环介导等温扩增技术及在感染病诊断中的应用

[作者简介]　汪一帆(1984-),女,在读硕士,主要从事病原生物学研究。

3通讯联系人,E-mail:gchaotan@yahoo1com1cn 【综述】

环介导等温扩增技术及在感染病诊断中的应用

汪一帆,郭潮潭3

(浙江省医学科学院生物工程研究所,杭州　310013)

[关键词]　环介导等温扩增;感染病;检测

[中图分类号]　Q78 [文献标识码]　A [文章编号]　1004-8685(2008)09-1933-03

自古以来,感染一直威胁着人类健康与生命。近年来,经典传染性疾病的发病率有所下降,但艾滋病、传染性非典型肺炎、人类禽流感及人类猪链球菌感染等新发感染病成为新的公共卫生问题。病原微生物通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状。一些常规的病原微生物检测方法由于耗时费力、步骤繁琐等不足之处,已经愈来愈难以满足人类对致病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因而聚合酶链式反应技术(PCR)问世后得到了广泛应用。之后发展起来的荧光定量PCR分子诊断技术,更是具有实时监测、定量准确、反应速度快、重复性好等优点,但因价格昂贵该技术的普及受到限制。

2000年,Not om i等[1]开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即所谓的环介导等温扩增法(Loop-M ediated Is other mal Amp litlcati on,LAMP)。其利用一种链置换DNA聚合酶(B st DNA poly merase)和两对特殊的引物,特异地识别靶序列上的6个独立区域,在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断,也可以藉由添加SY BR Green I、溴化乙啶(E B)或其它核酸染剂进行呈色后观察。该技术由于特异性强,灵敏性高,仅需普通水浴锅或可得到稳定热源的设备就能快速、高效、简便地对病原微生物进行鉴定,因而具有推广性,可以作为相关人员常规的检测工具。

1　LAM P法的原理

111　引物的设计

引物设计是LAMP法实现扩增的关键所在。基于靶基因3′端的F3c,F2c和Flc区以及5′端的B1,B2和B3区这6个不同的位点设计4种引物(图1)。

F I P引物:正向内引物,由F2区段和F1c区段组成,F2区段与靶基因3′末端的F2c序列完全互补,F1c区段同靶基因3′末端F1c序列完全相同。

F3引物:正向外引物,由F3区段组成,与F2c前端F3c序列互补。

反向内引物B I P和反向外引物B3的设计与F I P引物及F3引物类似

。

图1　LAM P反应引物设计图

112　反应机制

DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。反应中链置换型DNA聚合酶,能使后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链,在其作用下,以F I P引物F2区段的3′末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动复制一条新链。F3引物与靶DNA的F3c序列杂交,又通过链置换型DNA聚合酶的作用,开始靶DNA互补链的合成,同时置换出F I P引物合成的DNA链。被置换出的DNA链在5′末端存在互补的F1c和F1区段,能发生自我碱基配对,形成环状结构。同时这条单链DNA,又可作为模板,在另一端结合B I P引物和B3引物合成一条双链,并置换出一条单链DNA。此时,被置换的单链DNA两端都存在互补序列,自我碱基配对后整条链呈现哑铃状结构,该结构是LAM P扩增循环的起始结构。在哑铃结构中,以3′末端的Fl区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。同时,F I P引物上的F2与环上的F2c杂交,启动新一轮链置换反应。其置换出的单链核酸也会形成环状结构,B I P引物上的B2与环状结构上存在的B2c杂交,启动又一轮扩增。反应终产物是花椰菜样的茎-环结构DNA组成的混合物,即由在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。

113　扩增产物分析

LAM P扩增产物可以像PCR反应一样利用凝胶电泳并结合成像系统进行检测。成像结果显示,LAM P反应会产生许多不同大小的条带,条带大小相差100bp左右,可以通过产生的不同梯型来区分特异性扩增和非特异性扩增。反应产物还可以用限制性酶进行消化来鉴定产物的结构和大小。另外,在LAMP的反应过程中,核酸大量合成时,从d NTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物(焦磷酸镁白色沉淀物)。

Mori等[2]研究了LAMP反应中焦磷酸镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系,发现两者生成量之间呈线性关系,并且焦磷酸镁沉淀在400n m处有吸收峰。因此,对于LAMP

产物的检测,不但可以直接通过肉眼观察反应中白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在,也可以通过实时监测沉淀的形成量推算出反应中DNA的合成量,进行定量检测。相比之下,常规PCR反应虽然也能产生焦磷酸盐或磷酸盐离子,但量比较小,只有不到011μmol/L,很难直接通过沉淀进行产物检测,往往需要荧光染料或酶来进行检测,而如果改变反应条件或者循环次数,又容易造成非特异扩增。

2　LAM P技术的发展

211　引物的改进

通过改进引物浓度能够提高扩增效率,缩短扩增时间。Naga m ine等[3]在反应中添加特异性环引物,使得扩增时间缩短到原来的一半,反应效率大大提高。环状引物也可通过与茎环结构杂交,启动链置换DNA的合成。这样,所有的茎环DNA或者与内引物杂交,或者与环状引物杂交,加快了反应速度。

212　单链DNA的分离

LAMP反应的终产物为茎-环结构DNA组成的混合物。虽然LAM P的产物能用于后续试验,如杂交试验,但是单链DNA的杂交效率要明显高于双链DNA,因而产物需经过核酸内切酶处理,使其变性。可见从LAM P的产物中分离出单链的靶序列对于LAMP的应用有重要意义。Naga m ine等[4]将LAMP的产物用Ts pR I酶消化,再利用一特殊的引物在断裂处和3′端杂交并延伸产生一条链特异性DNA,利于进行杂交检测,如DNA微列阵技术。反应中所用的DNA聚合酶和LAMP 反应时一样为链置换DNA聚合酶,其具有链置换活性,可置换出单链DNA。因为酶的最适温度都为65℃,所以整个反应可在恒定的温度下进行。

213　原位LAMP技术

荧光原位杂交技术应用于病原体的检测,可提供在自然环境中待测病原体的形态、所在细胞的大小及生理活性等信息。M aruya ma等[5]将LAMP技术和原位杂交结合,检测携带stx2基因(其中一种编码毒素的基因)的大肠杆菌O157:H7。用细胞原位固定法将大肠杆菌与无stx2特异基因的细菌混合物用不同荧光抗体标记,从而区别出携带特异性基因的大肠杆菌。这种方法,由于反应在等温条件下进行且温度较低,所以与原位PCR相比,减少了对细胞的破坏,有利于应用荧光抗体进行同步细胞鉴定。

3　LAM P法在感染性疾病诊断中的应用

LAMP因具有高特异性、高效率和快速反应的特点,可以大量扩增所需的靶序列,故被用于感染性疾病的诊断和病原体的检测。

311　病毒的检测

31111　DNA病毒　Not om i等[1]首先发明了用LAMP方法扩增HBV DNA,在45m in内即可将6拷贝的靶HBV基因扩增到可检出水平。而且相比PCR技术,其更能排除与扩增不相关基因的干扰。Suzuki等[6]采用LAM P法检测巨细胞病毒,检出限值为每管500拷贝。研究人员通过LAM P法和实时定量PCR法分别对180份来自造血干细胞移植接受者的全血样本中的巨细胞病毒DNA进行检测。若将每管500拷贝(在200μl的全血中大于5000拷贝)定义为巨细胞病毒感染阳性,则LAM P方法的灵敏性、特异性、阳性预测价值和阴性预测价值分别为80%、9819%、6617%和9914%。

31112　RNA病毒　在逆转录酶的作用下,可通过RT-LAMP 技术对RNA进行扩增。

Poon等[7]用RT-LAM P法来检测甲型流感病毒,检测灵敏度为10-3,较常规PCR的10-2要高,而且实验结果与常规病毒学诊断结果完全一致。用RT-LAM P法还可对流感病毒进行分型鉴定,通过设计不同的引物组,在3h内就能区分出甲1、甲3与乙型流感病毒,而且反应灵敏度比免疫层析法更高[8]。I m ai等[9]用RT-LAMP方法检测H5N1高致病性禽流感,检测灵敏度比一步法RT-PCR法高100倍。监测H5N1病毒在野生鸟类中的感染情况时,还在传染地区附近的死牛身上通过RT-LAMP法检测到两例阳性样本,其中有一例是被PT-PCR法漏检的。另外,用于检测野生鸟类H5亚型基因的RT-LAMP体系同样适用于人类咽拭子样本的检测[10]。由此可见,RT-LAM P法可以作为一种有效的诊断工具监测流感的暴发和流行。

诺瓦克病毒是引起非细菌性急性胃肠炎的重要病原体,该病毒貌似温和,但传染性强,极易引起暴发,并可以导致反复感染。Fukuda等[11]将诺瓦克病毒按基因型的不同被分为两个基因组(GI和GII),分别用含9条和13条不同特异性引物的混合引物通过RT-LAMP法检测GI和GII。实验发现检出限值分别为每管102拷贝和103拷贝,GI的检测灵敏度和特异性为100%和94%,GII的灵敏度和特异性都为100%。

目前还有将LAMP法应用于检测单纯疱疹病毒、麻疹病毒、登革热病毒、西尼罗病毒等的报道。

312　细菌的检测

I w a mot o等[12]根据gyr B基因序列针对结核分枝杆菌复合体、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的特异引物,用LA MP方法从痰标本中鉴定这三种分枝杆菌。反应物混合后经63℃孵育,即可通过在反应管中加入SY BR GreenⅠ进行检测。如果含有扩增产物,反应混合物由原来的橙色变为绿色。采用该方法从固体培养基中鉴定出特异的分枝杆菌属在35m in内即可完成。

沙门菌是自然界中的常在菌,因沙门菌病经粪口途径传播,故摄入污染了沙门菌的食物或饮料易引发其感染。Ohtsu2 ka等[13]的实验中,采用LAMP法时110个样本的沙门菌阳性检出率为100%,而用PCR法有10%的阳性样本漏检。

M ina m i等[14]通过将内窥镜刷检与LAMP技术结合对200名消化性溃疡患者进行幽门螺杆菌检测。LAMP反应的最低检出限值为100CF U,与刷检结合有123例患者确诊为幽门螺杆菌阳性。而LAMP与活检结合检出100例阳性,细菌培养法和刷检结合检出117例。该技术的应用还避免了活检后大出血现象,为幽门螺杆菌感染提供了一种有效、安全的诊断方法。

313　支原体的检测

Sait o等[15]通过LAM P法对肺炎支原体进行检测,经过60m in的反应,检出限值为200个拷贝,而实时定量PCR法为20个拷贝。两种方法的阳性样本检出率完全一致,结果的准确度经由限制性核酸内切酶A lu I酶切消化分析得到确认。314　真菌的检测

巴西副球孢子菌,是引起人体真菌病的一种热依赖的两型真菌。Endot等[16]利用LAM P方法对22株巴西副球孢子菌

的临床样本和7株分离自犰狳的样本进行检测。通过检测该菌的特异性基因gp43,在3h内可完成诊断工作。LAMP法还可从石蜡包埋的组织样本中抽提DNA为模板进行鉴定,在真菌的临床检测中很有应用前景。

315　寄生虫的检测

LAMP方法同样可用于寄生虫的检测。Poon等[17]以恶性疟原虫高度保守的核糖体18S RNA基因为靶基因设计特异性引物,对102例经标准显微镜方法诊断为恶性疟疾感染病人的热处理血液样本进行LAM P法检测。50μl的样本在99℃下处理10m in,吸取2μl的上清液可直接进行LAMP反应,既减少了实验花费,又缩短了检测时间。检测灵敏度和特异性与提取纯化血样中的DNA用PCR法检测的结果相似。

非洲锥体虫是一种在医学和农业上重要的原生动物寄生虫,可引起人类昏睡病。Kuboki等[18]根据LAM P技术原理,以布氏锥体虫PFR-A基因、刚果锥体虫的核醣体亚基P0基因为靶基因设计特异性引物进行检测。检测灵敏性是传统PCR 的100倍,且利用该方法检测脑脊髓液或血液样本中的布氏锥体虫,可避免PCR反应时由于血液样本中存在Taq酶抑制成分而干扰反应的现象。LAMP技术,因其高敏感性、高特异性和实验条件简便等原因,在经济不发达、设施较为简陋的地区也能得到广泛应用。

4　展望

人类与感染性疾病的斗争已进入了新的阶段。一些经典传染病卷土重来或以新的特点出现,新发传染病也在一定范围内引起了人们的惊慌。自然界存在的病原体随时有可能跨物种在人类中传播,日益频繁的国际交流更为此创造了有利条件。LAM P方法的出现很大程度上为致病微生物的及时鉴定提供了有效手段。其可以在等温条件下,快速、高效、高特异地扩增靶序列,原理虽然复杂,但研究人员或检测人员实际操作却很简便,不需要特殊的试剂和仪器设备,因此绝对可能建立起总成本低廉的检测体系。该方法在感染病学领域的研究和应用已有文献报道,但目前国内对这方面研究仍较少。要想全面掌握LAMP法,需从其反应条件,如引物设计、目的序列长度、茎环结构大小以及反应体系等进一步摸索和优化,提高扩增效率和特异性,扩大应用范围。随着LAMP技术的不断完善和改进,LAMP技术在感染病学科界有着更为广阔的发展前景。

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(收稿日期:2008-05-05)