基因工程实验指导2009版

广东省高教厅重点实验室－现代生物技术实验室实验教材

基因工程实验指导

(本科生教材)

华南农业大学

现代生物技术实验室基因工程实验分室

二零零九年四月

编者的话

本实验指导是为广东省高教厅重点实验室之一的“现代生物技术实验室”开设的“基因工程原理和方法”而编写的。本课程主要面向广州石牌地区六所高校的研究生，也包括部分高年级本科生。该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有修课学生预修“分子生物学”或“分子遗传学”。

本课程实验采用了一个内容连贯的实验系统(用质粒载体克隆植物DNA片段)，作为同学们掌握DNA体外重组基本技术的训练(实验一至实验七)。另外，根据本研究室多年教学、研究工作的经验，我们还把反映近年基因工程技术发展的PCR、Southern杂交技术等纳入实验内容，以保证学生修完本课程后能较快地开展相应研究工作，更好地适应未来研究工作的需要。

本实验指导由庄楚雄、穆虹、易继财、姚涓、吴豪、张群宇、刘耀光、梅曼彤等老师参加编写，易继财老师负责指导书的编辑等工作。

本实验指导为试用第三版，试用后我们将根据各校修课的情况和要求作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。

编者

2005年2月

目录

基因工程实验室学生守则??????????????????????????????????????????3实验一碱裂解法抽提质粒DNA ??????????????????????????????????4实验二琼脂糖凝胶电泳???????????????????????????????????????????? 7实验三DNA的酶切??????????????????????????????????????????????9实验四目的片段的回收???????????????????????????????????????????11实验五DNA的体外连接?????????????????????????????????????????12实验六重组DNA的转化?????????????????????????????????????????15实验七重组转化子的快速鉴定???????????????????????????????????18实验八多聚酶链式反应( PCR ) ?????????????????????????????????????19附录I. 各种试剂的母液配方??????????????????????????????????????????28附录II. 常用实验器具的清洗方法?????????????????????????????????????31主要参考书??????????????????????????????????????????????????????????32

基因工程实验室学生守则

1. 实验课前必须预习实验指导，了解实验原理和基本操作过程。

2. 实验课不得无故缺席、迟到或早退。非课表规定的实验时间，应按任课老师的安排，准时来进行操作。

3. 实验课时，应自觉遵守课堂纪律，保持实验室的安静与清洁卫生，不得大声谈笑，不得抽烟、随地乱丢纸屑、吐痰等。

4. 实验前清点好仪器、用具与试剂，实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地面上。

5. 实验中应严格遵守操作规程进行实验，细心观察实验现象，并如实记录实验结果。每个实验完成后，要写实验报告。

6. 实验完毕，应清洗好当天所用的器皿和用具，整理好仪器与实验台面，经任课教师同意方可离开。

7. 使用仪器、药品、试剂和各种其它物品需注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。

8. 废液可倒入水槽内，同时放水冲走，强酸、强碱等腐蚀性液体，应先用水稀释后，方可倒入水槽内，并放水冲走。废纸等其它固体废物，不得倒入水槽，应倒入废物桶内。

9. 严禁随意动用非当天实验所需使用的仪器和物品，使用仪器应严格按仪器使用的程序进行，贵重仪器需在任课老师的指导下进行操作。实验过程中如仪器出现故障，应及时向任课老师汇报情况，如违反使用规定造成的损坏，使用者将负责修理与赔偿。

10. 每次实验课由任课教师安排学生轮流值日，值日生负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作，最后关好水电、门窗，经任课教师检查同意后方可离开。

实验一碱裂解法抽提质粒DNA

一、目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。

二、原理

质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。其原理为: 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA 双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNA酶(RNaseA)消除。再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。

三、实验材料

含质粒pBluescript II的大肠杆菌BH10B。

四、仪器设备

高压灭菌锅超净工作台恒温摇床

台式离心机（冷冻式或非冷冻式）旋涡振荡器

五、实验用具

培养用试管量筒冰盒

微量离心管微量取液器吸管头若干

六、试剂(配制方法见附录)

LB培养基氨苄青霉素(Amp, 100 mg/ml) 20% SDS

溶液I；溶液II(最好现配现用)；溶液III(-20℃预冷)

4 N NaOH 3 M NaAc(pH5.2) 无水乙醇

TE缓冲液(pH 8.0) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇

饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，注：在本实验指导的其它章节省略为“酚/氯仿”，而“氯仿”均指已加入了1/24体积的异戊醇)

七、实验步骤

1. 细菌的培养

(1) 配制LB液体和琼脂培养基，并高压灭菌。

(2) 在含Amp 100 μg/ml的琼脂培养基平板上(划线或涂抹)培养出单菌落(37℃，18~20小时)。

(3) 在培养管中加入含Amp 100 μg/ml的LB液体培养基(4~5 ml/管)，挑取单菌落至培养基中。

将培养管倾斜插在摇床中，37℃摇过夜(约200 rpm，14~16小时，一般不超过18小时)。如需大量提取，挑取单菌落至接入含50 ml LB培养基的三角瓶中，37℃摇18小时。

2. 质粒DNA的抽提

（如使用冷冻离心机，设为4℃预冷）

吸取1.5 ml菌液至1.5 ml离心管中。

离心(5000 rpm, 2分钟)，弃上清液。如想提取多一点DNA，再吸取1.5 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液。

用移液器尽可能除去上清液。加入150 μl溶液I ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。

加入250 μl溶液II ，缓慢地上下翻转离心管10多下，温和混匀。室温下放置5分钟。

加入180 μl预冷的溶液III ，上下翻转离心管10多下，温和混匀，冰浴10分钟，或放入－20℃冰箱5分钟（避免过长时间产生冻结）。

离心(12000 rpm，5分钟，4℃)。（离心完后把离心机温度设为20℃）。

移取上清液。加2/3倍体积的酚/氯仿抽提，离心(12000 rpm，5分钟)。

移取上清液（约500~550μl），加2倍体积无水乙醇（大量提取时上清液的容量大，可用0.6倍体积异丙醇代替乙醇），混匀。

离心（12000 rpm，5分钟，室温)，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精。

用0.5 ml 70％酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精。

离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干10分钟。

加50~100 μl TE(含20 μg/ml RNaseA)溶解DNA沉淀。37℃放置数小时，-20℃保存备用。

高拷贝质粒DNA的产量一般为3~5 μg/ml菌液。此DNA可直接用于限制性内切酶切割等反应。如需要更高纯度的DNA，可进一步纯化。

3. 质粒DNA的进一步纯化

加入TE使DNA溶液为100 μl，加入100 μl酚/氯仿，充分振荡。

离心(12000 rpm, 5分钟)，吸取上清液。

加入1/10体积的3 M NaAc，加2倍体积的预冷无水乙醇，混匀。

置于-70o C冰箱约10分钟以上或-20o C冰箱30分钟至数小时。

离心（12000 rpm，15分钟，4o C)，倒掉酒精，离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精。

用0.5 ml 70％酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精。

离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干。

加50~100 l TE溶解DNA沉淀。

(如大量提取质粒DNA，溶液I，II，III的用量可相应增加，如培养液为50 ml时，溶液I，II，III的用量可分别为2.0 ml，4.0 ml，3.0 ml）。

本实验方法提取及纯化的质粒DNA的纯度只能满足一般目的的要求。对于纯度要求很高的情况，如作为克隆载体和测序的模板，最好使用厂商提供的质粒纯化试剂盒提取。

八、实验注意事项

1. 高压消毒需专人看管，压力至0.5磅时拔下电源插头放气，继续加热至1.0磅保持20分钟(通、

断开关控制)。

2. 无菌操作台使用前，开紫外灯灭菌，开紫外灯时勿开鼓风装置。

3. 对抗菌素不能用高温灭菌，需待培养基灭菌后冷却到不烫手的时候再加入。

4. 为避免细菌污染环境，多余的菌液经煮沸杀灭后方可倒入洗涤槽。

5. 加入溶液II、溶液III摇匀时一定要温和，不能剧烈摇动。

6. 在酚/氯仿萃取后，吸取上清液时，应注意勿将下层酚/氯仿吸入以免带入杂质；但也不要留

下太多上清液，使DNA损失较多。

九、实验时间安排

1. 第一天下午配制液体和琼脂培养基。（5:30）左右在琼脂培养基平板上划线接菌，培养过夜

长出单菌落。

2. 第二天下午（5:30）挑取单菌落植菌培养过夜。

3. 上午9:00左右停止培养，于室温或4℃存放。下午抽提质粒（纯化在实验二电泳期间进行）。

实验二琼脂糖凝胶电泳

一、目的

学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。

二、原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。

质粒DNA有环状超螺旋、开环、和线性三种构型，电泳时其迁移率各不同(超螺旋> 线性> 开环)。

三、实验材料

上次实验提取的质粒DNA。

四、实验设备

微波炉电泳仪微型电泳槽紫外透射检测仪

五、实验用具

微量取液器吸管头若干加样板

量筒100 ml?1 三角瓶500 ml?1 透明胶带

六、试剂(配制方法见附录)

琼脂糖10?TBE电泳缓冲液10?载样缓冲液EB母液(0.5 mg/ml) λDNA(HindⅢ)

七、实验步骤

1. 制胶

(1) 称取0.8 g琼脂糖加入盛有100 ml 1?TBE电泳缓冲液的500 ml三角瓶中，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。在微波炉或电炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷却到约60℃后，加入100 μl的0.5 m g/ml溴化乙锭(EB，终浓度为0.5 μg/ml)，并摇匀。

(2) 用胶带将制胶板两端封好，将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入其中，直至厚度为4~6 mm。

(3) 插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。

(4) 充分凝固后撕掉两端的胶布，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

(5) 将凝胶置入电泳槽中，加电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1~2 mm。

2. 点样

用微量取液器(P20) 吸取实验一的DNA样品2 μl于点样板小孔中，再加入8 μl TE或电泳缓冲液及1 μl的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10μl

λDNA(HindⅢ酶切,30 ng/ l)作为分子量标准。

4. 电泳

打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即可观察。

5. 观察

将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

八、注意事项

1. 用微波炉煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。

2. 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。

3. 倒胶注意厚度(4~6 mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。

4. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。

5. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。

6. 凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。

九、时间安排

一个下午完成。在电泳进行期间，按实验一进行质粒DNA的纯化。

实验三DNA的浓度测定及酶切

一、目的

学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液浓度及利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果，为以后的连接作准备。

二、原理

DNA的吸收光谱峰在260 nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260= 1时，双链DNA含量约为50 μg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8~2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。

目前已发现三类不同的限制性内切酶即I型、II型和III型。其中II型能专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因工程中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平末端。限制性内切酶HindIII识别的碱基序列为：

5’-AAGCTT-3’ A 5’-AGCTT

酶切作用后产生5’突出的粘性末端

3’-TTCGAA-5’ TTCGA-5’ A

酶切反应需Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高(>5%)，会使酶的识别位点发生改变，产生星活性(star activity)。绝大多数酶的反应温度37℃，也有个别要求在50 ~ 65℃。

三、实验材料

提纯的质粒DNA和水稻基因组DNA。

四、仪器设备

分光光度检测仪电泳仪微型电泳槽

紫外透射检测仪恒温培养箱

五、实验用具

微量取液器微量离心管(0.5 ml?1) 吸管头若干点样板

六、试剂

限制性内切酶HindIII及对应的缓冲液(试剂商提供) 无菌双蒸水

10?TBE电泳缓冲液0.8%琼脂糖载样缓冲液

七、实验步骤

1. DNA浓度纯度的测定

取实验一的DNA 2 μl (约100 ~ 200 ng)至一干净的离心管，加入198 μl蒸馏水稀释。先加200 μl 蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，然后倒掉蒸馏水，加入200 μl已稀释的DNA溶液，测定260 nm及280 nm的光吸收值(OD260及OD280)，计算DNA浓度及OD260/OD280比值。

2. 酶切：按下表配制酶解混合液

混匀，37℃保温1.5 ~ 3小时，电泳前在4℃保存。

3. 电泳检测：取酶解液3~10 μl电泳(具体步骤见实验二)。

4. 观察结果。

八、注意事项

1. 用紫外分光光度法测DNA含量时，对纯度不高的DNA测定结果往往不准确(偏高)，且测定所用DNA量较多。用琼脂糖凝胶法电泳(与已知浓度的DNA标准系列对照)定量更为可靠。

2. 酶切的DNA应具备一定的纯度，其中不能含迹量的酚、氯仿、SDS等。

3. 反应总体积中甘油的浓度要小于5％，即内切酶的体积应小于10%反应总体积(购来的酶含50％甘油)。

4. 内切酶从-20℃冰箱取出后，应放入冰浴中，在其它试剂加完后最后加。

5. 每次取酶必须使用新的灭菌吸管头，1个吸管头不能反复使用，更不能交叉使用。

6. 注意混匀，可用用手指轻弹管壁，使酶切体系所有成分混匀，然后短暂离心，使管壁液滴沉入管底。

九、时间安排

DNA浓度纯度测定、酶切，一个下午；电泳检测一个下午。

实验四目的片段的回收

一、目的

DNA分子经限制性内切酶消化以后，产生较小的片段，我们须从中选出我们需要的片段（目的片段），进一步作亚克隆，或用作探针。通过本实验，我们将学习掌握从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA 片段的一种方法。

二、原理

回收目的片段的方法有多种，常用的有冻融法、低熔点琼脂糖法、透析袋法、电泳回收法、玻璃孔回收法等。本实验采用电泳回收法。通过特别的V形电泳槽，将挖出的含有目的片段的凝胶置于V形槽前，接通电泳电源，DNA即进入V形管中，回收V形管中溶液即可，V形管较小，回收的DNA片段能保持较高的浓度。

三、实验材料

实验三酶切的水稻基因组DNA。

四、仪器设备

电泳仪电泳槽V形管回收电泳槽紫外透射检测仪

五、实验用具

微量取液器吸管头若干刀片微量离心管扁头镊子

六、试剂

0.8%琼脂糖10?TBE电泳缓冲液7 M醋酸铵载样缓冲液

七、实验步骤

1. 大量酶切产物的电泳分离。

琼脂糖为0.8％，选用大型电泳槽及厚梳子，并在低电压下电泳以提高分辨率。

2. 紫外灯下用刀片小心切出含1000bpDNA片段的凝胶。

3. 把凝胶片置于特制的“V”型槽平台上，在“V”型槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液(使其刚好淹过胶面)，再在“V”型孔中加入7 M NH4Ac，接通电源进行电泳。

4. 紫外灯下检测凝胶块是否含有DNA，判断DNA是否全部进入V形管溶液中。

5. 当DNA进入V形管中，放掉电泳槽中的缓冲液，吸出V形管中的溶液。

6. 溶液加两倍体积的无水酒精，混匀，置-70o C两小时或-20o C过夜。

7. 12000 rpm离心10分钟，沉淀用70％酒精洗一次，风干，加入10 μl TE。取1 μl与8 μl TE及1μl载样缓冲液混合，电泳检查并根据带的亮度估算其浓度。

八、注意事项

挖含目的DNA的凝胶时，尽量减少周围凝胶的带入。

九、时间安排

一个下午。

实验五DNA的体外连接

一、目的

学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法，将实验四回收的目的片段与载体质粒片段进行定向连接。

二、原理

DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶主要有：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4 DNA连接酶的底物可为：(1) 一条链带有缺口的双链DNA分子；(2) 两个存在互补粘性末端的双链DNA片段；(3) 两个存在平末端的DNA 片段；(4) RNA－DNA杂合体中，具缺口的RNA和DNA分子。大肠杆菌DNA连接酶适当的底物只是带缺口的双链DNA分子和具有同源互补粘性末端的不同DNA片段，它不能催化平末端DNA 分子之间的连接。

T4 DNA连接酶催化DNA连接的反应分三步进行：(1) 辅助因子A TP中磷酸基团与T4 DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物；(2) 酶-AMP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸－磷酸酯键；(3) DNA链3’端的羟基活化与5’端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DNA链间的连接。

大肠杆菌DNA连接酶催化DNA分子连接的机制及反应过程大致与T4 DNA连接酶相同，只是辅助因子为NAD+。

用于克隆的质粒载体在酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶(CIP或BAP)进行去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的菌落产生。

三、实验材料

实验四所得的DNA片段，以及用质粒纯化试剂盒提取的高纯度载体质粒pBluescript II(由教师提取)。

四、仪器设备

恒温水浴锅低温恒温水浴锅电泳仪电泳槽

紫外透射检测仪

五、实验用具

微量取液器吸管头若干微量离心管(1.5 ml，已灭菌)

六、试剂

HindIII及10?反应缓冲液无菌双蒸水碱性磷酸酯酶(CIP)

1 M Tris-HCl (pH9.0) T4 DNA连接酶及10?缓冲液(含ATP)

酚:氯仿

七、实验步骤

1. 载体的酶切和去磷酸化处理

(1) 在离心管中加入5 μg pKS质粒DNA，10 μl 10? HindIII缓冲液，加双蒸水至98 μl，最后

加入20 U HindIII酶。充分混匀，离心30秒，在37℃恒温水浴锅保温30分钟。

(2) 加入5 μl 1M Tris-HCl (pH9.0)，2 U CIP，充分混匀，离心30秒，在37℃恒温水浴锅保温，

60分钟。(加pH9.0的Tris-HCl缓冲液，目的是将pH7.5 ~ 8.0的酶切缓冲液的pH值调到

适合CIP的pH8.5左右)。

(3) 温育结束时，加EDTA (pH 8.0)至终浓度为5 mM，混匀，于65℃加热60分钟(或于75℃10

分钟)。然后用酚/氯仿抽提两次；上清液加0.1体积3 M醋酸钠，充分混匀，再加2.5倍体

积的无水乙醇，充分混匀后于-20℃放置15分钟。12000 rpm离心15分钟，沉淀用冷70％

酒精洗一次，风干后用40 μl TE溶解(DNA浓度约为80~100 ng/μl)。

2. 连接

在微量离心管中加入

混匀，45 ~ 50℃，5分钟(使粘性末端分开）

加入10?T4 DNA连接酶缓冲液1 μl

用1?连接酶缓冲液将连接酶稀释成0.2 Weiss单位或12 NEB单位/μl

再加入已稀释的T4 DNA连接酶1 μl

混匀，稍离心，在PCR仪上进行连接反应

65℃，5min，置于4o C保存备用

八、注意事项

1. 克隆用的载体质粒要求较高纯度，使之能用最少的酶和较短的反应时间达到完全的切断。使用过量的内切酶或CIP以及过长时间的反应会使载体末端缺失，产生大量的假阳性菌落(白色但没有插入子)。

2. 使用T4 DNA连接酶之前，应看清楚生产厂家所使用的活性定义单位，以便采用合适的酶浓度反应条件，不致造成不必要的浪费。

3. 目的DNA片段与载体DNA之间的摩尔浓度比例一般是3:1~1:1，并且使反应体系中DNA 的总末端浓度适于DNA分子之间连接，但又不易形成多分子连接的寡聚物，造成片段多拷贝插入。

九、时间安排

二个下午。

实验六重组DNA的转化

一、目的

学习将体外重组DNA(实验五的连接产物)引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中筛选出转化子的常用方法。

二、原理

把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(transformation)。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻(0℃)的CaCl2溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

本实验所用重组DNA的载体带有E.coli中的β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的调控序列和部分编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后可与宿主细胞之间实现α-互补而产生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成兰色菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。

三、实验材料

实验五的连接产物(重组DNA)、受体菌(E.coli，DH5α)。

四、仪器设备

高压灭菌锅超净工作台冷冻高速离心机

恒温水浴锅冰箱恒温摇床恒温培养箱

五、实验用具

离心管50 ml?1 电炉试管?1

微量取液器微量离心管培养皿

冰浴保温瓶锥形瓶150 ml?1 烧杯

六、试剂

LB培养基无菌双蒸水氨苄青霉素(Amp)

0.1 mol/L CaCl2SOC培养基X-gal IPTG

七、实验步骤

1 . 感受态细胞的制备

挑取E.coli DH5α受体菌单菌落(2~3 mm)于有50 ml LB培养基的500-ml锥形瓶中。

37℃振荡(250rpm)培养约2.5小时(活细胞数不超过108个/ml)。

（以下步骤均在超净工作台操作）

超净工作台上，倒入经消毒的50 ml离心管中，盖严。

在1L烧杯冰浴中放置10分钟，使菌液冷却至0℃。

4℃，4000 rpm离心10分钟收集菌体。

弃上清液，倒置在卫生巾上1分钟。

加10 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2，悬浮菌体。

冰浴25分钟。

离心（4℃，4000 rpm，10分钟）。

加入1.5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心悬浮

4℃冰箱保存过夜(12~24小时)。

2 . 转化

在1.5 ml离心管中加入

冰浴30分钟

42℃，静置90秒

冰浴2~3分钟

加入800 μl 37℃预热的SOC液体培养基

用1000-μl取液器移至培养管，37℃摇动（200rpm）45分钟。

各取100~200 l涂板，将培养皿置于室温至液体被吸收。

倒置培养皿，37℃培养过夜.

观察转化结果(白色为阳性，蓝色为阴性)

八、注意事项

1.为了达到较高的转化效率，LB和SOC液体培养基需用进口的胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出

粉（Yeast extract）。

2.转化实验使用的玻璃器皿、微量吸管、离心管管，应彻底洗净并进行高压消毒，表面去污剂、

化学试剂的污染将大大降低转化率。微量吸管应剪去尖端扩大口径。

3.制备感受态细胞的培养时间最好以OD值来决定。对某种菌株在培养后不同时间取样测定

OD600值，比较不同OD值时细胞的转化效率，以确定对该种菌株的最佳OD值，以后每次实验就以确定的OD值为指标选用细胞培养时间。

4.转化态细胞应尽量保持低温，离心管应提前预冷。

5.受体菌细胞经CaCl2处理后，细胞壁较脆，悬浮时小心操作。

6.制备好的感受态细胞可急冻保存备用：在1L烧杯中装入100ml无水酒精，在-70~ -80℃冰箱

预冷。将感受态细胞分装入离心管(0.2 ml/管)，置于-80℃酒精急冻，并保存在-70℃~ -80℃冰箱。

九、时间安排

实验前一天下午下班前接种划平板。

实验当天上午下班(11:30)前摇菌。

实验当天下午约2:00开始制备感受态细胞，配培养基、灭菌、倒平板，第二天下午做转化实验。

实验七重组转化子的快速鉴定

一、目的

掌握快速鉴定重组转化子的方法。

二、原理

虽然大部分质粒载体都可通过蓝白色选择重组转化子，但在实际应用中往往有相当部分的白色克隆是不含插入子的。本鉴定方法是用碱性裂解液把转化子菌体裂解，然后直接用琼脂糖凝胶分离，通过比较白色和兰色转化子质粒的迁移率，鉴定出重组转化子。

三、实验材料：实验六得到的转化子。

四、仪器设备：电泳装置。

五、实验用具：96孔平板，牙签。

六、试剂

含抗生素LB平板10 mM EDTA (pH8.0) 1 M KCl

10 x载样缓冲液0.8%琼脂糖凝胶

2?碱性裂解液：

七、实验步骤

1. 用牙签从转化选择平板选取几十个白色和几个蓝色菌落，殖在LB平板上，37℃过夜。

2. 在96孔平板每孔加入20 μl 10mM EDTA。

3. 用牙签挑取少量菌体(不能太多)，悬浮于各孔中(其中1~2孔是蓝色菌落作为对照)，将平板接触旋涡器几秒钟。

4. 加入20 μl裂解液，将平板接触旋涡器几秒钟，静置5分钟。

5. 将等量的1M KCl和载样缓冲液混合，各孔中加入6 μl，将平板接触旋涡器几秒钟。

6. 按蓝色菌落，白色菌落......最后蓝色菌落的顺序，各取20~30 μl点样。

7. 电泳，观察。与蓝色菌落质粒迁移率比较，可判别白色菌落的重组质粒是否含有插入子。

八、注意事项

挑取菌落勿太少，也不能太多。此外，裂解后菌液较粘，点样时吸管头勿垂直拉出以免带出点样孔内的菌液样品。

实验八多聚酶链式反应(PCR)

一、目的

了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。

二、原理

PCR (Polymerase Chain Reaction)是80年代中发展起来的一种DNA特定片段体外扩增技术。它已广泛应用于基因克隆、文库构建、DNA序列分析、生化检测、基因定位等领域。最初PCR是用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段进行，但Klenow片段高温下迅速失活，因此每一轮反应都需要加一份新酶，这不仅麻烦，还往往导致产量低，产物长短不一等现象。随后，从噬热细菌(Thermas aquaticus)中分离到热稳定的Taq聚合酶，才解决了这一问题。由于Taq DNA聚合酶高温下稳定，在整个扩增过程中不需要添加新的酶，从而保证了PCR技术的实用性，使其得以迅速发展。

PCR的原理及过程如下: (1) 将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA 聚合酶)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链；(2) 在低温(37~65℃)下退火，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA；(3) 在中温(~72℃)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增(见附图)。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。

三、实验材料

重组质粒DNA。

四、仪器设备

DNA热循环仪电泳仪电泳槽

紫外检测仪台式离心机

五、实验用具

0.5ml离心管10个吸管头若干个微量取液器(20 l)一支

1.5ml离心管20个离心管架两个

六、试剂

1. 反应缓冲液：由Taq酶供应厂商提供。

2. 四种核苷酸混合物(dNTPs)：浓度为2 mM。

3. 寡核苷酸(PCR引物)：上游引物和下游引物(一般长度为17~20个核苷酸)。

4. 矿物油

5. Taq DNA聚合酶

6. 1.2% 琼脂糖凝胶

七、实验步骤

1. 模板DNA的抽提：按碱裂解法抽提得到质粒DNA。

2. PCR操作：