PCR引物设计软件primer Premier 5使用技巧

?PCR引物设计软件primer Premier 5.0 应用简介

?点击：434 作者：51protocol收集来源：日期：

2007-09-11 本站论坛

一. 引物设计的基本原则

引物长度（primer length）

产物长度（product length）

序列Tm值(melting temperature)

ΔG值(internal stability)

引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）

错误引发位点（false priming site）

引物及产物GC含量（composition）

1. 引物的长度

一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度2. 引物3’端的序列

引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高

引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败

3. 引物的GC含量

一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

4. 引物所对应模板序列的Tm值

最好在72℃左右

5. ΔG值(自由能) ，

反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低

6. 引物二聚体及发夹结构的能量

一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行

二. Primer Premier 5.0引物设计软件简介

Primer Premier 5.0用途：

引物分析评价功能；

引物的自动搜索功能

Premier的主要功能：