生物技术专业毕业论文
毕业论文
题目：西伯利亚蝗基因组DNA不同
提取方法的研究
姓名：
专业：生物技术
班级：
院（系）：生命与环境科学学院生物系指导老师：
新疆师范大学
目录
中文摘要 (3)
英文摘要 (4)
引言 (5)
1 材料与方法 (6)
1.1 实验材料 (6)
1.2主要试剂 (6)
1.3主要仪器 (6)
1.4研究方法 (7)
1.4.1 SDS-蛋白酶K消化法 (7)
1.4.2饱和NaCl法 (8)
1.4.3 CTAB法 (9)
1.5电泳及结果记录 (10)
2结果与分析 (10)
2.1总DNA的提取结果 (10)
2.2结果与分析 (12)
3 讨论 (13)
3.1三种不同DNA提取方法的比较 (13)
3.2实验结果不理想的原因分析 (14)
参考文献 (15)
西伯利亚蝗基因组DNA不同提取方法的研究
（新疆师范大学生命与环境科学学院乌鲁木齐830054）
摘要：本实验以新疆草原蝗虫的主要危害种类——西伯利亚蝗为研究对象，分别对干制和乙醇浸泡的标本用SDS法、饱和NaCl法和CTAB法进行了基因组DNA的提取比较。实验结果表明，SDS法提取的总DNA带型整齐，饱和NaCl法和CTAB法提取的标本总DNA 获得率较低，在琼脂糖凝胶电泳检测中大部分有明显降解。另外，乙醇浸制的标本总DNA 的获得率及质量均高于干标本。研究结果可为今后进一步开展蝗科亲缘关系分析、基因组比较和遗传多态性等分子生物学研究提供基础资料。
关键词：基因组DNA , 不同方法, 西伯利亚蝗
Studies on different extraction methods of Gomphocerus sibiricus genomic DNA
（College of Life and environment sciences ,Xinjiang Normal university, urumqi 830054）
Abstract:The experiments in Xinjiang grassland locusts main types of hazards Gomphocerus sibiricus for research, genome DNA of grasshoppers which were kept as dry sample or preserved in 100% ethanol was extracted using SDS method，Saturated NaCl law and the law CTAB extraction of DNA genome comparison.Experimental results showed ,SDS method brought from the total DNA, saturated Nacl law and the law CTAB extraction of total DNA in specimens of the lower rate in most Agarose gel electrophoresis testing marked degradation. In addition, ethanol college system overall DNA specimens obtained were higher than the rate and quality of the dry specimens. The results will further their relatives for Acrididae future analysis, genome comparison and genetic polymorphism, and other molecular biology research based information. Key words: genomic DNA extraction, different extraction methods , Gomphocerus sibiricus
引言
蝗虫是农、牧、林业的主要害虫之一，有些种类甚至可造成毁灭性的灾害。因此，对蝗虫开展各方面研究都有很重要的意义[1]。为有效防治蝗虫灾害,必须正确识别蝗虫种类。有关蝗虫的分类研究已有很多报道[2],前人已采集了大量的标本,命名了大量的模式种,这些模式种构成了蝗虫系统分类的基础和框架,用分子生物学技术研究蝗虫分类和系统演化时,若能用到这些标本和模式种,可以极大地扩展蝗虫分类和系统演化的分子生物学研究范围,有助于建立正确和完善的分类体系,构建系统的发育树[3~5], 而提取高质量和高产量的基因组DNA 是进行各种PCR、Southern 杂交、构建cDNA 文库及其它一些分子生物学研究的基础和前提[6]。
在实际工作中, 由于很难直接用活标本进行实验,常常使用的是干制标本或浸泡标本。而若标本保存不当,细胞内DNA发生降解,则难以获得高质量的DNA模板,导致PCR扩增结果不稳定甚至无扩增产物出现,给实验工作者带来诸多不便[7]。因此，为开展蝗虫分子系统学研究，需要通过试验寻找一种快速、简便、高质量抽提蝗总DNA 的方法。
基因组DNA的应用十分广泛，提取方法在国内外亦有不少报道[8~11]，概括起来可分为两大类：（1）盐析提取法；（2）有机溶剂提取法[12]。本文分别用SDS-蛋白酶K消化法、饱和NaCl法、CTAB法三种不同的提取方法，综合其他各种昆虫基因组DNA提取方法的优点，对新疆草原的主要危害种类——西伯利亚蝗（Gomphocerus sibiricus）
干制标本和无水乙醇保存的标本进行了基因组DNA的提取方法的比较，为进一步开展蝗虫分类学研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验所用蝗虫标本见表1。
表1 研究样本来源及保存方式
Table 1 Research sources and the preservation of samples 种名采集地点采集时间保存方式
西伯利亚蝗新疆哈密 2005年6月干标本
西伯利亚蝗新疆哈密 2005年6月无水乙醇固定
1.2主要试剂：
(1)提取试剂：Tris（三羟甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二氨四乙酸）、
SDS（十二烷基硫酸钠）、蛋白酶K、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、RNA酶、β-巯基乙醇、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等。
(2)电泳试剂：琼脂糖、TBE、溴酚兰、蔗糖等。
1.3主要仪器：
台式冷冻高速离心机D-37520 德国
电子天平AL-204 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
座式自动蒸汽灭菌锅ZDX-35SBI 上海申安医疗器械厂
热空气消毒箱GRX-9203A 上海一恒科技有限公司
电热恒温水浴锅DZKW-S-8 北京光明医疗器械厂
超净工作台SW-CJ-IF 苏州安泰空气技术有限公司
冰箱BCD-208K/ACJN 青岛海尔股份有限公司
电泳仪DYY-2C 北京六一仪器厂
紫外分析仪WD-9403B 北京六一仪器厂
凝胶成像仪、移液枪等。
1.4研究方法：
1.4.1 SDS-蛋白酶K消化法[12~14]
(1)试剂及溶液
A液：Tris 0.05 mol/L、NaCl 0.1 mol/L、EDTA 0.1 mol/L
pH 7.0～8.0。
B液：5%的SDS
C液：2 mg/mL的蛋白酶K
（2）操作方法：
1）取样：将蝗虫干标本和无水乙醇浸制标本用无菌三蒸水冲洗2～3 次;用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水；弃去浸泡液,取蝗虫后足股节肌肉,剪碎材料于装有0.8 mL匀浆液（A液）的1.5 mL Eppendorf 管中。
2）研磨: 与离心管相匹配的玻璃棒将样品研磨至匀浆状。
3）加入0.1 mL的5％SDS和0.1 mL的2 mg/mL蛋白酶K。
4）水浴：37℃水浴1～3 h，直至混合液消化得很清亮为止。
5）酚抽提：在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒十次，切勿剧烈振荡，在台式高速离心机上6 000 r/min离心10 min,取上清液。
6）重复步骤5：直至水相与酚相的界面处看不到白色的蛋白质层为
止，取上清液。
7）氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提:上清液中加入等体积的氯仿∶异戊醇，上下缓慢颠倒十次，在台式高速离心机上8 000 r/min离心10 min,
取上清液；再次重复此步骤。
8）沉淀DNA：在上清液中加入2×体积的冷无水乙醇(预先置-20℃冰箱内)沉淀DNA．冰箱内放置10 min，12 000 r/min离心10 min, 弃上清液。
9）洗涤DNA：在留有沉淀的离心管中加入1 mL70%的冷乙醇洗涤DNA，在台式高速离心机上10 000 r/min离心5 min,倾去上清液。10）保存：自然干燥，加适量TE或无菌三蒸水溶解，于- 20℃保存备用。
1.4.2饱和NaCl法[9 ,15 ]
（1）试剂及溶液
浸泡液（TE）：10mmol/Ltris-HCl、200mmol/LEDTA、50mmol/L NaCl
pH8.0。
消化液：STE（0.1mol/L Nacl、10 mol/L Tris-HCl、1mmol/LEDTA pH 8.0、1 % SDS、200μg/ml Proteinase K。
蛋白酶K：2 mg/mL
饱和NaCl溶液、异丙醇、70%的乙醇。
（2）操作方法：
1)乙醇固定标本用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水;对干标本,用浸泡
液（TE）浸泡48 h 以上，弃去浸泡液TE,取蝗虫后足股节肌肉。
2) 剪碎材料,加400μl 消化液于55℃消化8～12 h以上，然后加蛋白
酶K（2 mg /mL），37℃继续消化1 h。
3）加300μl 饱和NaCl,涡旋30 s ,10000 r/min离心30 min 。
4）转移上清,等体积异丙醇沉淀DNA ,1000r/min离心15min,弃上清。5）用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，自然干燥，TE(pH 8.0) 溶解后,于- 20 ℃保存备用。
1.4.3 CTAB法[6 ,16 ]
（1）试剂及溶液
2×CTAB缓冲液：0.1 mol/LTris-HCl，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L
NaCl，0.2%β-巯基乙醇，0.05 mol/L CTAB(pH 8.3)。
CI溶液：氯仿：异戊醇＝24∶1、70%的乙醇。
（2）操作方法：
1）将蝗虫干标本和无水乙醇浸制标本用无菌三蒸水冲洗2～3 次;
用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水；弃去浸泡液,取蝗虫后足股节
肌肉，速置于EP管中研碎。
2）加入2×CTAB缓冲液300 μL，以65℃温育60 min。然后，12 000 r/min 离心15 s，上清液倾出。
3）将原离心管中的剩余组织中再加入200 μL的2×CTAB缓冲液中，轻轻打匀，65℃温育10 min后，10000r/min离心10 min，倾出上
清液与第一次收集的上清液混合。
4）用等体积的CI抽提一次，10 000 r/min离心10 min，取上清液。5）加入冰冷的异丙醇沉淀，8 000 r/min离心10 min。取沉淀，加70%
乙醇200 μL，洗涤DNA沉淀，8 000 r/min离心6 min，倾上清液。6）自然干燥，加适量TE或无菌三蒸水溶解，于- 20℃保存备用。1.5电泳及结果记录
琼脂糖凝胶电泳检测：
试剂：琼脂糖，溴化乙啶染色液（EB），
1×5TBE：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5mol/L的EDTA 20ml（pH
8.0），用三蒸水定容到1L，灭菌后贮存，稀释10倍后使用。Loading buffer：0.25%的溴酚兰、40%的蔗糖，用三蒸水配制保存。制胶：1、封好制胶槽并放置水平。
2、琼脂糖0.4g加40ml的1×0.5 TBE加热溶解透亮后摇匀。
3、待胶冷却至65℃时倒入制胶槽中厚度约5mm，插好梳子，
室温放置40min，待凝胶完全后小心的移去梳子。
4、将制胶槽放入电泳槽中，加入电泳缓冲液至淹没胶的表面。上样：取样品DNA 5μl 和2μl的溴酚兰混匀后用移液枪点入胶孔，注意加样前要混匀。
电泳：盖上电泳槽并通电，120V 恒压电泳40-60min。
染色: 将电泳好的琼脂糖凝胶放入EB中染色15min。
观察：放置在紫外分析仪上观察，然后用凝胶成像系统观察拍照。
2结果与分析
2.1总DNA的提取结果：
图1--图3为西伯利亚蝗虫基因组DNA 1%的琼脂糖凝胶电泳图。
Figure 1-- Figure 3 for Gomphocerus sibiricus genomic DNA of the 1% agarose gel electrophoresis testing plan.
图1 SDS-蛋白酶K消化法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月4日）
M：100bp标准分子量DNA 干制标本: 1-10：雌，10-20：雄；
乙醇浸泡标本：A- J：雌，K- T：雄。
M:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:1-10:female,
10-20:male; Ethanol soak specimens: A- J：female，K- T：male.
图2 饱和NaCl法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月9日）
M: 100bp标准分子量DNA 干制标本: 1-5，11，12，13为雌性，6- 10：雄；
乙醇浸泡标本: A- E：雌，F- K：雄。
M:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:1-5,11,12,13:female, 6-10:male; Ethanol soak specimens: A- E：female，K- F：male。
图3 CTAB法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月11日）
M: 100bp标准分子量DNA 干制标本: a-j:雌，k-t:雄;
乙醇浸泡标本：A-C: 雌, D-R:雄
M:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:a-j:female, k-t:male; Ethanol soak specimens: A- C：female，D- R：male。
2.2结果与分析
一般认为，电泳检测后，若样品DNA条带整齐、无拖尾，则说明DNA较完整，也无杂质。反之，则认为DNA样品有降解或混有杂质[14]。通过检测发现本实验的的部分样品有明显的DNA条带，但都有不同程度的降解。
从图1可以看出，用SDS-蛋白酶K消化法提取的总DNA部分在3000bp处有一亮带，基本无拖尾，说明提取的DNA大分子较为完整。饱和NaCl法提取的总DNA从图2可以看出，此方法提取的效果相对较差，DNA弥散较大,未出现单条浓带，抹迹现象严重，以至用此方法提取的基因组DNA都无法用以PCR扩增。用CTAB法提取的DNA从图3可以看出，干标本只有一个样品提出了明显的DNA条带，无水乙醇浸泡的标本提取的总DNA有亮带在3000bp
处,但大部分都有拖尾,且拖尾现象比较严重，说明DNA样品有降解或混有杂质。三种方法比较结果表明，SDS-蛋白酶K消化法提取的效果最好，CTAB法次之，饱和NaCl法效果较差。
用酒精浸泡标本和干标本进行基因组DNA 提取的结果表明,无水乙醇浸制的标本提取的总DNA的得率及质量均较高，用三种方法均能得到部分良好的基因组DNA。而对于干标本三种方法提取的结果都不是很好。
3 讨论
3.1三种不同DNA提取方法的比较
分子生物学技术从核酸水平对昆虫进行物种鉴别以及探讨物种的起源和进化,是现代生物分子系统学和生物分子进化的研究热点之一。有效的核酸提取方法是开展分子系统学研究的前提,不同生物的基因组DNA 的提取方法不尽相同,但主要的步骤是包括破膜释放DNA、抑制核酸酶和除去蛋白质与其它大分子等[6]。本研究采用的三种方法所得到的结果显示各有优缺点如下：
方法1：SDS-蛋白酶K消化法，由于蛋白酶K的加入，研磨省时省力，无须低温操作，提取的DNA的浓度、纯度较好，适用范围广。因此，该方法可以用于对模板DNA质量要求较高的分子研究中，但该方法成本较高，耗时长，酚等药品价格高且对人体有害;需要转移上清液多次,有机抽提多次, 此过程中DNA有较大损耗，且浪费材料，步骤繁琐。
方法2 ：饱和NaCl法，操作简单，成本低廉，且不用接触酚-
氯仿等腐蚀性试剂，省时、经济、适合小型昆虫基因组DNA的提取，但提出的DNA含有的杂质也较多，因而该方法可以用于对模板质量要求不高的分子实验中。
方法3 ：CTAB法，本方法有以下优点：（1）无需用酚抽提，省时，经济，又减少了有毒药品对实验人员的侵害；(2)适合小型昆虫基因组DNA的提取，其间仅转移上清液两次，有机抽提一次，DNA得率高；(3)本方法不需要严格的低温操作，其步骤均可在室温进行；(4)适合不同处理材料以及其它昆虫的基因组DNA提取，获得的DNA可以满足蝗虫分子系统学研究的需要。
不同的标本、同一标本的不同组织, 或不同保存方法的材料, 在提取DNA 时都会出现难以预料的问题。虽然目前已经发表了很多提取标本DNA 的方法, 但是迄今为止还没有一种通用的提取方法适用于所有的标本DNA 提取。因而，不同的标本应根据标本保存状态和不同的实验目的选取不同的提取方法, 才能保证研究的顺利进行[17]。
3.2实验结果不理想的原因分析
（1）因为气候原因未采到新鲜标本，干标本和乙醇固定的标本存放过久，DNA严重降解（DNA 的化学性质极不稳定, 可以通过
水解或氧化作用自发降解），提取效果没有新鲜标本好；（2）原料过少且研磨不够充分；
（3）在加药品的混匀或吹吸过程中，动作剧烈或所用的枪头过小造成了DNA片断的断裂；
（4）在SDS-蛋白酶K消化法中可能没有把蛋白质消化完全；（5）在SDS-蛋白酶K消化法和CTAB法过程中酚的三次抽提和氯仿已戊醇抽提中可能离心转速不够或时间不足，使上清液中还含有较多的杂质，影响了DNA的纯度。
此外,在基因组DNA的提取过程中，应尽量保证核酸一级结构的完整性，并最大限度地减少污染。为此，在实验过程中注意要简化操作步骤，缩短提取过程，避免使核酸处于高温，过酸或过碱的环境，以减少核酸变性降解等机会，同时在提取过程中注意实验技巧尽量减少化学及机械因素的影响。
虽然本次提取的结果不是很理想，但是有些样品的主带明显，而PCR扩增要求的模板DNA的质量不是很高，所以这些主带明显样品可以用来做PCR扩增，来进行更深一步的研究。本文比较了三种不同提取方法的优缺点，因此可以根据不同的实验条件和目的选择使用。当然随着分子生物学的快速发展，各种不同的DNA提取方法在不断的创新出现，相信这些方法在不断的优化后也可以提取到高质量的基因组DNA来满足更深层次研究的需要。
参考文献
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