胃癌细胞FoxP3的表达及其与外周血单个核细胞PBMCs的相互作用
复旦学报（
医学版）Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖ Ｊ Ｍｅｄ
Ｓｃｉ２０１３Ｍａｒ．，４０（２） 新疆维吾尔自治区科技支疆项目（
２００９９１１２７） △Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ａｕｔｈｏｒ Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙａｏｃｈｅｎ＠１６３．ｃｏｍ胃癌细胞ＦｏｘＰ３的表达及其与外周血
单个核细胞（ＰＢＭＣｓ
）的相互作用马桂芬 缪 青 刘以梅 陈世耀△
（复旦大学附属中山医院消化科 上海 ２０００３２
）【摘要】 目的 检测叉头样蛋白３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ３，ＦｏｘＰ３）在胃癌细胞中的表达分布，并探讨其在外周血单个核细胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣｓ）和胃癌细胞共培养过程中的作用。方法 应用免疫荧光技术检测ＦｏｘＰ３蛋白的表达定位；建立胃癌细胞和ＰＢＭＣｓ的体外共培养体系，然后用ＣＣＫ－８法检测共培养后胃癌细胞的生长抑制情况；通过Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ技术检测共培养后胃癌细胞和ＰＢＭＣｓ中ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ表达情况；并采用流式细胞技术和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ技术检测共培养后两种细胞中ＦｏｘＰ３蛋白表达情况。结果 ＦｏｘＰ３表达于胃癌细胞的胞质和胞核。胃癌细胞与ＰＢＭＣｓ共培养时能明显抑制胃癌细胞的增殖。直接和间接共培养后ＭＫＮ２８胃癌细胞的ＦｏｘＰ３蛋白的平均荧光强度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）均增加（Ｐ＝０．０３１；Ｐ＝０．０１５）；与单培养相比，来源于胃癌患者和健康对照组的淋巴细胞与胃癌细胞共培养后其ＦｏｘＰ３ＭＦＩ均明显增加（Ｐ＝０．０１６；Ｐ＝０．０３４），且ＩＬ－２能促进间接培养条件下ＰＢＭＣｓ的ＦｏｘＰ３表达（Ｐ＝０．０２４），而对直接共培养影响不大。共培养后胃癌细胞的ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ和蛋白表达均增加，直接共培养较间接共培养增加更明显（Ｐ＝０．０３５）。结论 胃癌细胞与ＰＢＭＣｓ的相互作用主要依赖细胞间的直接接触方式，ＦｏｘＰ３的表达变化在这一过程中发挥了重要作用，这可能跟肿瘤免疫逃逸有关。
【关键词】 叉头样蛋白３（ＦｏｘＰ３）； 胃癌； 外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）； 共培养
【中图分类号】 Ｒ ７３０．２ 【文献标志码】 Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ
．ｉｓｓｎ．１６７２－８４６７．２０１３．０２．０１０Ｔｈｅ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦｏｘＰ３ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ ｐｅｒｉｐ
ｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ）ＭＡ Ｇｕｉ－ｆｅｎ，ＭＩＡＯ Ｑｉｎｇ
，ＬＩＵ Ｙｉ－ｍｅｉ，ＣＨＥＮ Ｓｈｉ－ｙａｏ△（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｄａｎ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇ
ｈａｉ ２０００３２，Ｃｈｉｎａ）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＦｏｘＰ３）ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ（ＧＣＣｓ）ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｉｔｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ）ａｎｄＧＣＣｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＦｏｘＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ；Ｗｈｅｎ ＧＣＣｓ－ＰＢＭＣｓ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ＣＣＫ－８ａｓｓａｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＧＣＣｓ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＧＣＣｓ ａｎｄ ＰＢＭＣｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏｄｅｔｅｃｔ ＦｏｘＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＦｏｘＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｅｄ ｂｏｔｈ ｉｎ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ＧＣＣｓ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＧＣＣｓ ａｎｄ ＰＢＭＣｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ＧＣＣｓ ｇ
ｒｏｗｔｈ．ＦｏｘＰ３ｍｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｄｉｒｅｃｔ ｏｒ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｐ＝０．０３１；Ｐ＝０．０１５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ，ＦｏｘＰ３ＭＦＩ ｉｎ ＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ＧＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｒ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＧＣＣｓ（Ｐ＝０．０１６；Ｐ＝０．０３４）．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ＩＬ－２ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ＦｏｘＰ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＰＢＭＣｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐ＝０．０２４），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇ
ｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ０
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马桂芬，等．胃癌细胞ＦｏｘＰ３的表达及其与外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）的相互作用
ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ．ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ＧＣＣｓ ａｎｄ ＰＢＭＣｓ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｏｎｅ（Ｐ＝０．０３５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＰＢＭＣｓ ｍａｉｎｌｙ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ ｍａｎｎｅｒ．ＦｏｘＰ３ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅｉｎ ｔｈｅｉｒ ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｓ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＦｏｘＰ３）； ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ； ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ）； ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ
＊Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（２００９９１１２７）．
叉头样蛋白３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ３，ＦｏｘＰ３）是调节性Ｔ淋巴细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｔｒｅｇ）的关键因子，它对Ｔｒｅｇ的形成和功能发挥具有重要的作用［１］。Ｔｒｅｇ在多种肿瘤组织中数量增多，这与肿瘤进展有关［２－３］。而近年来发现ＦｏｘＰ３还表达于肿瘤细胞中［４］，对临床病理特征及预后都具有重要作用［５－７］。由此推测表达ＦｏｘＰ３的胃癌细胞与淋巴细胞之间可能存在某种联系。关于两者有何相互作用以及ＦｏｘＰ３在此过程中起何作用的文献报道不多。部分文献报道了胃癌细胞可以促进淋巴细胞中ＦｏｘＰ３阳性的Ｔｒｅｇ细胞增多，从而促进免疫逃逸［８］；而对于淋巴细胞是否也会反过来促进胃癌细胞中ＦｏｘＰ３的表达并进一步发挥生物学活性的作用还不清楚。本文通过胃癌细胞和ＰＢＭＣｓ的共培养研究了在模拟的肿瘤微环境下两种细胞中ＦｏｘＰ３的表达情况，结果有利于阐述ＦｏｘＰ３在肿瘤发展中的作用，以期为今后肿瘤的靶向干预提供理论基础。
材料和方法
胃癌细胞株和细胞培养 人低分化胃癌细胞株ＭＫＮ４５和ＡＧＳ、人中分化胃癌细胞株ＳＧＣ７９０１以及人高分化细胞株ＭＫＮ２８均购于上海生命科学院细胞库。以１０％胎牛血清和１００ＩＵ／ｍＬ青霉素及０．１ｍｇ／ｍＬ链霉素的ＤＭＥＭ完全培养基（美国Ｇｉｂｃｏ公司）培养细胞，置于含５％ＣＯ２的３７℃恒温培养箱中孵育。
ＰＢＭＣｓ的分离和培养 取获知情同意的胃癌患者及年龄和性别配对的正常健康者的肝素抗凝血各３例，分别定义为胃癌组（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ，ＧＣ）和对照组（ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｔｒｌ），稀释后加到淋巴细胞分离液上，１ ５００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ；吸出中间白色细胞层，洗涤得到ＰＢＭＣｓ，继续培养８ｈ，待其中的单核细胞贴壁后，吸上清，分离得到的细胞大多数为淋巴细胞，继续后续试验。实验独立重复进行３次。
共培养体系的建立 直接共培养组（ｄｉｒｅｃｔｃｏｃｕｌｔｕｒｅ，简写为Ｄｉ－ｃｏ）是将两种细胞直接混在一起的培养模式；而间接共培养组（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ，简写为Ｉｎｄｉ－ｃｏ）是利用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司）带有一层０．４μｍ的膜不能通过细胞而可以使细胞因子相互透过的原理，将淋巴细胞养于上室而肿瘤细胞养于下室的间接培养模式。单培养是指不加有ＰＢＭＣｓ的单胃癌细胞培养。
免疫荧光技术检测ＦｏｘＰ３蛋白分布 将爬有ＳＧＣ７９０１、ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８胃癌细胞的细胞爬片取出后，经固定、破膜、封闭；加入一抗ＦｏｘＰ３（２３６Ａ／Ｅ７，英国Ａｂｃａｍ公司，稀释度１∶１００）４℃孵育过夜。然后，室温避光孵育ＦＩＴＣ荧光二抗（北京鼎国生物技术有限公司），洗涤；核荧光染料ＤＡＰＩ复染，甘油封片，在荧光显微镜下（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）观察荧光染色情况。
ＣＣＫ－８法检测胃癌细胞增殖 收集对数期胃癌细胞，计数，铺９６孔板使细胞密度为３ ０００／孔。培养２４ｈ后待细胞铺满孔底，加入浓度梯度的淋巴细胞，设３个梯度，淋巴细胞－胃癌细胞效靶比分别为２０∶１、１０∶１和５∶１，每孔１００μＬ，５个复孔，继续培养４８ｈ后，每孔加入１０μＬ ＣＣＫ－８溶液（上海碧云天生物技术有限公司）。继续培养４ｈ后在酶联免疫检测仪（美国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ公司）４５０ｎｍ处测量各孔的吸光度值（Ｄ）。同时设置调零孔、胃癌细胞单培养孔。结果计算如下：胃癌细胞的被抑制率＝［１－不同效靶比下共培养的Ｄ值／胃癌细胞株单培养的Ｄ值］×１００％。
流式细胞技术检测ＦｏｘＰ３表达 ＦｏｘＰ３检测专用的固定剂和破膜剂及流式抗体均购于美国Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司。ＳＧＣ７９０１、ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８ ３种胃癌细胞株提前２４ｈ以１×１０５／ｍＬ种植于６孔板。加入分离的胃癌患者及正常对照的ＰＢＭＣｓ（效
１
８
１
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靶比１０∶１），培养４８ｈ后，收集上层不贴壁的ＰＢＭＣｓ，同时用胰酶消化下层贴壁的胃癌细胞，３
０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ、洗涤，经破膜和固定后，加入ＦｏｘＰ３－Ａ
ＰＣ标记抗体（美国Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司），４℃避光孵育３０ｍｉｎ；经洗涤和４％多聚甲醛固定后，上机作流式细胞技术检测。以每种细胞的裸细胞大小初步设定ＦＳＣ与ＳＳＣ参数，再根据同型对照设门，同型对照阳性率设定在２％以内，再检测其他待测样本。用ＦｌｏｗＪｏ软件分析ＦｏｘＰ３蛋白的平均荧光强度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
，ＭＦＩ）。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ
ＰＣＲ检测ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ转录 ＰＣＲ检测试剂盒购于日本ＴａＫａＲａ公司。按照说明书提取总ＲＮＡ，测定ＲＮＡ浓度进行反转录反应（３７℃１５
ｍｉｎ
，８５℃５ｓ）。使用ＳＹＢＲ荧光试剂（日本ＴａＫａＲａ公司）进行ＦｏｘＰ３和内参ＧＡＰＤＨ的２步法ＰＣＲ反应的检测（９５℃预变性３０ｓ，９５℃变性５ｓ，６０℃退火３０ｓ），４０个循环后，用溶解曲线分析产物的特异性。ＦｏｘＰ３
ｍＲＮＡ相对表达量采用２
－ΔΔ
Ｃｔ进行计算。Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测ＦｏｘＰ３蛋白表达 所用试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。培养细胞加
入ＲＩＰＡ蛋白裂解液后收集细胞，测定蛋白浓度。上样５０μｇ蛋白进行凝胶电泳。使用甲醇浸泡过的
ＰＶＤＦ膜（德国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）进行三明治夹心法转膜９０ｍｉｎ。然后，置膜于５％脱脂奶粉中封闭１ｈ。加入ＦｏｘＰ３一抗（英国Ａｂｃａｍ公司，稀释度１∶２５０），４℃孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化酶（ＨＲＰ）
标记的二抗（北京鼎国生物技术有限公司），室温孵育１ｈ，缓慢摇动。经ＥＣＬ试剂（德国Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ公司）显影，凝胶成像系统拍照，分析。统计学方法 采用ＳＰＳＳ１６．０进行统计分析。组间比较满足正态性和方差齐时采用配对ｔ检验，不满足条件者采用非参数Ｋ－Ｗ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结 果
ＦｏｘＰ３蛋白定位 免疫荧光技术结果显示
ＦｏｘＰ３蛋白大部分表达于细胞胞核，
同时部分表达于胞核周围的胞质（图１）。这些是内质网所在的区域，
可能与其编辑加工有关
。图１ 胃癌细胞中ＦｏｘＰ３蛋白定位（×２００）Ｆｉｇ
１ ＦｏｘＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ＧＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ（×２００）Ａ：ＤＡＰＩ－ｓｔａｎｉｎｇ ｉｎ ｎｕｃｌｅｕｓ；Ｂ：ＦｏｘＰ３ ｗａｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｇｒｅｅｎ；Ｃ：Ｍｅｒｇｅｄ ｉｍａｇｅｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ＦｏｘＰ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｉｎｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｐ
ｌａｓｍ．２
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马桂芬，等．胃癌细胞ＦｏｘＰ３的表达及其与外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）的相互作用
共培养对细胞生长的影响 ＣＣＫ－８结果显示淋巴细胞－胃癌细胞之间效靶比越高，则胃癌细胞生长被抑制率越高。说明淋巴细胞越多，胃癌细胞生长被抑制率越高。而且胃癌组来源的淋巴细胞对胃癌细胞生长抑制能力强于健康对照组来源的淋巴细胞（图２）
。
图２ 淋巴细胞对胃癌细胞生长抑制作用
Ｆｉｇ ２ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＰＢＭＣｓ ｔｏ ＧＣＣｓＧＣ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＧＣ；
Ｃｔｒｌ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．
胃癌细胞的ＦｏｘＰ３蛋白ＭＦＩ变化 流式细胞技术显示，和单培养相比，在淋巴细胞－胃癌细胞效靶比为１０∶１时，共培养后胃癌细胞的ＦｏｘＰ３ＭＦＩ表达均增强，单因素方差分析发现ＭＫＮ２８细胞培养后差异具有统计学意义（Ｆ＝６．５１２，Ｐ＝０．０１９）；进一步ＬＳＤ法两两比较发现，与单培养相比，与胃癌患者或正常健康对照者的淋巴细胞共培养后，胃癌细胞的ＦｏｘＰ３ＭＦＩ均增高，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），而不同组之间ＭＫＮ４５和ＳＧＣ７９０１差异无统计学意义。ＭＫＮ４５和ＳＧＣ７９０１两种胃癌细胞间差异不明显（图３）
。
图３ 共培养后胃癌细胞的ＦｏｘＰ３平均荧光强度的变化Ｆｉｇ ３ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＦｏｘＰ３ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
（ＭＦＩ）ｉｎ ＧＣＣｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ
Ｍｏｎｏ－：Ｍｏｎｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ；ＧＣ－ｃｏ：ＧＣＣｓ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＰＢＭＣｓｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＧＣ；Ｃｔｒｌ－ｃｏ：ＧＣＣｓ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．
淋巴细胞的ＦｏｘＰ３ＭＦＩ表达变化 统计分析发现，与培养前相比，共培养后ＧＣ组及Ｃｔｒｌ中淋巴
细胞的ＦｏｘＰ３ＭＦＩ均增高（ｔ＝７．７９４，Ｐ＝０．０１６；ｔ＝６．６３２，Ｐ＝０．０３４，图４Ａ）。不论是ＧＣ组还是Ｃｔｒｌ组的淋巴细胞经直接共培养后其ＦｏｘＰ３ＭＦＩ水平均高于间接共培养组的水平（Ｐ＝０．０４１；Ｐ＝０．０３４）；而添加生长因子ＩＬ－２后，与ＧＣ组相比，直接和间接培养方式下ＦｏｘＰ３ＭＦＩ均增加，且间接共培养增加更明显，差异具有统计学意义（ｔ＝５．２６１，Ｐ＝０．０２４，图４Ｂ）
。
图４ 共培养后淋巴细胞ＦｏｘＰ３ＭＦＩ变化
Ｆｉｇ ４ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＦｏｘＰ３ＭＦＩ ｉｎ ＰＢＭＣｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓＡ：ＦｏｘＰ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＰＢＭＣｓ．ＦｏｘＰ３ ＭＦＩ ｉｎ ＰＢＭＣｓ ｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＧＣＣｓ；Ｂ：Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｄｅ ｏｆｃｏｃｕｌｔｕｒｅ．ＦｏｘＰ３ ＭＦＩ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ＰＢＭＣｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｈ ｉｎ
ＧＣ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｎ Ｃｔｒｌ ｇｒｏｕｐ．ＦｏｘＰ３ ＭＦＩ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ＧＣ ｇｒｏｕｐ ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２
（ＩＬ－２）ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｍｏｎｏ－：Ｍｏｎｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ；ＧＣ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＧＣ；Ｃｔｒｌ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．
共培养后胃癌细胞的ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ的差异 Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ结果显示，与单培养相比，ＧＣ组和Ｃｔｒｌ组胃癌细胞的ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ均增高（Ｐ＝０．０２２，Ｐ＝０．０４０）；而ＧＣ组和Ｃｔｒｌ组之间差异无统计学意义（图５Ａ），说明促ＦｏｘＰ３表达的作用可能与淋巴来源没有关系。我们的实验结果还表明：与单培养相比，直接共培养升高，差异具有统计学意义（ｔ＝４．３５１，Ｐ＝０．０３５），而间接接触略减低，差异无统计学意义（图５Ｂ）。推测这种促ＦｏｘＰ３表达增高的作用可能与细胞间作用方式有关。
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图５ 共培养后胃癌细胞的ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ变化
Ｆｉｇ ５ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ ｉｎ ＧＣＣｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ
Ａ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｅｓ；Ｂ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｄｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｏｎｏ－：Ｍｏｎｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ；ＧＣ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ
ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＧＣ；Ｃｔｒｌ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＢＭＣｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ；Ｄｉ－ｃｏ：Ｄｉｒｅｃｔ－ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ；Ｉｎｄｉ－ｃｏ：Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ．
不同培养方式下ＦｏｘＰ３蛋白表达差异 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明ＡＧＳ和ＭＫＮ４５胃癌细胞直接共培养后ＦｏｘＰ３蛋白的表达均升高，而间接共培养略减低。这也说明胃癌细胞和淋巴细胞之间促ＦｏｘＰ３表达作用主要是依赖直接接触方式（图６）
。
图６ 共培养后ＦｏｘＰ３蛋白表达情况
Ｆｉｇ ６ ＦｏｘＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ
Ｍｏｎｏ－：Ｍｏｎｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄｉ－ｃｏ：Ｄｉｒｅｃｔ－ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ；Ｉｎｄｉ－ｃｏ：Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ．
讨 论
ＦｏｘＰ３过去被认为是一种核转录因子，早期的研究只评价了其细胞核表达情况。近来发现ＦｏｘＰ３在多种肿瘤细胞中还表达于胞质，可能对其功能具有重要作用。Ｋａｒａｎｉｋａｓ等［９］在２５种肿瘤细胞株中发现，乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤细胞为胞质表达，而肺腺癌和Ｔ淋巴细胞增生白血病细胞为胞质、胞核共同表达。在肝细胞及肝癌组织中ＦｏｘＰ３胞质胞核染色均存在［１０］。Ｈｉｎｚ等［１１］报道了胰腺癌细胞中大部分为胞质染色。在ＨＥＲ２阳性的患者中乳腺癌组织中ＦｏｘＰ３为胞质染色［１２］。有学者认为ＦｏｘＰ３胞质表达更易导致生长抑制能力的丧失，促进肿瘤生长［１３］；其次，抗体的特异性不同，可能会导致细胞染色的定位不同。经过特异性比较，有学者推荐用２３６Ａ／Ｅ７检测ＦｏｘＰ３［１３］。我们课题组使用该抗体检测了ＦｏｘＰ３蛋白的表达，发现在胃癌细胞株中ＦｏｘＰ３主要表达于胞核和核周胞质，这一点是否与胃癌的生物学行为有关还需更进一步的研究来表明。
以往认为ＰＢＭＣｓ中ＦｏｘＰ３阳性的主要为Ｔｒｅｇ细胞［１］。许多学者认为胃癌中Ｔｒｅｇ数量越多，预后越差［１４－１７］。胃癌哨兵淋巴结中ＦｏｘＰ３阳
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马桂芬，等．胃癌细胞ＦｏｘＰ３的表达及其与外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）的相互作用
性的Ｔｒｅｇ数量与淋巴结转移有关［１８］。肿瘤浸润的Ｔｒｅｇ数量增多，与胃癌ＴＮＭ分期正相关，而肿瘤微环境中Ｔｒｅｇ的ＦｏｘＰ３表达量高低与ＣＯＸ－２和前列腺素的表达相关［１９］。Ｔｒｅｇ高表达ＦｏｘＰ３可抑制效应Ｔ细胞增殖，与胃癌进展有关［２０］。目前关于胃癌细胞表达ＦｏｘＰ３后与淋巴细胞之间有何相互作用及机制还未见报道。
细胞相互作用方式有两种：一种是细胞－细胞直接接触，一种是细胞因子介导的间接接触。我们体外共培养实验模拟了体内胃癌细胞与淋巴细胞生存环境及作用方式，发现与淋巴细胞直接接触时能抑制胃癌细胞的生长。其次，我们在ｍＲＮＡ及蛋白水平均证明共培养后胃癌细胞能促进淋巴细胞的ＦｏｘＰ３表达增高，同时，淋巴细胞也能促进胃癌细胞的ＦｏｘＰ３表达，且直接共培养方式较间接共培养方式作用更明显。这说明两者的相互作用可能更依赖于两种细胞之间的直接接触方式。
先前的研究认为表达ＦｏｘＰ３的肿瘤细胞和幼稚Ｔ细胞共培养可以完全抑制Ｔ细胞增殖，不影响活化，而特异地抑制ＦｏｘＰ３表达可以消除这种抑制Ｔ细胞增殖的效应；同时，胰腺癌细胞与ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞之间直接共培养可明显抑制Ｔ细胞增殖，而间接共培养不具有这种作用；而且，敲除ＦｏｘＰ３的胰腺癌细胞其抑制Ｔ细胞增殖的能力降低［１１］。他们认为肿瘤细胞可以模拟Ｔｒｅｇ作用，其ＦｏｘＰ３表达越多，肿瘤逃逸能力越强。我们的研究也表明胃癌细胞与淋巴细胞的直接接触可能是诱发免疫逃逸的主要因素。先前报道过卵巢癌细胞通过分泌ＴＧＦ－β可以促进外周ＣＤ４＋Ｔ细胞转化为Ｔｒｅｇ细胞，在ＴＧＦ－β存在的条件下，ＣＤ３和ＣＤ２８的刺激可以诱导ＦｏｘＰ３表达［２１］。胰腺癌细胞可以促进Ｔｒｅｇ增多［２２］。胃癌细胞也可以通过ＴＧＦ－β１的分泌促进ＣＤ４＋Ｔ细胞转变为Ｔｒｅｇ细胞［２３］。肿瘤来源的条件培养基可以促进ＴＧＦ－β的表达，使ＣＤ４＋Ｔ细胞转变为Ｔｒｅｇ细胞，这种机制可能与肿瘤细胞的免疫逃逸有关［２４］。这些研究均表明肿瘤来源的细胞因子，尤其是ＴＧＦ－β也在两者的相互作用过程中起部分作用。
本实验发现胃癌细胞与淋巴细胞共培养后胃癌细胞及淋巴细胞的ＦｏｘＰ３表达均增加，且直接共培养较间接共培养更明显。说明胃癌细胞与淋巴细胞之间发生的相互作用主要是通过直接接触方式。两种细胞中ＦｏｘＰ３表达的改变可能影响了两者的生物学行为。由此推测，胃癌的发展可能是胃癌细胞和淋巴细胞两者共同作用的结果，特别是胃癌细胞对淋巴细胞ＦｏｘＰ３表达的促进作用会导致肿瘤微环境中Ｔｒｅｇ的增多，使局部肿瘤免疫被抑制，导致肿瘤的发生发展。
参 考 文 献
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复旦学报（医学版） ２０１３年３月，４０（２）
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ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ
ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，１３１
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［２１］ Ｌｉ Ｘ，Ｙｅ Ｆ，Ｃｈｅｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓｇｅｎｅｒａｔｅ ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ
ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（－）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ
ＴＧＦ－ｂｅｔａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２００７，２５３（１）：１４４－１５３．
［２２］ Ｌｉｙａｎａｇｅ ＵＫ，Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒｅ ＰＳ，Ｍｏｏｒｅ ＴＴ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ（Ｔｒｅｇ）ｉｓ
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［２３］ Ｙｕａｎ ＸＬ，Ｃｈｅｎ Ｌ，Ｚｈａｎｇ ＴＴ，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－ｂｅｔａ１［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１１，１７（１５）：２０１９－２０２７．
［２４］ Ｌｉｕ ＶＣ，Ｗｏｎｇ ＬＹ，Ｊａｎｇ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ
ＴＧＦ－ｂｅｔａ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７８（５）：２８８３－２８９２．
（收稿日期：２０１２－０５－２５；编辑：张秀峰
櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅
）（上接第１６８页）
［７］ Ｌｉｎ ＣＪ，Ｃｈｅｎ ＪＤ，Ｔｉｕ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎ ｒｕｐｔｕｒｅｄ ａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ＥＤ？［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｅｍｅｒｇ
Ｍｅｄ，２００５，２３（１）：６０－６６．
［８］ Ｂｉｘｂｙ ＳＤ，Ｌｕｃｅｙ ＢＣ，Ｓｏｔｏ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ｖｅｒｓｕｓｎｏｎｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ：ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｏｒ
ＣＴ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２００６，２４１（３）：７８０－７８６．［９］ Ｓｕｈ ＳＷ，Ｃｈｏｉ ＹＳ，Ｐａｒｋ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｎｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ：
ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｏｒ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ
５２８ｌａｐａｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｐｐｅｎｄｅｃｔｏｍｉｅｓ［Ｊ］．Ｓｕｒｇ Ｌａｐａｒｏｓｃ
Ｅｎｄｏｓｃ Ｐｅｒｃｕｔａｎ Ｔｅｃｈ，２０１１，２１（２）：７２－７５．
［１０］ Ｙｅｕｎｇ ＫＷ，Ｃｈａｎｇ ＭＳ，Ｈｓｉａｏ ＣＰ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ａｎｄ ｎｏｎｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ＣＴ［Ｊ］．
Ｃｌｉｎ Ｉｍａｇｉｎｇ，２００４，２８（６）：４２２－４２７．
［１１］ ｖａｎ Ｒａｎｄｅｎ Ａ，Ｂｉｐａｔ Ｓ，Ｚｗｉｎｄｅｒｍａｎ ＡＨ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｕｔｅａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ：ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ
ＣＴ ａｎｄ ｇｒａｄｅｄ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ＵＳ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ
ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２００８，２４９（１）：９７－１０６．［１２］ Ｍｏｔｅｋｉ Ｔ，Ｏｈｙａ Ｎ，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ Ｈ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍ ｄｅｐｔｈ ｏｆ ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ａｐｐｅｎｄｉｃｅａｌ ｆｌｕｉｄ ｔｏ
ｄｉａｇｎｏｓｅ ａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ａ ６４－ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｒｏｗ ＣＴ ｓｃａｎｎｅｒ
［Ｊ］．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ａｓｓｉｓｔ Ｔｏｍｏｇｒ，２０１１，３５（６）：７０３－７１０．［１３］ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＳＷ，Ｓｏｔｏ ＪＡ，Ｌｕｃｅｙ ＢＣ，ｅｔ ａｌ．Ａｂｄｏｍｉｎａｌ ６４－ＭＤＣＴ ｆｏｒ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ：ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｒａｌ ａｎｄ ＩＶ
ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ｖｅｒｓｕｓ ＩＶ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｎｌｙ［Ｊ］．Ａｍ
Ｊ Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ，２００９，１９３（５）：１２８２－１２８８．
［１４］ Ｃｈａｌａｚｏｎｉｔｉｓ ＡＮ，Ｔｚｏｖａｒａ Ｉ，Ｓａｍｍｏｕｔｉ Ｅ，ｅｔ ａｌ．ＣＴ ｉｎａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｄｉａｇｎ Ｉｎｔｅｒｖ Ｒａｄｉｏｌ，２００８，１４（１）：１９
－２５．
［１５］ Ｐｕｒｙｓｋｏ ＡＳ，Ｒｅｍｅｒ ＥＭ，Ｆｉｌｈｏ ＨＭ，ｅｔ ａｌ．Ｂｅｙｏｎｄａｐｐｅｎｄｉｃｉｔｉｓ：ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ ｕｎｃｏｍｍｏｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｒｉｇｈｔ ｌｏｗｅｒ ｑｕａｄｒａｎｔ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｐａｉｎ ａｔ
ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｏｒ ＣＴ［Ｊ］．Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｓ，２０１１，３１（４）：９２７
－９４７．
（收稿日期：２０１２－０７－０８；编辑：张秀峰）
６８１
过表达CCR3的人胃癌细胞株的建立
过表达CCR3的人胃癌细胞株的建立 目的建立过表达CCR3人SGC7901胃癌细胞细胞株，为后续CCR3在胃癌转移的研究奠定基础。方法分离正常人外周血单个核细胞，提取总RNA，PCR 扩增CCR3基因CDS序列，连接至质粒pEFP-N1，进行CCR3基因的克隆，构建含有CCR3基因的pEFP-N1-CCR3重组质粒。重组质粒通过脂质体转染法对人SGC7901胃癌细胞进行转染。结果Realtime-PCR及Westernblot证实CCR3基因能够在人SGC7901胃癌细胞中正确表达。结论成功建立稳定表达CCR3基因的SGC7901胃癌细胞株，为研究CCR3在胃癌细胞株转移中的机制奠定了基础。 标签：CCR3；SGC7901细胞；胃癌转移 趋化因子受体（Chemokine receptor）是表达在一些特定的细胞表面的G蛋白偶连的七跨膜域受体[1]。这些受体与细胞外的配体趋化因子结合。与特异的趋化因子结合后，趋化因子受体引发钙离子内流而产生细胞趋化反应，从而诱导细胞到生物体的特定部位。CCR3在胃癌远端迁移上到底扮演什么样的角色也未完全清楚。目前，将外源性CCR3基因转入人胃癌细胞使其过度表达未见报道。本实验尝试构建含有CCR3的重组质粒pEFP-N1-CCR3并转染至人SGC7901胃癌细胞，并检测转染后SGC7901细胞CCR3的表达情况。 1资料与方法 1.1一般资料 1.1.1质粒菌株和慢病毒包装细胞pEFP-N1慢病毒穿梭载体，psPAX2和pMD2G包装质粒，大肠杆菌DH5。人SGC7901胃癌细胞，生长培养基为高糖DMEM培养基，含10%胎牛血清。 1.1.2 主要试剂及引物Lipofectine2000转染试剂盒；T4连接酶；质粒抽提试剂盒；限制性内切酶EcoRI和BamHI；胎牛血清；CCR3一抗；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。 1.2人SGC7901胃癌细胞的培养人SGC7901胃癌细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖的完全培养基中，置于37℃，5%CO2孵育箱中贴壁培养， 0.25%胰酶3d传代换液一次。 1.3 pEFP-N1-CCR3的构建及鉴定 1.3.1 CCR3的CDS序列扩增取健康人外周血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞并抽提总总RNA，在Pubmed中的nucleotide上查询CCR3的CDS编码区并设计克隆引物，并在克隆引物中加入BglII和EcoRI酶切位点，用taq聚合酶扩增CCR3的CDS序列，
胃癌的发病机制及预防
胃癌的发病机制及预防 姓名：孟慧佳学号：2011013281 班级：生物工程111 正文： 胃界于食道和十二指肠之间，是消化道最宽大的部分，它的形状和位置随内容物的多寡和体位变化而改变。胃分4个部分，靠近食道的部分是贲门部，胃上部膨大部分是胃底部，自胃底部往下是胃体部，靠近十二指肠的部分叫幽门部。 在胃内壁上覆盖着一层厚约0.3-1.5毫米的胃黏膜，胃黏膜上生长着三种腺体：即贲门腺、胃底腺和幽门腺。三种腺体加起来的数量是惊人的，每天分泌的胃液的数量约有1500-2500毫升，贲门腺和幽门腺主要分泌黏液，起到保护胃黏膜的作用。胃酸的强刺激和胃蛋白酶的强消化力，都不能破坏胃黏膜，主要就是因为黏液总是先于胃酸和胃蛋白酶分泌出来，并均匀地布散到胃壁上的缘故。胃黏膜的这种巧妙的自我保护功能，是令人叹为观止的大自然的杰作之一。 胃的功能有：1．存放食物。液体食物在胃里停留时间很短，油脂性食物在胃里停留时间较长，混合性食物在胃里停留时间约4-6个小时。 2．胃蛋白酶可消化食物中的蛋白质。 3．制造内因子及吸收维生素B2。 4．胃酸可杀灭随食物进到胃里的细菌。 胃内有食物时，胃的蠕动方向是由贲门向幽门进行，当胃内容物排空后、血糖也消耗到较低水平时，胃会由幽门向贲门方向逆性蠕动，这叫饥饿蠕动，使人产生饥饿感。 胃癌介绍： 恶性肿瘤胃癌起源于胃壁最表层的粘膜上皮细胞，可发生于胃的各个部位（胃窦幽门区最多、胃底贲门区次之、胃体部略少），可侵犯胃壁的不同深度和广度。癌灶局限在粘膜内或粘膜下层的称为早期胃癌，侵犯肌层以深或有转移到胃以外区域者称为进展期胃癌。肉眼或胃镜观察胃癌有多种形态，如表浅型、肿块型、溃疡型、浸润型、溃疡癌（为慢性胃溃疡癌变）。显微镜放大观察癌细胞有多种类型（组织学分类），如腺癌（占约90%，包括乳头状腺癌、管状腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌）、腺鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、类癌。更细微的癌细胞内部的分子结构也有很多差异，因此，虽都称为胃癌，即使肉眼和显微镜下所见类型是相同的，但个性仍有很大差异，目前并不知晓究竟有多少个性独特的胃癌。 胃癌的发病机制： 正常胃粘膜上皮细胞是由原始新生细胞（干细胞）不断分裂生长分化而来，何时生长何时死亡都是受机体控制的，不会疯狂失控生长。干细胞都有各种原癌基因和抑癌基因，绝大多数情况下原癌基因的特性不表达出来，不会形成致癌物质，因此也就不能发育成胃癌细胞。 有胃癌家族史者原癌基因可能更容易表达出来，这就是遗传的因素。除了遗传等内在因素外，还有很多外在的致癌因素，如上述高危人群面临的各种非遗传因素，也可直接诱发或长期破坏胃粘膜屏障使促癌物质更易诱发干细胞癌基因表达或基因突 变而产生致癌物，使新生不成熟的原始细胞不能分化成具有正常功能的胃粘膜上皮细胞，而是变成各种分化程度不良且生长失控的非正常细胞。 若机体的免疫监测功能正常，往往可以清除少量的异常细胞，但当长期心里状态不佳引起内分泌系统异常及免疫功能长期低下、或异常细胞由于某种未知原因逃逸了机体的免疫监测，则异常细胞最终发展成机体无法控制其生长的胃癌细胞，完成癌变过程。
clusterin 在胃癌组织及胃癌细胞株中表达的初步研究
claudin－6及clusterin在胃癌组织及胃癌细胞株中表达的初步研究 张俊会1，郭靠山2，王光亮1，马春生3 Expression of claudin－6and clusterin in gastric carcinoma tissues and cell lines Zhang Junhui1，Guo Kaoshan2，Wang Guangliang1，Ma Chunsheng3 1Xingtai Medical College，Hebei Xingtai054000，China;2Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College，Hebei Xingtai 054000;3Third Hospital of Xingtai，Hebei Xingtai054000，China． 【Abstract】Objective:To study the expression and clinical significance of claudin－6and clusterin protein in gas- tric carcinoma tissues and cell lines．Methods:The expression of claudin－6and clusterin protein were detected by immunohistochemistry and immunocytochemistry method in normal gastric tissue，gastric dysplasia，gastric carcinoma and gastric carcinoma cell lines(MKN28，SGC7901，BGC823)．Results:The positive expression rates of claudin－6 and clusterin in gastric carcinoma tissues，gastric hyperplasia and normal gastric mucosa were53．3%，65%，100% and60%，75%，100%，and differences among the3groups were remarkly significant(P＜0．05，P＜0．05)．The ex- pression of claudin－6and clusterin protein were related to tumor depth of gastric carcinoma and lymph nodes metas- tasis，but they were not correlated with patient＇s age，sex and vessel invasion．In addition，the expression of claudin－6 protein was positively related to that of clusterin protein(r=0．899，P＜0．05)．In gastric carcinoma cell lines claudin －6and clusterin were mostly expressed in cytoplasm and cell membrane．On the basis of the degree of differentia- tion，the immunostaining intensities of clusterin among3cell lines(MKN28，SGC7901，BGC823)were reduced，but those of claudin－6were not remarkly significant．Conclusion:Loss of the expression of claudin－6and clusterin play an important role in the carcinogenesis and subsequent progression of gastric carcinoma and might be used as mean- ingful markers of judging biological behavior of gastric carcinoma． 【Key words】gastric carcinoma;claudin－6;clusterin;immunohistochemistry Modern Oncology2013，21(02):0370－0373 【摘要】目的：探讨claudin－6及clusterin在胃癌组织及胃癌细胞中的表达及其临床意义。方法：应用免疫 组织化学及免疫细胞化学法检测claudin－6及clusterin在正常胃黏膜、非典型增生胃黏膜、胃癌组织及胃癌 细胞株（MKN28、SGC7901、BGC823）中的表达。结果：胃癌组织、非典型增生胃黏膜及正常胃黏膜中claudin－ 6及clusterin的阳性表达率分别是53．3%、65%、100%及60%、75%、100%，二者的阳性表达率在三组间有统 计学差异（均P＜0．05）。在不同浸润深度及有无淋巴结转移组内claudin－6及clusterin阳性表达的差异性 有统计学意义（P＜0．05），而在不同性别、年龄及脉管侵犯组内无统计学差异（P＞0．05），Spearman等级相关 性分析显示claudin－6与clusterin表达呈正相关（r=0．899，P＜0．05）。在三株胃癌细胞中claudin－6与 clusterin均阳性表达在细胞膜和细胞质中。依分化程度clusterin在MKN28、SGC7901、BGC823三种细胞系中 免疫染色强度逐步减弱，claudin－6在三种细胞系中免疫染色强度无明显差别。结论：claudin－6与clusterin 的缺失与胃癌发生发展及浸润转移有关，有望成为反映胃癌生物学行为有价值的标志物。 【关键词】胃癌；claudin－6；clusterin；免疫组织化学 【中图分类号】R735．2【文献标识码】A DOI：10．3969/j．issn．1672－4992．2013．02．48 【文章编号】1672－4992－（2013）02－0370－04 【收稿日期】2012－06－30 【修回日期】2012－07－21 【基金项目】河北省卫生厅医学科学研究重点项目计划（编号：20090594） 【作者单位】1邢台医学高等专科学校，河北邢台054000 2邢台医学高等专科学校第二附属医院，河北邢台 054000 3邢台市第三医院，河北邢台054000 【作者简介】张俊会（1970－），男，河北邢台人，副教授，主要从事消化系统肿瘤病理研究。 有研究表明多种上皮组织来源的肿瘤claudins表达异常，并与这些肿瘤的发生、发展密切相关［1］。胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，有关其发生、发展的机制尚未完全阐明。为此，我们采用免疫组化法检测claudin－6蛋白在正常胃黏膜、非典型增生及胃癌组织中的表达及其与clusterin表达的关系，以探讨其在胃癌的发生、发展及浸润转移中的作用。 1资料与方法 1．1资料 全部病例来自邢台市人民医院病理科2008年2月－2009年11月存档石蜡包埋标本。胃癌组45例，包括男性33 · 073 ·张俊会，等claudin－6及clusterin在胃癌组织及胃癌细胞株中表达的初步研究
胃癌MKN45细胞培养液上清对腹膜间皮细胞损伤的实验研究_那迪
胃癌MKN45细胞培养液上清对腹膜间皮细胞损伤的实验研究 那迪，刘福囝，姜成钢，徐昊，王振宁，徐惠绵 Experimental study on destruction of gastric cancer MKN45cells culture medium to peritoneum mesothelial cells Na Di，Liu Funan，Jiang Chenggang，Xu Hao，Wang Zhenning，Xu Huimian Department of Oncology，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Liaoning Shenyang110001，China．【Abstract】Objective:To examine the mechanism by which the gastric cancer cells lead to early peritoneal metas- tasis．Methods:HMrSV5cells were co－incubated with the supernatants of gastric cancer cells．Morphological chan- ges of HMrSV5cells were observed．The cell damage was quantitatively determined by MTT assay．The apoptosis of HMrSV5cells was observed under transmission electron microscope．Acridine orange/ethidium bromide－stained con- densed nuclei was detected by fluorescent microscopy and flow cytometry．The expressions of Bcl－2and Bax was im- munochemically evaluated．Results:Conspicuous morphological changes of apoptosis were observed in HMrSV5cells 24h after treatment with the supernatants of gastric cancer cells．The supernatants could induce apoptosis of HMrSV5 cells in a time－dependent manner．The supernatants could up－regulate the expression of Bax and suppress that of Bcl－2in HMrSV5cells．Conclusion:Gastric cancer cells can induce the apoptosis of HPMCs through supernatants in the early peritoneal metastasis．The abnormal expressions of Bcl－2and Bax may contribute to the apoptosis． 【Key words】peritoneal carcinomatosis;stomach neoplasms;mesothelial cell;apoptosis Modern Oncology2013，21(02):0235－0238 【摘要】目的：建立胃癌腹膜转移早期间皮细胞的损伤模型，探讨胃癌腹膜转移早期癌细胞对间皮细胞的损 伤与细胞凋亡的联系，以及凋亡程度与相关蛋白表达。方法：将人胃癌细胞培养液上清，与人腹膜间皮细胞 系HMrSV5共培养。观察间皮细胞形态、增殖改变，透射电镜观察细胞凋亡，流式细胞仪和荧光染色判断凋亡 比例。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl－2和Bax表达情况。结果：接触胃癌培养液上清24h后，间皮细胞 大片脱落并出现典型凋亡表现。胃癌细胞的分泌物明显抑制间皮细胞的生长。胃癌细胞培养液上清可诱导 间皮细胞凋亡、抑制细胞增殖，呈程度－时间依赖性地抑制间皮细胞抗凋亡蛋白Bcl－2的表达；并能增加促 凋亡蛋白Bax表达。结论：胃癌细胞在腹膜转移早期可以通过其分泌物诱导间皮细胞损伤、凋亡，凋亡机制与 Bcl－2和Bax的失调有关。提示保护间皮细胞，抗间皮细胞凋亡在胃癌腹膜转移治疗中可能有一定应用价 值。 【关键词】腹膜癌转移；胃癌；间皮细胞；细胞凋亡 【中图分类号】R730．23；R735．2【文献标识码】A DOI：10．3969/j．issn．1672－4992．2013．02．04 【文章编号】1672－4992－（2013）02－0235－04 临床上腹膜转移是胃癌根治术后面临的棘手问题。腹膜为癌细胞转移提供了所需的炎性介质，在癌腹膜转移早期，由癌细胞，成纤维细胞，间皮细胞等分泌的细胞因子作用于间皮细胞，使间皮细胞在形态结构功能上发生改变，为腹膜转移提供“土壤”［1］。在对癌细胞浸润间皮组织的研究中，Buck等把癌细胞接种到间皮细胞受损的小鼠腹腔内后， 【收稿日期】2012－08－22 【修回日期】2012－09－21 【基金项目】国家自然科学基金资助项目（编号：81071956） 【作者单位】中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，辽宁沈阳 110001 【作者简介】那迪（1982－），男，辽宁人，主治医师，博士，主要从事胃癌腹膜转移研究。E－mail：dawangmo@yahoo．cn 观察到癌细胞在受损区域迅速种植生长，而间皮细胞完好的小鼠却很少发生转移［2］。目前的研究发现，在癌细胞黏附到间皮细胞之前，间皮细胞就已经发生了改变：间皮细胞变圆或半圆形，进而细胞脱落导致间皮下结构暴露，形成裸区，癌细胞进而黏附种植［3－5］。我们认为间皮细胞的上述损伤改变与癌细胞诱导的细胞凋亡相关。基于上述假设，我们拟建立胃癌细胞黏附到间皮细胞之前所释放的细胞因子对腹膜间皮细胞的损伤模型，并检测细胞凋亡是否参与了上述损伤。 1材料与方法 1．1实验材料 试剂：FCS、DMEM、Bcl－2，Bax抗体及二抗、MTT、吖啶橙、溴乙啶（AO/EB）、PI均购自Sigma公司。细胞系：人胃癌细胞株MKN45由中国医科大学细胞生物学教研室提供。人 · 532 · 现代肿瘤医学2013年02月第21卷第2期MODERN ONCOLOGY，Feb.2013，VOL.21，NO.02
胃癌干细胞
润文宝 | 日期：2011-06-25 胃癌干细胞的研究进展 恶性肿瘤的克隆性增殖生长、维持及转移潜能取决于一群数量稀少、具有自我更新(self-renewal)潜力的细胞群体——肿瘤干细胞(Cancer stern cell，CSC)。目前肿瘤的放射和化学治疗对细胞周期活跃的肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，但不能根除细胞周期相对沉默的肿瘤干细胞，这可能是肿瘤复发的主要原因。胃癌对人类健康危害极大。研究胃干细胞及胃癌干细胞发生、发展的分子和细胞学机制，发现相关的特异分子靶点和针对这些靶点的药物，将为胃癌相关基础研究及临床靶向治疗提供新的切人点。 一、肿瘤干细胞学说的提出 肿瘤组织与胚胎组织间具有相似性，肿瘤可能起源于胚胎样组织。肿瘤细胞与胚胎干细胞及成体干细胞间存在许多相似性。近年来提出的肿瘤干细胞学说认为，肿瘤组织中存在极少量细胞，具有无限自我更新和高度增殖能力以及多种分化潜能，能产生不同表型的肿瘤细胞，使肿瘤在体内不断扩大或转移形成新的肿瘤。1994年分离获得的人髓系白血病干细胞证明了肿瘤干细胞的客观存在，之后又相继从乳腺癌、脑肿瘤和前列腺癌组织中分离并培养出各种肿瘤干细胞，证实了实体肿瘤干细胞的存在。 二、胃干细胞、炎性反应与胃癌的发生 胃干细胞是具有自我更新和复制能力的原始细胞，属于成体干细胞，通过向祖细胞分化。进一步分化形成胃的各种腺体细胞，维持胃黏膜更新及组织内环境稳定。由于缺乏特异性标志和理想的分离纯化技术，故目前对胃干细胞的研究较少。有研究证实G蛋白偶联受体(Lgr5)表达于胃腺体底部细胞中，通过分化细胞学示踪实验发现，胃腺体细胞均来自于Lgr5阳性的细胞。另有研究通过结合转基因技术和绿色荧光蛋白示踪技术，成功示踪了数量极少的胃祖细胞，这些细胞正常情况下呈静息状态，当受到炎性刺激时，祖细胞发生对称分裂，进行数量扩增，同时还可进行不对称分裂分化为各种腺体细胞。胃干细胞受到持续的炎性刺激、自身抗体或其他因素作用时可发生肠上皮化生，此过程可能是组织细胞干细胞水平分化异常所致。胃干细胞可产生胃型和肠型细胞，胃癌表型表达的异质化反映了胃祖细胞向这两个方向分化的内在潜能。已有研究证实幽门螺杆菌通过对胃上皮干细胞的影响和作用，在慢性萎缩性胃炎向胃腺癌的转化过程中起关键作用。小鼠胃上皮祖细胞系(mGEP)能支持胃癌相关幽门螺杆菌的吸附。对感染后的mGEP进行基因芯片表达谱分析显示。mGEP代谢和信号传导路径发生改变，氨基酸代谢的免疫过氧化物酶抗体路径(IPA)表达上调，多胺合成相关的限速酶鸟氨酸脱羧酶1(Odel)表达明显上调，该酶与胃肠型化生及慢性胃炎到胃癌的转化相关；抗酶抑制剂(Azinl)的表达亦显著上调。该蛋自在人胃癌组织中高表达，并与Odcl的表达量和活性相关。慢性炎性刺激使得胃上皮干细胞发生转化进展，促进肿瘤形成和进展。有研究称肿瘤为“不可治愈的炎性反应。慢性炎性反应能
胃癌细胞凋亡相关基因
胃癌细胞凋亡基因 西安国医肿瘤医院研究人员通过大量的研究分析发现，胃癌细胞凋亡是有相关基因控制的，目前发现的有以下三个基因：bcl-2基因、Bax和Fas/FasL。下面来详细介绍： 1.bcl-2基因 bcl-2基因编码26kD的膜蛋白，是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因。bcl-2基因激活、过表达可抑制细胞凋亡，从而使细胞增殖和凋亡不平衡，而且会使具有遗传改变又得不到修复的细胞免于死亡而进入细胞循环，多种遗传成分改变可导致肿瘤的发生。因此，bcl-2在肿瘤发生发展中起着重要的作用。 乳腺癌中，高表达的Bcl-2与乳腺癌细胞凋亡指数呈负相关，而且与有丝分裂指数呈正相关，提示在细胞增殖活跃期，Hcl-2阳性细胞凋亡减少，即Bcl-2过表达影响了细胞凋亡。Nakamum检测了肠型胃癌、胃腺瘤、肠化生及非化生胃黏膜，发现在肠化生中Bcl-2蛋白表达量最高(77.1%)，胃腺瘤(37.5%)和肠型胃癌(10.8%)中较低。 因而认为，Bcl-2蛋白的过表达主要是在胃癌的早期阶段起作用，使转化细胞逃避凋亡，以进一步积累其他基因的异常。Lauwers采用单克隆抗体124检测正常、伴有肠化生的萎缩性胃炎及异型增生胃黏膜，发现正常胃黏膜仅在胃小凹与腺体交接处增生的干细胞中有Bcl-2蛋白的微表达，而在肠化生黏膜的过增生区域及胃小凹表面分化不良的细胞中均可检测到Bcl-2，这些分化不良的细胞正是胃癌癌前病变的一个特征。 因此推测，胃黏膜受损后增生加快，导致一些分化不良的细胞出现，这些分化不良的细胞又因Bcl-2蛋白的过表达而逃避凋亡，呈现生长优势，细胞寿命延长，基因变异积累的机会增加，为进一步向恶性细胞转化提供了条件。 2.Bax Bax是第一个被分离到的Bcl-2家族成员之一，与Bcl-2的同源区主要集中在BH1和BH2区。Bax的功能与Bcl-2相对，可促进细胞的凋亡。Bax与Bcl-2在体内的表达呈部位互补形式。Bcl-2倾向于分布在生长细胞、增殖细胞，而Bax倾向于分布在终末分化细胞、退化细胞，在凋亡旺盛的细胞中表达更强。 国外Komatauin报道，在胃黏膜癌变的早期阶段，即已发生Bax的表达异常。
CQ11逆转多药耐药人胃癌细胞株对多柔比星的耐药
CQ11逆转多药耐药人胃癌细胞株对多柔比 星的耐药 作者：吴达龙睢凤英张成文吕焕章 【摘要】目的: 探讨氯喹衍生物CQ11对耐长春新碱(vincristine, VCR)人胃癌多药耐药(multidrug resistance, MDR) 细胞株SGC7901/VCR的耐药逆转作用。方法：将SGC7901和SGC7901/VCR细胞分别与各种浓度的多柔比星(doxorubicin, DOX)和/或CQ11在体外共同培养，采用MTT法检测其细胞毒作用；采用荧光分光光度计测定细胞内DOX蓄积量。结果：SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药程度是SGC7901细胞的37.5倍。1.0、2.5 和 5.0 mol/L的CQ11分别使DOX对SGC7901/VCR细胞的敏感性分别增加到 2.2倍(P<0.01)、5.5倍(P<0.01) 和14倍(P< 0.01)。DOX蓄积实验表明，CQ11能显著增加SGC7901/VCR细胞内DOX蓄积，而对SGC7901细胞内DOX蓄积无明显影响。结论：通过增加细胞内DOX蓄积量，CQ11在体外能有效逆转SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药性 【关键词】多药耐药; 氯喹; 胃癌; 逆转剂 肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性，同时对其它结构上无关、作用机理各异的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性［1］。MDR是一种独特的广谱耐药现象，
是导致化疗失败的重要原因，许多天然来源的抗肿瘤药物如长春新碱(vincristine, VCR)、紫杉醇等及蒽环类抗癌抗生素如多柔比星(doxorubicin, DOX)、柔红霉素都极易发生MDR［1~3］。MDR主要的耐药机理为多药耐药基因mdr1扩增及其蛋白产物P-糖蛋白(permeability glycoprotein, Pgp)过表达。作为一个ATP依赖性的药物转运泵，Pgp能主动将疏水性抗肿瘤药物泵出胞外, 从而减少细胞内药物蓄积, 增加药物外排［3］。MDR逆转剂，如维拉帕米和环孢菌素A，能与Pgp结合，抑制Pgp的药物外排功能，增加耐药细胞内抗肿瘤药蓄积，从而恢复细胞对抗肿瘤药的敏感性。然而，大量的临床研究结果表明，上述肿瘤MDR逆转剂由于体内毒性大，体内难以达到有效逆转浓度［3］。因此积极寻找高效低毒的新型MDR逆转剂，已成为肿瘤MDR研究的热点。 氯喹 CQ11 图1 氯喹和氯喹衍生物CQ11的化学结构 CQ11是以抗疟药氯喹的结构母核为基础, 经侧链改造而获得的新化合物(化学结构见图1)，由本课题组合成。本研究以耐VCR人胃癌MDR细胞株SGC7901/VCR为体外模型，研究CQ11对SGC7901/VCR 细胞的体外MDR逆转效应。
胃癌细胞表面-唾液酸糖链的表达与其侵袭、
胃癌细胞表面,唾液酸糖链的表达与其与侵染、转移相关 性的研究
摘要 本设计为了研究唾液酸在胃癌发病过程中的相关作用，探讨,唾液酸糖链结构在胃癌发生中所造成的影响。设计内容主要分为两部分：,唾液酸糖链结构在不同分化程度的胃癌细胞表面的表达对胃癌细胞侵染能力相关性的研究；,唾液酸糖链结构对胃癌细胞的转移能力相关性的研究；第一部分分为两个实验设计用MAL细胞化学染色法选出阳性细胞计算出MAL胃癌细胞的阳性率和体外细胞粘附试验测得吸光度测试唾液酸跟细胞粘度的关系；第二部分通过重组基底膜实验来计数胃癌细胞的穿膜细胞数，确定,唾液酸对胃癌细胞的侵染、转移的影响。为胃癌疾病的研究和治疗提供一定的理论及实验基础。 关键词：,唾液酸；表达；胃癌细胞；侵染；转移
第一部分：文献综述 1 唾液酸 0 1.1简介 0 1.2唾液酸的生物学功能 0 2 胃癌 (1) 2.1胃癌发生的过程 (1) 2.2胃癌的侵染、转移 (1) 3 唾液酸与肿瘤作用 (2) 3.1唾液酸与恶性肿瘤 (2) 3.2唾液酸与胃癌 (3) 4凝集素 (4) 4.1简介 (4) 4.2 MAL简介 (4) 4.3 MAL对胃癌细胞表面糖链的标记 (5) 第二部分课程设计部分 1材料 (7) 1.1细胞株及细胞培养 (7) 1.2试剂 (7) 1.3试剂配制 (7) 1.4仪器设备 (8) 2方法 (9) 2.1 MAL细胞化学染色 (9) 2.2 体外细胞粘附试验 (10) 2.3 重组基底膜侵袭实验 (10) 3 设计 (11) 3.1 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其转移能力的相关性 (11) 3.2 胃癌细胞表面,唾液酸糖链结构与其侵染能力的相关性 (11)
人胃癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体方法及步骤
人胃癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体方法及步骤 以反复接种传代于裸鼠皮下的SGC-7901 人胃癌细胞株建立的移植瘤组织块为材料，将其用生物吻合OB胶原位粘贴于裸鼠胃壁，并与传统"胃囊法"、”皮下移植法“比较观察移植肿瘤的生长情况、移植成功率和自发转移的发生率。 一、实验材料准备 6周龄BALB/c 无胸腺裸鼠24只，雌雄兼用，体重18-20 g。传代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌细胞株，本实验肿瘤组织为第6代。 二、人胃癌SGC-7901组织块制备 1. 无菌条件下取人胃腺癌SGC-7901J标本中的组织数块，直径约0.5-1.0 cm，去除坏死组织，漂洗，滤纸吸干后置RPMI-1640液中剪成1-2 mm 的小块，制备成单细胞悬液（5×108- 2.5×1011 /L）。 2. 置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种，逐日观察，待肿瘤长至1.0-1.5 cm时处死裸鼠，取出肿瘤组织按上述方法传代，传代瘤鼠与实验用鼠同为BALB/c无胸腺裸鼠，本组瘤源为第6代。 三、模型的建立 1. 将24只健康裸鼠随机分为3 组，即皮下移植组、胃囊法组和OB胶粘贴组，每组8只。
2. 将传代瘤鼠拉颈处死，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，切成1 mm ×1 mm×1 mm小块，置于生理盐水中备用。 3. 皮下移植组：将切好的瘤块置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种。 4. 胃囊法组：腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠，无菌条件下沿左侧正中旁线切开，刀口约1.5 cm，小心暴露腹膜、胃壁，在胃壁缝制粘膜小囊，将肿瘤组织块包埋于其中，缝合关腹。 5. OB胶粘贴组：腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠，常规消毒皮肤，沿左侧正中旁线切开，刀口约1.5 cm处小心暴露腹膜、胃壁，用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆肌层，以出血为度，将肿瘤组织用医用吻合OB胶粘合在破损处，用0号线缝合腹膜腹壁，关腹。 四、处死动物及观察移植瘤转移情况 1. 12 周后，裸鼠出现消瘦、活动受限、倦呆乏力等衰竭症状，部分裸鼠瘤体突出至皮下，呈蛙形腹，将裸鼠拉颈处死，肉眼观察8 组移植瘤的局部生长、腹水、邻近淋巴结以及远处脏器转移情况。 2. 解剖动物，全面探查胸腹腔，取出原位移植瘤、肿大淋结、肝、脾、胰、肺，并测量
世界卫生组织对胃癌的分型
世界卫生组织对胃癌的分型 2000年世界卫生组织(WHO)对胃癌各种组织学类型的形态学特征概括描述如下： 管状腺癌 胃癌肿瘤大部分由扩张的或裂隙样管腔构成，管腔有直径不等的分支，可见窦隙样结构。肿瘤细胞呈柱状、立方状或扁平状。可以见到透明细胞。依据细胞的异型程度分低度或高度恶性。有时将低分化的腺癌称为“实性癌”。肿瘤伴有大量淋巴细胞时称为‘髓样癌”或癌伴有淋巴样间质。 乳头状腺癌 癌组织形成规则腔隙，而且形成分支的乳头向腺腔内突出，其分支乳头内具有纤维性轴心，但有时也呈假乳头。胃癌癌细胞柱状或矮柱状，核增大，畸形，细胞保持一定极性，属于分化比较好的腺癌。有时伴有管状腺癌的成分，称为乳头管状腺癌。细胞异型性和核分裂指数变异很大。肿瘤常伴有急性和慢性炎症细胞浸润。 黏液腺癌 此型也形成腺管，特点是胃癌癌细胞分泌大量的黏液堆积在腺腔内，腺腔常扩张或被挤破裂并浸润间质而形成黏液湖。通常认为>50%肿瘤含有细胞外黏液湖。肿瘤有两种主要生长方式： ①胃癌癌细胞排列呈腺体，内衬分泌小肠黏液的柱状黏液分泌型上皮； ②胃癌癌细胞呈条索或不删小簇漂浮在黏液湖中。间质中可见黏液，可见散在的印戒样细胞。 印戒细胞癌 又称黏液细胞癌。50%以上不形成管腔或腺管，没有明显的癌巢，弥漫浸润性生长。癌细胞分泌黏液但多不排出到细胞外，由于胞浆内黏液增多，细胞核多被挤压到细胞的一侧周边，使整个癌细胞呈印戒状。有时癌细胞坏死和破裂也能形成黏液湖。肿瘤细胞有5种主要的表现形式： ①细胞核被分泌的黏液挤向细胞膜形成印戒样形态，奥辛蓝（pH25）染色阳性； ②细胞核位于细胞中央类似组。织细胞样的小细胞，缺乏分裂活性；
人胃癌细胞株MGC_803侧群细胞的分选与生物学特征
人胃癌细胞株MGC-803侧群细胞的 分选与生物学特征 俞薇1，吴婷1，司今2，姜伟2，李锦毅2* （1辽宁医学院武警总医院研究生培养基地，北京100039；2武警总医院） 摘要：目的从人胃癌细胞株MGC-803中分离侧群（SP）细胞，研究其生物学特征。方法利用流式细胞分选术（FACS）从MGC-803细胞株中分选出SP细胞和非SP细胞亚群进行培养，采用克隆形成实验比较两组亚群细胞的体外增殖能力，NOD/SCID鼠成瘤实验检测两组亚群细胞体内成瘤能力。结果FACS结果显示，细胞株MGC-803中SP细胞亚群占总细胞的0．3% 1．2%；SP细胞体外克隆形成率为（0．862?0．050）%，非SP细胞体外克隆形成率为（0．325?0．207）%，两者比较P＜0．05；SP细胞最低成瘤数量是1?103/只，非SP细胞为5?103/只。结论人胃癌细胞株MGC-803中存在SP细胞，其生物学特性与干细胞基本符合。 关键词：胃肿瘤；干细胞；分离；侧群细胞 中图分类号：R735．2文献标志码：A文章编号：1002-266X（2012）01-0004-03 Isolation and biologic characteristics of the side population in human gastric cancer cell lines MGC-803 YU Wei1，WU Ting，SI Jin，JIANG Wei，LI Jin-yi （1Graduate Education Center of Liaoning Medical University in General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing100039，P．R．China） Abstract：Objective To investigate isolation and biologic characteristics of the side population（SP）in human gas-tric cancer cell lines MGC-803．Methods Fluoresence activated cell sorting was used to sort SP and NSP cells from MGC-803s．Tumorigenicity of the two subpopulations was observed by sphere forming assay．Proliferation was determined by sub-cutaneous tumor formation in NOD/SCID mice．Results The percent of SP cells was0．3%-1．2%．Clone formation effi-ciency of SP cells and NSP cells was（0．862?0．050）%and（0．325?0．207）%respectively，there were significant differ-ences（P＜0．05）．In vivo，the tumorigenic ability of SP cells was higher than that of NSP cells．Tumor formed only by1?103SP cells in nude mice，but5?103NSP cells．Conclusion Human gastric cancer cell lines MGC-803contained some SP cells with stem cell properties． Key words：stomach neoplasms；stem cells；isolation；side population cells 随着医学水平的进步，胃癌的生存率有所提高，但仍有相当一部分胃癌患者治疗后出现远处转移最终死亡。探索防止胃癌转移的途径是进一步提高胃癌生存率的关键。肿瘤干细胞理论的提出为胃癌的治疗开辟了新的研究方向。研究发现，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中，侧群细胞（SP）具有高增殖和体内高致瘤性等干细胞特性［1 3］。胃癌干细胞的研究国内外报道较少。2010年10月 2011年8月，我们通过分离胃癌SP细胞，对其生物学特征进行初步研究。现报告如下。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（81072969）。 *通讯作者1材料与方法 1．1材料人胃癌细胞系MGC-803由中国协和医科大学细胞中心提供。3 4周龄NOD/SCID小鼠32只，购自中国医学科学院动物所。胎牛血清、胰蛋白酶、Hochest33342、PI、DMEM培养液购自美国Sigma公司。主要仪器包括CO 2 恒温细胞培养箱、FACS流式细胞仪、倒置显微镜。 1．2方法 1．2．1细胞培养与分选将胃癌细胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液中，37?、5%CO2、饱和湿度条件下培养，胰蛋白酶消化，常规换液传代。收集对数生 4 山东医药2012年第52卷第1期
胃癌循环肿瘤细胞检测研究进展
中国中西医结合外科杂志2019年8月第25卷第4期 640 [28] 阴健, 郭力弓,主编.中药药理现代研究与临床应用[M].北京: 学苑出版社, 1996: 328-430. [29] 李平,胡建燃,铁军.柴胡总皂苷通过Akt/NF-κB 信号通路 抑制胃癌细胞MGC80-3的增殖和迁移[J].中国细胞生物学学报,2018,40(10):1727-1735. [30] 黄靓, 李国庆, 毛振江, 等. 人参多糖注射液对胃癌细胞 SGC-7901 凋亡的诱导作用及机制 [J]. 世界华人消化杂志, 2014, 22(33): 5114-5117. [31] 桂壮,邵治国,金笛.黄芪多糖抑制人胃癌MKN45、MGC-803细胞生长的作用机制[J].中医学报,2018,33(4):525-528.[32] 王利,魏品康,许玲,等.葛根素对胃癌多药耐药作用的实验 研究[J].中国中西医结合杂志,2005,13(1):389-392. [33] 李靖,郑旭薇,贾建光,等.人参皂苷Rh2对低浓度的奥沙利 铂诱导人胃癌SGC-7901侧群细胞凋亡的增敏作用[J].蚌埠 医学院学报,2018,43(5):561-566，572. [34] 鲍舒洁,张丹,张红,等.白芍总苷脂质体诱导胃癌BGC-823细胞凋亡的实验研究[J].中国药学杂志,2016,51(24):2109-2113. [35] 唐燕,张丹,孟祥林,等.白芍总苷脂质体对荷瘤小鼠肿瘤 生长及免疫功能的影响[J].中国新药杂志,2014,23(21):2547-2551. [36] 吴昊,李薇,葛红梅,等.芍药苷抑制NF-κB 的活性促进人胃 癌细胞凋亡[J].南京医科大学学报(自然科学版),2008(2):161-165. [37] 王谦,张玲,毛海婷,等.中药淫羊藿苷抑制肝癌HepG2.2.15 细 胞 增 殖 和 免 疫 逃 逸 作 用 研 究 . 中 国 免 疫 学 杂 志 , 2017,23(10):908-911. （收稿： 2019-01-23 发表：2019-07-31） 基金项目：山东省重点研发计划（2017GSF19104）；山东省中医药科技发展计划（2017-061） 1.山东中医药大学附属医院普外科 （济南 250014） 2.山东中医药大学（济南 250000） 通信作者：周永坤，E-mail:zhouyongkun@https://www.360docs.net/doc/1f17206030.html, 胃癌循环肿瘤细胞检测研究进展 王 猛1，李 晨1，顾萍萍2，谭 琳2，刘 霞2，周永坤1 摘要：循环肿瘤细胞（CTCs ）检测已成为“液体活检”。CTCs 被认为是致肿瘤远处转移的主要原因，对于发现肿瘤、监测肿瘤动态，评估疗效、预后等都具有较好作用。检测外周血中的CTCs 方便无创、敏感度高，具有可重复检测性。但是目前CTCs 的检测方法在特异性和敏感性方面面临着严峻的挑战，迫切需要开发一种新的平台，以低成本，大规模高性能实现CTCs 检测。CTCs 检测在胃癌的早期诊断、评估胃癌术后预后、预测转移性胃癌的化疗反应、评估晚期胃癌的治疗反应和预后、筛选胃癌靶向治疗可能获益的患者方面，具有重要的作用。 关键词： 循环肿瘤细胞；胃癌；检测 中图分类号：R 735.2 文献标识码：A 文章编号：1007-6948(2019)04-0640-04doi ：10.3969/j.issn.1007-6948.2019.04.053 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells ，CTCs ）被认为是从肿瘤原发部位和转移部位进入血液循环的各种类型的肿瘤细胞。早在1869年，澳大利亚医生Ashwonh 等在癌症患者外周血中发现并首次提到了CTCs 的概念[1]。CTCs 具有癌症干细胞（cancer stem cell ，CSC ）的特征，有很强的自我更新、分化能力，并且有致瘤能力和转移能力等特征。早期的观念认为，当肿瘤恶化或进展时会发生转移，但越来越多的证据表明肿瘤的扩散可能在早期发生。在原发肿瘤形成之前甚至可能发生远处转移[2]。CTCs 被认为是致肿瘤远处转移的主要原因。检测外周血中的CTCs 方便无 创、敏感度高，具有可重复检测性，美国 FDA 认证该检测为目前最可观的检测手段之一。CTCs 可以比影像诊断更早地预测肿瘤细胞的微转移，然后指导肿瘤的早期诊断。随着科学技术的进步，CTCs 的研究越来越深入，已成为目前研究的热门内容。胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，CTCs 检测技术对胃癌的早期诊断和早期治疗具有重要的意义。本文将总结近年来CTCs 的检测技术，探讨其在胃癌诊治中的应用价值。1?CTCs 的检测? CTCs 检测被称为“液体活检”，能够减少侵入组织取样需求的机会。在肿瘤治疗的基础研究和临床应用方面具有很大的潜力；在肿瘤复发和预后的作用受到越来越多的关注。由于肿瘤患者外周血中CTCs 的数量非常少，浓度通常仅为1~10个/10 mL [3]，这要求检测人员在短时间内采用高灵敏度和特异性的检测方法。目前CTCs 富集方法 综?述