PCR扩增失败的原因分析

PCR扩增失败的原因分析

2010-12-13 16:48:31| 分类：默认分类|字号订阅

PCR扩增失败原因分析，PCR产物电泳

2010-05-15 16:07

一模板质量问题：

1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。

2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。

3）为什么跑电泳会出现拖带呢？

1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关，其中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。

2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后，按1:50 或1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎么样。

二引物问题

1）样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利！

2）普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异带。

在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr，没关系的

三 Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。

tap酶种类

高特异性Taq酶

高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素

很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR 产物直接纯化）打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。此外，由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。

此外，热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，Taq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活Taq酶，进行PCR反应。另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTMTth DNA聚合酶，本身就具有逆转录酶活性，也可用作RT-PCR。

高保真Taq酶

下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR 保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真Taq酶具有3'到5'核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。目前市面上主要有两类产品，一类是混合型的高保真酶，将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶（用于提高扩增效率）混合起来，错配率在8-9 X10-6碱基/循环数。Clontech、LTI等公司都有此类产品。如果要求更高的保真度，就要选择单一型的高保真酶，如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，错配率5.7 X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及Proofreading

活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达2-4×10-6碱基/循环数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高GC含量、二级结构）及长片段的扩增，的确是这类酶中的佼佼者。

高耐热性Taq酶

对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性Taq 酶，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95℃半衰期近7小时，100℃近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。

超长片段扩增Taq酶

对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达

40kb。

关于复杂模板的扩增

对于模板结构复杂，如GC含量高（>60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。

关于条件的优化

现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如QIAGEN公司的缓冲体系，对温度和Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功率极高。但任何东西都不是万能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，优化调整。

以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的Taq酶。我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。

四.模板浓度过低。

五、.退火温度过高。有可能，可以做个梯度PCR试一下。

六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。

七、dNTP浓度

低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA （dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq 酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

八、PCR产物电泳

1.电泳图不清晰，可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。

marker都出问题说明是你的胶的问题，或者电泳操作的问题。

2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次

数过多引起。如下图：

其对策有：

①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

3.如何获得亮的电泳条带

PCR反应前5个循环可以降低退火温度5°，后面30-35个循环恢复正常退火温度。也可以以第一次PCR的产物作为二次PCR的模板。

常见问题

具

体情况

可能

的原因

处理办法备

注

测序常见问题分析

序列中出现N值的常见原因：

通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：

PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。在最后一个碱基A后，信号会迅速减弱。因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。

在序列的起始端有时会有一些N值。该种情况主要是有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器将无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。现在公司已采取了有效措施，序列起始区的信号已大为改善，有时几乎第一个碱基就可以正确读出，染料的干扰问题基本解决。但是客户提供的PCR引物用于测序时，有时会产生引物二聚体，对测序的起始区造成干扰。

在序列的3’端容易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基，但是，只有550bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp 的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值，这种情况下产生的N值是无法避免的。现在我们只承诺正常情况下每个测序反应至少读出500个碱基的有效序列。

测序模板本身含有杂和序列，该种情况主要发生在PCR产物直接测序上。由于PCR产物本身有突变或含有等位基因，就会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。可以很容易判断该种情况，那就是整个测序信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂和度不同N值可能有多有少。该种情况明显是客户的样品问题。通过将PCR产物克隆后进行测序，可以解决该种情况的N值问题。

由于模板质量问题或测序不好，所得的序列结果较差，也会产生许多N值。一般情况测序结果不好的，我们都会根据具体原因尽量加以解决。有些实在无法解决的也就没有办法了。

针对有N值的情况，我们一定要根据具体情况具体分析。很多情况下是客户自己的模板原因造成N值，在这种情况下我们没有必要为客户承担测序失败的损失。有许多情况下由于客户的原因造成的测序失败，我们至

少要让客户知道是客户本身的原因而不是我们的技术问题。

我为什么找不到我的PCR引物？

以下几种情况，我们将无法找到做PCR时的引物序列：

用PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。

PCR产物用T载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条链上找不到您的引物序列时，试图在互补链上寻找您的引物序列。

当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。

有时，质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。

我的基因序列与标准序列为什么有差别？

一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在PCR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

过短的PCR产物为什么不适于直接测序？

首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR 产物片段大于200bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于200bp长度。

其次，由于测序本身的限制，以一个100bp的PCR产物用于测序为例，去掉两个引物的序列大约40到50bp，再加上测序起始端的一些读不出的碱基，真正能够得到的有用序列不过30～40碱基。这么少的序列很难向客户收费。上面是在最理想的条件下的假设，稍不顺利，测序就失败了。因此，过短的PCR产物，只能克隆后进行测序。

用测序的方法检测点突变可靠吗？

有的客户想用测序的方法检测点突变体，我认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先，我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强渡一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。

与测序引物有关的问题：

对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：

简并引物，

简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。

随机引物，如RAPD引物，

随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合。

过长的引物，一般要求测序引物不大于24bp，最长不能超过30bp。

过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯度要在90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将

明显增大，直接影响到测序结果。

有特殊标记的引物，

该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标记基团将直接影响到DNA片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误。

不纯的引物：

测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。以一个20bp的测序引物为例，直接脱盐纯化的话，纯度至多在70%左右，也就是说将有30%的引物将作为背景噪音，这必将严重影响测序结果。一般经PAGE或OPC法纯化的引物基本能达到测序的要求。

造成测序反应模板量低主要有以下几种原因：

客户提供的PCR产物量太少，经纯化后不足以满足测序需要。

一些低拷贝的质粒按照常规方法提取，所得质粒很少，经浓缩后仍然很少。

客户提供的PCR产物或质粒的量很少是我们测序反应中经常遇到的一个问题。为解决该问题，我们在平时收客户模板的过程中需要注意如下事项：

质粒类型的测序模板尽量让客户提供菌液，不要直接提供质粒。菌液我们可以控制模板提取的量和质量。而且，所提供的质粒类型一般应为高拷贝的。以下几种质粒是我们测序成功率非常高的，包括pGEM-T载体，pUC 及其衍生载体等。

对于PCR类型的测序模板，未纯化的PCR产物要保证足够的量，一般我们要求客户提供50~100 uL的PCR扩增产物，并且要求PCR扩增的质量要高。有杂带的PCR扩增产物我们尽量不要收。对于纯化的PCR产物，要保证足够的量，通常要求客户对已纯化的PCR产物用电泳进行检测。一般来说，对于一个1kb长的纯化PCR产物进行测序，客户提供的PCR产物量不应低于200ng。另外，用分光光度法进行的PCR产物定量是极不可靠的。对于未纯化的PCR产物，提供的量应至少为已纯化的PCR产物的量的2倍。

另外，PCR产物测序客户需提供相应的PCR扩增引物用于测序。引物最好稀释成5 uM的浓度，总体积不低于20 uL。

最后一点是，我们应该明确，并不是所有的测序样品都能测出满意的序列。

根据我们的统计并参考其他公司的情况，一般会有10%到15%的序列是难以测出的。对于大部分未测出的序列，我们可以找到尽可能的原因，以建议客户下一步如何做