺优化
发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！
_甘露聚糖酶的研究及应用进展
第24卷第6期2010年12月 白城师范学院学报 Journal of Baicheng Normal College Vol．24，No．6Dec．，2010 β－甘露聚糖酶的研究及应用进展 王兆淼 （白城师范学院生物系，吉林白城137000） 摘要：β－甘露聚糖酶是重要的饲用酶制剂之一，是一种新型饲料添加剂．应用于猪、 鸡、鸭和水产动物日粮，可提高饲料的利用效率，促进动物生长，减少养殖业环境污染等作用．作者从β－甘露聚糖酶的来源、作用机理、在生产中的应用等方面阐述了饲用β－甘露聚糖酶的研究及应用情况． 关键词：β－甘露聚糖酶；作用机理；应用 中图分类号：O629文献标识码：A 文章编号：1673-3118（2010）06-0064-03收稿日期：2010－10－08 作者简介：王兆淼（1981———），男，白城师范学院生物系助教，在读硕士，研究方向：动物营养与饲料学． β－甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究 的热点之一，也是近10年来在美国应用最广泛的饲用酶制剂之一．中国饲用甘露聚糖酶的研究始于2006年，是对玉米/豆粕型日粮最有效的饲用酶制剂，畜禽和鱼类的消化酶系不含β－甘露聚糖酶，添加β－甘露聚糖酶主要有促进动物生长，控制、预防动物疾病，提高动物的饲料转化效率；促进养分消化，改善动物肠道微生物生态，改善动物机体的健康状况；降低肠道内容物的黏稠度，减少粪便排泄，减轻环境污染；提高微量元素的生物利用率等作用．目前，β－甘露聚糖酶在北美和欧洲市场已得到广泛的应用． 1β－甘露聚糖酶的来源 β－甘露聚糖酶（endo －β－1， 4－mannanase ）属于半纤维素水解酶类，以内切方式降解β－1，4糖苷键，作用底物为甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳 甘露聚糖等，近来很多研究也表明，甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂．β－甘露聚糖酶来源广 泛， 包括植物、真菌、放线菌甚至软体动物，其中，微生物是产生β－甘露聚糖酶的主要来源，但哺乳动物体内不含此酶． 2 β－甘露聚糖酶的作用机理 2．1 去除β－甘露聚糖的抗营养作用 甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚 糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且在许多植物中大量积累，如玉米、小麦、菜籽粕及麦麸中含量占非淀粉多糖（NSP ）比例分别达12%、11%、20%和34%．特别是β－半乳甘露聚糖和β－葡甘露聚糖是所有豆科（如豆粕）植物细胞壁的组成成分，在豆粕中含量最高（15－18g /kg ）．它与其他非淀粉多糖围绕或缚住细胞中的养分（蛋白质、淀粉和脂肪等），动物的内源性消化酶难于消化这些细胞壁成分，从而降低了日粮的养分利用率．由于畜禽和鱼类的消化酶系中不含此酶，在饲料中添加β－甘露聚糖酶可水解β－甘露聚糖 高分子中的β－1，4糖苷键，释放出与之结合的养分、微量元素等，促进营养物质的消化和吸收，降低 肠道粘度，预防动物腹泻，同时促进畜禽生长，减少养殖污染． 2．2提高动物肠道粘膜的完整性 β－甘露聚糖酶可以直接作用于肠黏膜，切断肠上皮细胞与病原菌的结合点，即碳水化合物核心基座、 蛋白质和蛋白糖；又因－甘露聚糖酶的反应产物甘露寡糖，可以竞争性地与某些病原菌结合，从而减少了这些有害菌与肠粘膜上皮细胞的连接，进而减少了发病的几率，达到防病抗病和治病的目的． 4 6
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选
枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选 ========= （+++++农业与生物技术学院++ 111111） 摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。 关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。 引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口
[6]。本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1.材料与方法 1.1菌株：枯草芽孢杆菌 1.2材料与试剂 酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨 1.3仪器与设备 恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。 1.4 培养基 种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min； 发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。 1.5方法 1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响 1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL） 准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳