GS115毕赤酵母PEG感受态细胞

GS115毕赤酵母PEG感受态细胞
GS115毕赤酵母PEG感受态细胞

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GS115 毕赤酵母PEG感受态细胞

组成规格:

货号名称规格数量

GT2504 GS115酵母感受态细胞50ul 20支

GT2505 GS115酵母感受态细胞50ul 50支

GT2506 GS115酵母感受态细胞50ul 100支

为了满足广大科研工作者对大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和农杆菌等菌种感受态细胞的需求,华越洋现推出各种系列的感受态细胞供大家选择。

毕赤酵母感受态细胞试剂盒

1 介绍

本试剂盒包括酵母感受态细胞、Solution 1和Solution 2。其中酵母感受态细胞是用于转化的细胞,需-70度低温保存;Solution 1和Solution2为转化时使用的试剂,均为无菌,需-20度保存,使用时解冻即可。本酵母感受态细胞采用专利技术制备的感受态,有别于传统山梨醇制备的感受态细胞,并配有Solution 1和Solution 2,可直接用于热击法转化,而不需要使用电转仪和电击杯。本方法是电击法的替代方法,也避免了LiCl方法需要现制备感受细胞的繁琐。转化效率可以达到102-103cfu/ug线性化DNA,经本公司反复验证-80保存6个月不影响转化效率。

2 转化步骤

2.1 线性化质粒片段的制备

取过夜培养的质粒菌种3ml,使用质粒抽提试剂盒抽提质粒,最后溶解于50ul的TE或水中。将所有的质粒片段在200μl的体系中酶切线性化。用酚氯仿试剂去除蛋白并且浓度片段至20ul体系中(保证有100μg的质粒片段)。

2.2 转化

2.2.1直接加于冻结的酵母细胞中,以获得最大转化率;(注意加入至冻结的细胞中,而不是解冻的细胞中);

2.2.2. 加入后迅速放入37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;

2.2.

3. 取出离心管,加入1.5ml Solution 1,彻底混匀;(注意可以弹或移液器轻轻混合,不可用移液器剧烈来回混合也不可用涡旋振荡器) ;

2.2.4. 30℃水浴孵育1h;

2.2.5. 室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml Solution 2中;

2.2.6. 离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml Solution 2中;

2.2.7. 将所有转化液铺于选择性平板(例如MD板),于30℃孵育3~4天后,鉴定;

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3 注意事项

1.转化步骤1中DNA要加入至冻结的细胞中,注意不可解冻细胞后再加入DNA;

2.转化步骤2中混合样品是必需的;

3.转化步骤3中要充分混匀,但不可剧烈混合;

4.所有混合细胞均要轻柔;

感受态细胞的制备步骤和原理

实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37℃,180rpm培养过夜。 [让菌复苏,进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37℃250rpm大约小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10min,4000rpm4℃离心 10min,弃上清。(将所有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL100mmol/L冰冷CaCl2中,轻吹,4℃30min,4000rpm 离心5min弃上清。 [细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA),经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一

定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)]5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒,冰浴30 min受体菌:感受态细胞100uL,加入2 uL无菌双蒸水阴性对照:LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 [第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性;第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶液和pET-21a质粒未被污染。] [冰浴是为了降低细胞代谢率,防止细胞大量死亡。] 7热激42度,90s 【在低温处理后,热激,可以使细胞壁热胀冷缩,再低温,使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】 8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB,37℃复苏1h 【用LB复苏细胞,使细胞恢复活力,从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因,只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生 素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mLCarbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板,将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜,出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落,而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落,这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效,长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解,所以可以降低卫星菌落的数量。

JM109,DH5a,BL21等感受态细菌特点及应用

1:DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛 选鉴别重组菌株。 基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1 2:BL21(DE3) 菌株 BL21菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21 的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT, hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3) 3:BL21(DE3) pLysS菌株 BL21(DE3) pLysS菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。PLysS含有 表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋 白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLysS ,Camr 4:JM109菌株 JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α -互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株 基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac -proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15] 5:TOP10菌株 TOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型:F- ,mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC),φ80,lacZΔM15,△lacⅩ74,recA1 ,araΔ139Δ(ara-leu)7697, galU,galK ,rps, (Strr) endA1, nupG 6:HB101菌株 HB101菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验 基因型:supE44,hsdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1

酵母表达系统使用心得

Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点,其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知,并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高,但是在实际操作中,并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题,收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学(Georgetown University)Lombardi癌症中心(Lombardi Cancer Center),部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点: 1.属于真核表达系统,具有一定的蛋白质翻译后加工,有利于真核蛋白的表达; 2.AOX强效启动子,外源基因产物表达量高,表达产物可以达到每升数克的水平; 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,远较真核系 统简单,非常适合大规模工业化生产; 4.可以诱导表达,也可以分泌表达,便于产物纯化; 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物,部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源,生产成本低。 产品性能:优点——使用简单,表达量高,His-tag便于纯化;缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种,一方面由于其是属于真核生物,因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰,另一方面毕赤酵母生长速度快,可以将表达的蛋白分泌到培养基中,方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点(MCR)3'端带有his-tag和c-myc epitopes,这些tag有利于常规检测和纯化,而且在MCR5'端引入了alpha factor(α-factor)用以分泌表达,并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候,如果你选择的是EcoRI,那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记,而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang:pPICZ系列有许多克隆位点可供选择,同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄:有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列?pPIC9K属于穿梭质粒,也可以在原核表达,而pPICZ系列比较容易操作,大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选(PIC9K操作麻烦一点,大肠用amp抗性,而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆,在利用G418筛选多拷贝),而且对于大小合适(30—50KD)的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie:要做毕赤酵母表达实验,首先当然就要了解这个可爱的酵母了(椭圆形,肥嘟嘟的,十分可爱),她和大肠杆菌长得有较大区别(大肠杆菌是杆状的),因此在培养的过程中要区别这两种菌体,除了气味,浓度,颜色以外,也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧,表达过程中染菌(我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌,那真是一段可怕的经历),如果在不知情的情况下继续做下去,那可以就是浪费大把的

感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备 制备感受态常用的方法是电击法和CaC2制备法,以下介绍 CaC2制备法: 1、可以从-80 C冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外的超净台中,用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于 Rocetta 含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性的平板,后面的都是如此)上划线,并将菌种迅速放回 -80 C保存,在划线板上做好相应标记, 于37 C培养过夜。 2、从37 C培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于 2mlEP管中,37 C, 220rpm 震荡培养约 6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以 1:100 的比例接种于 50ml LB 液体培养基( 2瓶)中,37 C 振荡培养2.5小时至OD600=0.5 。 注意:接种比例不得大于 1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管(50ml )中,在冰上放置5~10min ;注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4C 5000g 离心 5 分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀, 4C 5000g 离心 5 分钟; Note :此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5 、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-1 5%甘油混合溶液, 轻吹散,冰浴 5分钟, 4C5000g 离心 5 分钟; 6、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-15%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞 悬液。分装成50~100卩l的小份,贮存于-70 C可保存半年。 含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl 2制备方法 : 称取0.28g CaCL(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。 感受态细胞的特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源 DNA 的状态。感受态细胞的特征:(1 )细胞表面暴露出一些可接受外来 DNA 的位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞的接 受位点充分暴露)。(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNA 直接穿过质膜进入细胞)。( 3 )受体细胞的修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入的 DNA 分子不易被切除或破坏。 实验室常用的感受态细胞 1. DH5 a菌株

大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心,弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散) 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟

2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数,应该在3以上) 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液

常用几种感受态区别

常用大肠杆菌感受态JM109,DH5a,BL21的区别 1:DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1 2:BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT, hsdS(rBB-mB-),gal, dcm(DE3) 3:BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT hsdS(rBB-mB-),gal, dcm(DE3,pLysS ,Camr 4:JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株 基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15] 5:TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型:F- ,mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC),φ80 ,lacZΔM15,△lacⅩ74,recA1 ,araΔ139Δ(ara-leu)7697, galU ,galK ,rps, (Strr) endA1, nupG 6:HB101菌株 该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验 基因型:supE44,hsdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1 7:M110或 SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶,前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基,后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm,从而受到甲基化的影

毕赤酵母实验操作手册簿

毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而,许多蛋白质在翻译后,需经过翻译后的修饰加工,如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制,不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外,蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构,在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠,是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化,但不利于产物的活性,为了得到有活性的蛋白,就需要进行变性溶解及复性等操作,这一过程比较繁琐,同时增加了成本。 与大肠杆菌相比,酵母是低等真核生物,具有细胞生长快,易于培养,遗传操作简单等原核生物的特点,又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工,修饰,合理的空间折叠等功能,非常有利于真核基因的表达,能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统,当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的,其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物,不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力,其产物往住形成没有活性的包涵体,需要经过变性、复性等处理,才能应用。近年来,以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视,主更是因为酵母是单细胞真核生物,不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点,还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能,避免了产物活性低,包涵体变性、复性等等间题[1]。 与大肠杆菌相比,酵母是单细胞真核生物,具有比较完备的基因表达调控机制

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。 4、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。 7、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时,可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验,也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化,活细胞数务必少于108个细胞/mL,对于大多散大脑杆菌来说,这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高,可每隔15-20 min测定OD600值来监测,用监测的时间及OD值列一个图表,以便预测培养物的OD600值到0.4的时间,当OD600值达到0.35时,收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间,OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大,因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值,并

毕赤酵母发酵手册

毕赤酵母发酵手册 总览 简介: 毕赤酵母和酿酒酵母很相似,都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度, 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多,所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数: 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参

设备推荐: 下面是所推荐设备的清单: ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温,尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水(5-10℃)。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气(不锈钢的发酵罐需要1-2vvm)或者纯氧(玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm)。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备: 你需要准确配置下列溶液: ·发酵所需的基本盐类(第11页) ·PTM1补充盐类(第11页) ·75ml的50%的甘油每升初始发酵液,12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100%的甲醇每升初始发酵液,12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定: 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。

溶氧的测定: 简介: 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例,溶氧100%是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气,减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气,减少溶氧的程度。然而,因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气,所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平(>20%)来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此,精确校正您的发酵设备非常重要,请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持: 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率(OTR)将溶氧浓度维持在20%,特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中,通气一般约为0.1-0.3vvm(1L发酵液每分钟1L氧气)来提供氧气使DO保持在20%。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时,氧气可达到足够的水平,这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中,压力可增加OTR(与K L a 有关)。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气,甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大,发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说,可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处: 在毕赤酵母生长阶段,消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长,都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制,代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子,确定碳源是否受抑制就非常重要。例如:DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽,其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇(>1-2%vvm)可能会产生毒害。 DO的调控: 如果碳源受到抑制,关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低,DO值会上升。终止碳源的添加,观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10%。如果延迟时间很短(<1min),说明碳源受抑制。

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备 标签: tr..,Ca..,co.. 分类:细胞技术> 感受态细胞 来源: 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (R-,M-),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 ?1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落,接种于3~5ml LB液 体培养中,37℃振荡培养至对数生长期(12h左右); ? 2、将该菌悬液以1:100~1:50转接于100ml LB液体培养基中,37℃振 荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30min测一次OD600,至OD600为0.3~0.5时停止培养,并转装到1.5 mL离心管中; ? 3、培养物于冰上放置20min; ? 4、 0~4℃,4000g离心10min,弃去上清液,加入1 mL冰冷的 0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞, 冰浴20分钟; ?5、0~4℃, 4000g离心10min,倒净上清培养液,再用1.0 mL冰冷的 0.1mo1/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰浴20min; ? 6、 0~4℃, 4000g离心10min,弃去上清液,加入100 μL冰冷的 0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后,即制成了感 受态细胞悬液; ? 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验,如果在4℃放置 12~24h,其转化效率可以增高4~6倍;也可加入占总体积15%左右 高压灭菌过的甘油,混匀后分装于1.5ml离心管中,置于-70℃条件下, 可保存半年至一年。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5α或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜(约16小时); 2 .取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时(250-300rpm); 3 .将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;以下步骤需在超净工作台和冰上 操作; 4 .吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟; 5 .4℃下3000 g冷冻离心5分钟; 6 .弃去上清,加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动 打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟; 7 . 4℃下3000 g冷冻离心5分钟; 8 .弃去上清,加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动 打匀,使细胞重新悬浮; 9 .细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后超 低温冷冻贮存备用(-70℃)。 注意事项 1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使 用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml); 2 .所有操作均应在无菌条件和冰上进行; 3 .经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的 推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的); 4 .化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 (如Mn 2+或Co 2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000倍); 5 .所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率; 6 .质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的DNA; 7 .一定范围内,转化效率与外源DNA的浓度呈正比;

TOP10 感受态细胞使用说明书

全国免费电话:400-818-1148 TOP10 感受态细胞 Cat. No. JH0102-3 保存:-80℃ 组分说明 产品简介 本产品是大肠杆菌 TOP10 菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞,可用于 DNA 的热击转化。TOP10 是一种常用于质粒克隆的菌株,其 φ80lacZΔM15 基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补,可用于蓝白斑筛选。使用 pUC19质粒检测,转化效率可达 108,适用于高效的质粒 DNA 克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。 注意事项 1.转化所有步骤均在无菌条件下操作。 2.感受态细胞应在-80℃下保存,不可多次冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。 3.包装中有0.1 ng/μl 的pUC19DNA ,供对照试验使用。 操作步骤 1.取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl ,可以根据实际情况分装使用。 以下实验以100 μl 感受态细胞为例。 2.待感受态细胞融化后,向感受态细胞悬液中加入目的DNA (根据实际情况加入适量的DNA ,通常100 μl 感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和),用移液器轻轻吹打混匀,冰浴30分钟。 3.42℃热击90秒,迅速将离心管转移到冰浴中,冰上静置2-3分钟。 4.向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃摇床,150 rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。 5.取100 μl 已转化的感受态细胞,加到含相应抗生素的SOC 或LB 固体琼脂培养基上,用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开,直至干燥,倒置平板,37℃培养12-16小时。 注意:1) 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多,可取少量转化产物涂布平板;若转化的DNA 总量较少,可取200-300 μl 转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少,可通过离心(4,000 rpm ,2分钟)后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于平板中。 2) 新制备的固体培养基不易涂干,可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。 3) 涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少,可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。 Cat. No. JH0102-3 Kit Size 10×100 μl TOP10 感受态细胞 10×100 μl Control DNA pUC19,0.1 ng/μl 10 μl

毕赤酵母表达实验手册

xx酵母表达实验手册 (作参考) 部分试剂中英文名称: 小牛肠碱性磷酸酶(CIP)、AOX1(alcohol oxidase,醇氧化酶) 10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基) 500*B( 0.02%生物素Biotin)、100*H( 0.4%Histidine组氨酸) 10*D(20%Dextrose葡萄糖)、10*M(5%Methanol甲醇) 10*GY(10%Glycerol甘油)、100*AA( 0.5% of each Amino Acid,各种氨基酸)、1M磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer,pH 6.0) Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer) YEPDM(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Minimal Glycerol Medium(最小甘油培养基) YPD培养基的配制: 每(L)液体预混合物(50g/L)终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注:

配制YPD培养基时,20%(10×)葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌(在灭菌后再加入到其他各种成分),以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖(SD)培养基} 每(L)液体预混合物(50g/L)终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%(NH 4) 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注: 这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌,但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基(见下文提到的CM省却成分培养基)。 完全极限(CM)省却成分培养基(每L中含): 省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g (NH 4)

感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备及各种 感受态的特点 Company Document number:WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法,以下介绍CaCl2制备法: 1、可以从-80℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外的超净台中,用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性的平板,后面的都是如此)上划线,并将菌种迅速放回-80℃保存,在划线板上做好相应标记,于37℃培养过夜。 2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,37℃, 220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:100的比例接种于 50ml LB液体培养基(2瓶)中,37℃振荡培养小时至OD600=。 注意:接种比例不得大于1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管(50ml)中,在冰上放置 5~10min; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4℃ 5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀,4℃ 5000g离心5分钟;Note:此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5000g 离心5分钟; 6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 含15%甘油的L CaCl2制备方法: 称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37℃,180rpm培养过夜。 [让菌复苏,进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37℃250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变 GAGGAGAGGAFFFFAFAF

异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10min,4000rpm 4℃离心10min,弃上清。(将所有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中,轻吹,4℃30min,4000rpm离心5min弃上清。 [ 细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA),经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。(一定要轻吹,这时细 胞壁打开,十分脆弱)] GAGGAGAGGAFFFFAFAF

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册 作者:Jnuxz 来源:丁香园时间:2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而,许多蛋白质在翻译后,需经过翻译后的修饰加工,如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制,不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外,蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构,在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠,是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化,但不利于产物的活性,为了得到有活性的蛋白,就需要进行变性溶解及复性等操作,这一过程比较繁琐,同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统,当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的,其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物,不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力,其产物往住形成没有活性的包涵体,需要经过变性、复性等处理,才能应用。近年来,以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视,原因是与大肠杆菌相比,酵母是低等真核生物,除了具有细胞生长快,易于培养,遗传操作简单等原核生物的特点外,又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工,修饰,合理的空间折叠等功能,非常有利于真核基因的表达,能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。[1]。 同时与大肠杆菌相比,作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)在分子遗传学方面被人们的认识最早,也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因[2],随后又有一系列外源基因在该系统得到表达[3、4、5、6]。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用,当利用酿酒酵母制备时,实验室的结果很令人鼓舞,但由实验室扩展到工业规模时,其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失[7、8],质粒变得不稳定,拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素,因此拷贝数下降,也直接导致外源基因表达量的下降。同时,实验室用培养基成分复杂且昂贵,当采用工业规模能够接受的培养基时,导致了产量的下降[9]。为克服酿酒酵母的局限,1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)为代表的第二代酵母表达系统[10]。 甲基营养型酵母包括:Pichia、Candida等.以Pichia.pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细 胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能 获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细 胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37C, 180rpm培养过夜。[让菌复苏, 进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37C 250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变异。] 3取培养物置于40m L的灭菌离心管中,冰浴10min , 4000rpm 4C离心10min,弃上清。(将所 有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2中,轻吹,4 C 30min , 4000rpm离心5min弃上 [细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基 -钙磷 酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA ),经短时 间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。 (一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒,冰浴30 min受体菌:感受态细胞100uL, 加入2 uL 无菌双蒸水阴性对照:0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 [第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性;第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶 液和pET-21a质粒未被污染。][冰浴是为了降低细胞代谢率,防止细胞大量死亡。] 7热激42度,90s 【在低温处理后,热激,可以使细胞壁热胀冷缩,再低温,使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB, 37 C复苏1h 【用LB复苏细胞,使细胞恢复活力,从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因,只有这样才能使 转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(短节西林)的LB培养基上铺平板,将平皿放置 37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜,出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落,而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落,这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效,长出了转化为成功的菌 落。用短节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解,所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活,所以应等到LB600C时(热而不烫),加入抗生素。】

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