褐藻羊栖菜水通道蛋白基因SFLIP的克隆及其在淡水浸泡下的表达分析

摘要褐藻羊栖菜对淡水浸泡有很强的耐受能力，利用此特性，养殖户们用淡水浸泡的方法清除沙蚕等敌害生物，而对羊栖菜幼苗则无不良影响，而藻类独特的水通道蛋白在其中可能扮演重要角色。通过克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，其包含678 bp的开放阅读框，编码225个氨基酸，sflip蛋白结构域预测表明其含有6个跨膜区域并且含有2个npa水通道特征性单元，但其中第二npa被npm取代；基因结构分析发现sflip基因含有5个内含子，与长囊水云的同源性很高；sflip基因在淡水浸泡过程中的表达先升后降，但随着时间延长则又显著上升。上述结果表明，sflip属于藻类中发现的一类新的水通道蛋白，其在羊栖菜耐受低渗胁迫中可能有种特殊的作用机制。

关键词羊栖菜；水通道蛋白；基因克隆；淡水胁迫；基因表达

中图分类号 q943.2 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2016）11-0228-04

水通道蛋白（aquaporins，aqps）是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异蛋白通道，属主要内在蛋白（major intrinsic proteins，mips）家族成员，除水分子外，aqps还能转运甘油、硼酸、二氧化碳、尿素和过氧化氢等多种小分子。高等植物中存在大量aqps基因，如拟南芥（arabidopsis thaliana，35个）[1]、水稻（oryza sativa，34个）[2-3]、玉米（zea mays，35个）[4]，根据亚细胞定位和转运能力的不同，主要分为pip（plasma membrane intrinsic protein）、tip（tonoplast intrinsic protein）、nip（nodulin-26 like intrinsic protein）、sip（small intrinsic proteins）和xip（x intrinsic proteins）等6类[5]。目前的研究较少关注低等植物――藻类的aqps，它们的数量明显少于高等植物，如长囊水云（ectocarpus siliculosus，3个）、三角褐指藻（phaedactylum tricornutum，5个）、假微型海链藻（thalass-iosira pseudonana，2个）等[6]。对高等植物而言，组织、器官高度分化，不同的膜、组织，甚至不同的外界条件及胁迫时间，都可能需要有不同的aqps，因此目前高等植物中发现庞大数量的aqps符合它们应对不同外界胁迫的要求；而藻类等低等植物，形态、结构和生活方式较简单，一般没有根、茎、叶的分化，它们体内aqps的数量就相对较少。另一方面，由于藻类与陆生高等植物在生长环境上存在巨大差异，藻类特别是海洋藻类中的aqps，在其应对渗透胁迫上的作用机制与高等植物也会有所区别。

本研究克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，分析了该基因的氨基酸序列特征、基因结构及其在淡水浸泡过程中的表达模式，并预测了其蛋白结构域。

1 材料与方法

1.1 试验材料

羊栖菜采集自温州市洞头县鹿西岛。收集后，用保温箱在2 h内将海藻运回实验室。接着马上用过滤过的天然海水洗涤藻体，在用淡水处理前将其置于20 ℃装有灭菌天然海水的高密度聚丙烯箱中暂养2 d，光周期为12 h∶12 h，并向培养基中通气，同时每天更换新鲜灭菌海水。

1.2 羊栖菜总rna提取和cdna合成

样品在液氮中研磨后采用ctab法提取总rna[10]，经dnase消化去除dna，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的浓度和完整性。cdna合成采用roche公司cdna合成试剂盒。

1.3 sflip编码区序列的扩增

以羊栖菜cdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip编码区外显子全序列。pcr反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华大基因公司测序。以羊栖菜gdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip基因组全序列。采用neb公司超保真pcr试剂盒。将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入

大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华大基因公司测序。

1.4 序列分析及比较

根据已知的cdna序列设计合适引物，获得sflip的基因组序列，继而对基因结构进行分析；通过protscal软件[11]预测分析sflip蛋白的疏水域；同时，用octopus[12]软件对aqps 蛋白拓扑结构进行预测。

1.5 羊栖菜基因的实时定量pcr分析

以正常盐度海水处理为对照和淡水处理时间为5、15、30、60、300 min的藻体cdna为模板，对sflip基因在淡水处理不同时间后的表达进行荧光实时定量pcr分析。荧光实时定量pcr试剂盒采用bio-rad公司的，pcr反应体系按照试剂盒说明书。以羊栖菜看家基因β-actin作为内参，利用bio-rad iq 5多重荧光定量pcr进行目标基因表达情况的分析。反应程序：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，54 ℃退火20 s，40个循环；65～95 ℃，每次上升0.5 ℃作溶解曲线。54 ℃收集荧光信号。每个样品重复3次，取其平均值。所用的基因特异引物参照表1。

2 结果与分析

2.1 sflip基因编码区序列

前期，在羊栖菜转录组数据中发现了一个可能编码aqp的基因，深入分析，发现其与藻类中发现的一类新的aqp――lip的序列同源性非常高[6]，因此将该基因命名为sflip。根据该序列设计特异性引物sflip1和sflip2，并以羊栖菜cdna为模板进行pcr扩增，测序后确认序列的同源性达100%，克隆获得的sflip基因编码区序列包含了678 bp的开放阅读框（orf），编码225个氨基酸（图1）。

为了解sflip基因的结构，以羊栖菜gdna为模板进行pcr扩增，测序结果发现，sflip 基因包含5个内含子，并且都符合gt-ag规则，所有内含子的碱基都以gt起始和ag终止，长度为507～1 894不等（图2）。

2.2 基因序列分析及结构域预测

经protparam软件分析，sflip蛋白分子量为24.03 kd，理论等电点为5.69，负电荷的氨基酸残基总数（asp+glu）为11，带正电荷的氨基酸残基总数（arg+lys）为10，不稳定系数（instability index，ⅱ）为21.24，是一类稳定的蛋白。

按照octopus对sflip跨膜结构的预测，该蛋白具有6个跨膜区，分别位于15―23、34―64、75―95、119―139、148―168和195―215氨基酸位置，有2个aqp家族成员高度保守的npa（天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸，asn-pro-ala）单元，分别位于58―60和174―176氨基酸位置，其中，第2个npa中的丙氨酸被甲硫氨酸替换（图3）。

2.3 sflip基因序列同源性分析

通过氨基酸序列比对显示（图4），羊栖菜sflip与其他藻类lip的同源性为长囊水云（ectocarpus siliculosus，cbj-27953）84%、微绿球藻（nannochloropsis gaditana，xp_005853 759）43%、三角褐指藻（phaeodactylum tricornutum，xp_0021 76929）34%、柱状脆杆藻（fragilariopsis cylindrus）33%、针尖杆藻（synedra acus，aeq27900.1）31%、假微型海链藻（thala-ssiosira pseudonana，xp_002287257）30%、大洋海链藻（thal-assiosira oceanic，ejk66519）30%、多列拟菱形藻（pseudo-nitzschia multiseries）29%以及褐潮藻（aureococcus anophage-fferens，xp_009034432）25%。对其氨基酸序列与其他藻类lip蛋白利用clustal x构建进化树（图5）。结果显示，10个藻类lip类aqp基因被聚为三大类群，其中sflip蛋白与长囊水云esmip聚为一类，亲缘关系最近。 2.4 sflip基因的表达特异性分析

为了检测羊栖菜淡水浸泡过程中sflip基因表达量的变化，以不同处理时间羊栖菜的cdna为模板，以羊栖菜看家基因β-actin作为内参，对sflip基因进行实时荧光定量pcr

分析。结果（图6）显示，在短时间内（5 min），与对照组相比，sflip基因的表达量迅速上升了1.29倍，之后呈下降趋势，淡水浸泡30 min后，sflip基因表达量恢复到浸泡前水平，而1 h后则降至对照的39%，但更长时间（5 h）的浸泡又使得sflip基因的表达量显著上调。表明sflip基因对淡水胁迫存在瞬时的应激反应，表达量迅速上调，随着胁迫时间的延长，该基因的表达受到显著抑制，表达量急剧下调，但更长时间的胁迫则又使得其表达量逐渐恢复并成倍上调表达，这可能与该基因所行使的功能有关。

3 结论与讨论

aqps在植物应对渗透胁迫中起着重要作用，以往的研究主要集中在高等植物身上，较少涉及藻类，而藻类、特别是潮间带的海洋藻类，由于其生活环境与陆生高等植物间存在巨大差异，既会经历各种高盐、脱水等高渗，也需经受雨水等低渗在内的极端环境的胁迫，因此藻类在应对外界环境胁迫的机制上应区别于高等植物，对于aqps同样如此，研究aqps有助于解析此类低等植物耐受渗透胁迫的应对机制。

aqps通常含有6个α螺旋跨膜结构（h1-h6），而每个α螺旋由20个左右氨基酸组成，aqps的-nh和-cooh末端位于胞质侧，跨膜结构间由环连接，分为3个胞外环（a、c、e环）和2个胞内环（b、d环），其中b、e环各有一段高度保守的npa单元串联序列[13]。此外，特定的4个氨基酸，包括h2、h5各1个外加le环上2个，形成了一个特殊的ar/r（芳香类氨基酸/精氨酸）过滤结构，对aqps的底物特异性起到重要影响[14]。本研究获得的羊栖菜aqp与藻类中发现的一类新的aqps亚家族成员lips同源性极高，因此将其命名为sflip。lips 虽然在氨基酸序列上与sip非常接近，但在aqps家族中高度保守的特征性序列上却存在显著差异，其第2个npa单元中的丙氨酸被替换成了疏水性更强的甲硫氨酸，后者的侧链更长；同时，对于sflip结构域的预测则显示其与其他aqps的差异，特别是对于h1和h2的推测，不同软件（如octopus和thmm等）预测的结果存在不一致性，表明该区域的不确定性；此外，sflip在ar/r过滤结构上也与lips非常接近，由色氨酸、亮氨酸、脯氨酸和异亮氨酸组成。由上述几方面因素导致的对该类aqps底物特异性的影响有待于功能试验的验证，对lips底物特异性的探讨有可能为研究羊栖菜等藻类耐受低渗胁迫机制找个一个新的突破口。

羊栖菜sflip在基因结构上与长囊水云（ectocarpus sil-iculosus）的esmip非常相近（图2），两者都含有5个内含子，并且在各个内含子长度、所处位置及两侧碱基编码氨基酸上保守性都很高，上述结果符合羊栖菜与长囊水云亲缘关系相近、基因同源性高的特点。大多褐藻只能在咸水环境中生存，淡水来源的不到1%，而水云属就是其中之一，dittami等利用组学技术对既能在淡水也能在咸水中正常生长的淡水种水云进行了深入研究，结果表明水云存在应对渗透胁迫的特殊机制，其中淡水种水云在淡水和海水中培养时esmip基因的表达，前者几乎是后者的近20倍，而海水种水云则介于两者之间[15]。由此表明，lip很可能仍然是转运水分的通道蛋白，在淡水时，lip的大量表达使得细胞能及时排出多余水分，而在咸水中时，为了抑制水分的丧失，lip的表达量则迅速下调。