微生物染色技术

简单染色法

革兰氏染色法

抗酸染色法

死菌鉴别染色法芽孢染色法

姬姆萨染色法

细菌染色法

活菌：美蓝或氧化三苯基四氮唑（TTC）

染料：

染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。染料通过离子键、共价键或疏水作用实现染色

常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：

美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；

酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。碱性染料带正电荷酸性染料带负电荷。

微生物染色原理：

在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。

细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。

染色种类:

简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

操作步骤

1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。

4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。

5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6．干燥

7．镜检

鉴别染色：使用两种以上的染料进行染色，以区分不同类群的细菌，如革兰氏染色。

革兰氏染色:

原理：G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。

用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。

不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。

操作步骤：

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤

1.制片（涂片干燥固定）

2.初染：加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染液染色1分钟；倾去染色液，用水小心地冲洗。

3.媒染：卢戈氏碘液，媒染1min；用水洗去碘液。

4.脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色10s-18s至流出液无色，立即水洗。

5.复染：滴加番红复染1min；10.水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。

6.镜检：将染好的涂片用吸水纸吸干，镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

革兰氏染色结果影响因素：

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。