阿尔茨海默病患者脑脊液miRNA检测及初步分析
doi：10．3969／j．issn．1006-5725.2013.06.052
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：30970902）；广东省科技计划项目（编号：2010B031600018）；广州市科技计划项目（编号：2010Y1-C631）
作者单位：510370广州市精神病医院检验科（胡国艳，李萍，何柯新，徐鹏，刘学军），神经内科（罗新妮，钟笑梅，侯乐，宁玉萍）
通信作者：刘学军E-mail：tongchu8899＠sina．com ·检验与临床·
阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是老年人群中最常见的进行性神经退行性痴呆，在我国65岁以上人群中的发病率约为3％～5％，其主要的临床症状包括进行性记忆力减退，认知功能下降，精神行为异常等，致残率和致死率极高。随着人口老龄化的加剧，AD的患病人数呈上升趋势，给社会及家庭带来沉重的负担。β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）及微管蛋白（tau）的在脑部的异常沉积是AD的特征性病理改变，但目前认为AD为多因素影响的综合病症，由于其表现的复杂性，特异而且敏感度高的生物标记物有助于AD的早期诊断治疗及预后评估。
microRNA（miRNA）是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，miRNA的主要功能是调节内源性基因表达，参与细胞周期调控及个体发育过程［1－2］。在神经系统中miRNA调节不同发育阶段及不同部位的病生理条件下神经细胞的增殖、分化与凋亡，并对人类的认知和记忆能力的形成起重要作用。本研究利用高通量的miRNA芯片检测了AD患者与认知正常老年人脑脊液（cerebrospinal Fluid，CSF）中的miRNA，并用定量PCR方法进行了验证，发现了几种与AD密切相关的miRNA，使miRNA成为AD的生物学诊断标志成为可能。
阿尔茨海默病患者脑脊液miRNA检测及初步分析胡国艳李萍何柯新徐鹏罗新妮钟笑梅侯乐宁玉萍刘学军
摘要目的：分析AD患者特异性微小RNA（miRNA）表达谱，为深入研究miRNA与AD发生和发展的关系以及寻找新的AD分子标志物奠定基础。方法：利用miRNA芯片就10例AD患者和认知正常老年人脑脊液的miRNA表达谱进行检测和初步生物信息学分析，Real-Time PCR验证miRNA芯片检测结果。结果：miRNA芯片检测发现，在AD患者和认知正常老年人脑脊液中共有128个差异表达miRNA，其中63个上调，下调65个。另外，应用Real-Time PCR对miR-125b和miR-132这2个上调miRNA进行了验证，结果与芯片检测结果一致。结论：AD患者脑脊液具有特异性的miRNA表达谱，提示可能在miRNA表达环节找到新的AD分子标志物。
关键词微小RNA；阿尔茨海默病；脑脊液；基因芯片；Real-Time PCR
MicroRNA profiling in cerebrospinal fluid in patients with Alzheimer′s disease and preliminary analysis HU Guo-yan*，LI Ping，HE Ke-xin，XU Peng，LUO Xin-ni，ZHONG Xiao-mei，HOU Le，NING Yu-ping，LIU Xue-jun．*Department of Clinical Laboratory，Guangzhou Psychiatric Hospital，Guangzhou510370，China
Corresponding author：LIU Xue-jun E-mail：tongchu8899＠sina．com
【Abstract】Objective To determine the microRNA（miRNA）expression profile of in CSF in AD patients．Methods miRNA microarrays were performed to detect the expression profile of miRNAs in10cases of CSF in AD patients and the healthy control persons．Preliminary bioinformatic analysis was conducted．The microarray results were confirmed by real-time PCR assay．Results miRNA microarray results revealed that128miRNAs were dysregulated in AD patients and the corresponding healthy controls．Sixty-three miRNAs were significantly up-regulated，and65miRNAs were significantly down-regulated．Real-time PCR results demonstrated that up-regulation of miR-125b and miR-132was consistent with that based on microarray array．Conclusion Specific miRNA expression profile was determined in CSF in AD patients，and the differentially expressed miRNAs may be used as potential biomarkers of AD．
【Key words】microRNA；AD；Cerebrospinal fluid；Microarray；Real-time PCR
1材料与方法
1．1实验分组AD组为2008－2011年广州市精神病医院住院患者，共10例，均经简易精神状态量表（MMSE）筛查入组，符合DSM-Ⅳ痴呆诊断标准及NINCDS-ADRDA中“很可能的阿尔茨海默病”的诊断标准；排除血管性痴呆、其他神经系统疾病、其他系统和物质所致的痴呆或认知障碍，排除严重的躯体疾病。对照组为同期在广州市精神病医院公开招募的无认知障碍表现的老年人，共10例，无认知障碍主诉，经MMSE筛查入组，神经
系统体查正常，排除明显的肝、肾或内分泌疾病。受试者或其家属均签署书面知情同意书，并经广州市精神病医院伦理委员会批准立项。
1．2标本采集与保存行腰椎穿刺术，收集脑脊液约10mL。4℃离心机3000r／min离心脑脊液15min，使用聚乙烯管分装脑脊液上清液，储存于－80℃冰箱，实验处理时取出，避免反复冻融。1．3总RNA的提取取300μL脑脊液，加入1．2 mL Trizol LS（Invitrogen）溶液，迅速震荡摇匀30s，再加入200μL氯仿，强烈震荡20s后静置3min；4℃14000g离心10min，将上层水层移至另一个新的RNase free EP管（Axygen）；加入10μL SiO2吸附液，混匀，14000g离心5min；吸弃上清，加入75％乙醇400μL，14000g离心5min；吸弃上清，风干5min，加入20μL DEPC H2O溶解RNA。1．4基因芯片检测将提取的总RNA用miRCURYTM Hy3TM／Hy5TM Power标记试剂盒（Exiqon，Vedbaek，Denmark）进行荧光标记。经Hy3TM－标记的RNA与miRCURYTM LNA Array （v．18．0）（Exiqon）芯片进行杂交。使用Axon GenePix4000B芯片扫描仪（Axon Instruments，Foster City，CA）扫描芯片的荧光强度，GenePix Pro 6．0软件（Axon）对数据进行分析运算。miRNA芯片检测在上海康成生物工程有限公司完成。
1．5荧光定量PCR根据芯片结果分别设计引物序列（表1），以U6snRNA作为内参，对两组样本分别进行RT-PCR检测。
将提取的总RNA用Promega反转录试剂盒以如下反应体系进行RNA逆转录反应。5x buffer5．0μL、引物0．5μL、总RNA8．5μL、10mM dNTP （promega）2．0μL、RNase inhibitor（promega）0．5μL、M-MLV（promega）1．0μL至总体积20μL，混匀后42℃孵育60min；然后85℃孵育10min灭活逆转录酶。实时荧光定量PCR反应体系如下：cDNA5．0μL、上游引物和下游引物各0．5μL、2x SYBR Green PCR Master Mix10μL、ddH2O4．0μL，总体积20μL。反应条件如下：95℃5min；95℃15s，60℃15s，72℃32s，共40个循环。用－△△Ct计算miRNA的表达量。
2结果
2．1总RNA的检测将提取的细胞总RNA经紫外分光光度计测定，计算D260／280和D260／230，D260／280在1．6－1．8，D260／230在1．1－1．2，含量均在400ng以上，可以进行后续实验。
2．2基因芯片结果得到差异在1．5倍以上的miRNA有128条，其中与对照组相比，AD患者脑脊液中上调的miRNA有63条，下调的有65条。通过对筛选出的差异表达miRNA的信号比值进行聚类，可分为上调组和下调组（图1）。
2．3RT-PCR结果针对芯片结果中变化较为显著的部分miRNA，进行实时荧光定量PCR验证，其中AD患者脑脊液中miR-125b和miR-132明显上调，与芯片结果一致（图2）。
3讨论
近年来的研究表明，miRNA与肿瘤、心血管疾病、糖尿病、人类遗传性疾病甚至神经系统重大疾病的发生发展密切相关。存在于脑部的miRNA大约有20％～40％对脑的生长发育发挥着重要的调控作用［3］。目前有研究发现这些存在于脑内的miRNA直接参与了哺乳动物脑的发育，神经细胞分化以及突触的形成，一些miRNA还以与多聚核糖体结合的方式存在于神经元中［4－5］。它们在脑的生长发育过程中表达的组织特异性和阶段特异性，对脑的生长发育及形态功能维持等方面有着极其重要的调控作用。
已有多项研究表明，miRNA在细胞实验中能调节淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）的表达［6－8］及影响Aβ沉积［9］，在AD的转基因小鼠模型里也检测到miRNA对AD的影响［10－11］。目前有关miRNA在脑脊液中的研究少见报道，脑脊液中各种成分的改变能及时反映脑组织的病变情况，本研究通过生物芯片技术检测了部分AD患者引物
hsa-miR-125b F：
hsa-miR-107F：
hsa-miR-124F：
hsa-miR-132F：
hsa-miR-146a F：
miRNA R：
U6-F：
U6-R：
序列
5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTAACT-3′
5′-ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGG-3′
5′-ACACTCCAGCTGGGTAAGGCACGCGGTGAAT-3′
5′-ACACTCCAGCTGGGTAACAGTCTACAGCCATGG-3′
5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATG-3′
5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′
5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′
5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′
表1miRNA荧光定量RT-PCR引物
注：miRNA R为通用的下游引物
与认知正常的老年人脑脊液miRNA ，结果表明有多种miRNA 表达差异有显著性，采用定量RCR 进行部分验证后，证实其中几条与芯片结果一致。很多具有差异的miRNA 在以往均无相关研究报道，特别是差异较大的miR-4263、miR-155、miR-584、
miR-4765、miR-548x 、miR-4744等均尚无与AD 有关的研究，这些miRNA 在AD 发生发展中所起的
作用还需要进行进一步的研究。
CSF 直接与中枢神经系统相连，因此对CSF 的分析可以直接反映中枢神经系统的生化改变，是确切有效的体液标本，而且其取材方便，容易在临床推广，因此直接检测AD 患者脑脊液中异常表达的miRNA ，有望使miRNA 成为AD 辅助诊断的生物学标志，也为将miRNA 作为AD 的实验室辅助诊断和疗效观察指标以及作为AD 治疗的药物靶点提供了实验依据。
4
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（收稿：2012－12－12
编辑：吴淑金）
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］图1AD 患者与对照CSF miRNA
差异表达聚类图
图2AD 患者与对照CSF 中的miRNA 荧光定量RT-PCR
检测结果