果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

万方数据

ｍｉｎ．取出置于一８０℃超低温冰箱中冻结１０ｍｉｎ，然后于ＰＣＲ仪上９５℃裂解５ｍｉｎ．９０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。以上清液作为模板，采用２５“ＬＰＣＲ反应体系：２．０斗Ｌ细胞裂解液，１２．５斗Ｌｍａ。ｓｔｅｒＭｉｘ，各１．０“Ｌ５’ＡＯＸ和３’ＡＯＸ引物，８．５斗Ｌ无菌水。ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５８℃退火ｌｍｉｎ，７２０Ｃ延伸２ｍｉｎ，共３２个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳检测。１．２．８重组毕赤酵母工程茵的诱导表达将阳性转化子接种于含２５ｍＬＢＭＧＹ培养基中的２５０ｍＬ的摇瓶中，于３０℃２５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养１６。１８ｈ。离心收集菌体，用无菌水洗３次。将菌体转移至１００ｍＬＢＭＭＹ诱导培养基中，３００Ｃ２５０ｒ／ｍｉｎ继续培养．每２４ｈ补加适量甲醇至体积分数１％。每１２ｈ取样，离心５ｍｉｎ，收集上清液，即为粗酶液。

１．２．９重组毕赤酵母表达产物分析（１）工程菌的表达产物ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析。参照文献［３】方法进行蛋白质ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，聚丙烯酰胺分离胶的浓度为１２％，浓缩胶的浓度为５％。

（２）重组表达酶的活力测定。采用ＤＮＳ定糖法测定果胶裂解酶的活性１４１。向试管中加入ｌｍＬ１％果胶溶液，３．９ｍＬ缓冲液，水浴锅中温浴，加入１００肚粗酶液，混匀，反应３０ｒａｉｎ后加入２ｍＬＤＮＳ，沸水加热２ｍｉｎ，充分显色后放人冷水中冷却，蒸馏水稀释到１５ｍＬ测ＯＤ５４０值。果胶裂解酶活力定义为：底物每分钟释放出相当于ｌ／．ｔｍｏｌＤ一半乳糖醛酸的还原糖所需的酶量为１个酶活力单位，以Ｕ表示。

采用ＤＮＳ定糖法测定木聚糖酶的活力１５１。取１００肛Ｌ粗酶液与１００肛Ｌ用０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸缓冲液（ｐＨ５．０）配成１％的ｂｒｉｃｈｗｏｏｄ术聚糖溶液混合，５０℃反应１５ｍｉｎ，加入０．６ｍＬＤＮＳ试剂，煮沸１０ｍｉｎ，定容至５ｍＬ后测５５０ｎｍ光吸收。木聚糖酶的活力定义为：每分钟产生ｌ／ｘｍｏｌ木糖所需的酶最为一个酶活力单位（１Ｕ）。

（３）重组表达酶的性质分析。分析在不同的ｐＨ值与不同温度条件下工程菌分泌的果胶裂解酶和木聚糖酶的性质。

２结果与分析

２．１真菌总ＲＮＡ的分离和ｘｙｎ２的克隆

以土豆培养基培养绿色木霉ＡＳ３．３７１ｌ，采用ＥＴ．．Ｎ．ＡｒＭＦｕｎｇａｌＲＮＡＫｉｔ试剂提取菌体的总ＲＮＡ，并以ＲＴ．ＰＣＲ方法扩增得到ｘｙｎ２基因（图１）。扩增产物经连接到ｐＭＤ１９＿Ｔｓｉｍｐｌｅｖｅｃｔｏｒ载体上后进行序列测定，表明所扩增的序列长度为６９０ｂｐ。利用ｂｌａｓｔ程序进行分析发现，该序列与文献报道的ｘｙｎ２基因序列ｆＧｅｎｅｂａｎｋＮｏ．ＥＦ０７９０６１）同源性为１００％。

２．２毕赤酵母重组表达载体的构建

以获得的重组载体ｐＭＤ１９一Ｔ—ｘｙｎ２为模板，按照１．２．１的方法进行ＰＣＲ扩增反应。所得产物经过限制性内

图１ＲＴ—ＰＣＲ扩增目的ｘｙｎ２基因

３

切酶髓胡Ｉ和ＮｏｔＩ双酶切后．与ｐＰＩＣ９Ｋ载体经限制性内切酶切得到的约９．３ｋｂ载体片段连接，得到重组表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ—ｘｙｎ２（９９９０ｂｐ）。提取ｐＰＩＣ９Ｋ—ｘｙｎ２质粒，进行ＥｃｏＲＩ，Ⅳ０￡Ｉ双酶切鉴定（图２）。结果表明ｘｙｎ２基因已经正确插入到毕赤酵母分泌型表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ的多克隆位点。

图２ｐＰＩＣ９Ｋ一）（ｙｎ２ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ酶切鉴定

２．３重组酵母的筛选与鉴定

２．３．１木聚糖酶工程菌的筛选与鉴定在ＭＤ筛选培养基上筛选到６０个阳性转化子．分别点种到不同浓度的Ｇ４１８一ＹＰＤ平板上．在含有４．０ｍｇ／ｍＬＧ４１８的平板上获得了８个阳性转化子。使用ＡＯＸ进行ＰＣＲ鉴定。理论上．若质粒整合到毕赤酵母染色体上时没有破坏野生的ＡＯＸｌ基因。则以ＡＯＸ通用引物扩增时可得到２条带（２２００ｂｐ和１１８２ｂｐ），其中２２００ｂｐ的条带为ＡＯＸｌ，ｌ１８２ｂｐ的为目的基因。图３中第７泳道为用宿主菌ＧＳｌｌ５染色体做空白对照，空白对照在１１８２ｂｐ处没有目的大小的条带。第１０泳道为用ｐＰＩＣ９Ｋ—ｘｙｎ２质粒ＰＣＲ做阳性对照，在ｌ１８２ｂｐ处呈现目的大小的条带。第１一

图３以ＡＯＸ通用引物进行菌落ＰＣＲ筛选

木聚糖酶工程菌阳性克隆

万方数据

４

６和８－９泳道在２２００ｂｐ和ｌ１８２ｂｐ处均有清晰的条带。表明目的基因已整合到毕赤酵母基因组中，并全部为甲醇利用型。将ｌ一６和８－９泳道的阳性转化子分别命名为Ｘ１—６和Ｘ８—９。

２．３．２果胶裂解酶工程茵的筛选与鉴定本研究克隆的果胶裂解酶基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＤＱ４８６９８７．１）开放阅读框大小ｌ１２５ｂｐ。与质粒ｐＰＩＣ９Ｋ相连。构建了表达载

体ｐＰＩＣ９Ｋ—ＰｅｌＣ，转化毕赤酵母ＧＳＩ１５。通过组氨酸营养缺陷型筛选，Ｇ４１８高拷贝菌株筛选，获得了８个阳性转化子，将这些阳性转化子分别命名为Ｐ１～８。

２．３．３双价工程茵的筛选与鉴定在ＭＤ筛选培养基上筛选到１００个阳性转化子。分别点种到不同浓度的Ｇ４１８－ＹＰＤ平板上．在含有４．０ｍｇ／ｍＬＧ４１８的平板上获得了１５个阳性转化子。使用ＡＯＸ进行ＰＣＲ鉴定。理论上，若ｐＰＩＣ９Ｋ—ｘｙｎ２和ｐＰＩＣ９Ｋ—ＰｅｌＣ同时整合到毕赤酵母染色体上时没有破坏野生的ＡＯＸｌ基因。则以ＡＯＸ通用引物扩增时可得到３条带ｆ２２００、ｌ１８２、ｌ６１７ｂｐ），其中２２００ｂｐ的条带为ＡＯＸｌ，１１８２ｂｐ的为木聚糖酶基因。１６１７ｂｐ为果胶裂解酶基因。图４中第１５泳道为用ｐＰＩＣ９Ｋ—ＸＹＮ２质粒ＰＣＲ做阳性对照．在１１８２ｂｐ处星现目的大小的条带，第１６泳道为用ｐＰＩＣ９Ｋ—ＰｅｌＣ质粒ＰＣＲ做阳性对照．在ｌ６１７ｂｐ处呈现日的大小的条带。第１—７、９和１ｌ泳道在２２００ｂｐ和ｌ１８２ｂｐ以及１６１７ｂｐ处均有清晰的条带。表明双价目的基因已整合到毕赤酵母基因组中，并全部为甲醇利用型。第８、１０、１２泳道在１６１７ｂｐ处均有清晰的条带，表明果胶裂解酶基因已整合到毕赤酵母基因组中．为甲醇利用慢型。第１３、１４和１７泳道在２２００ｂｐ和１６１７ｂｐ处均有清晰的条带，表明果胶裂解酶基因已整合到毕赤酵母基因组中．为甲醇利用型。将１～７、９和ｌｌ泳道的阳性转化子分别命名为ＰＸｌ。７、ＰＸ９和ＰＸｌｌ。

图４以Ａｆ）Ｘ通用引物进行菌落ＰＣＲ筛

选双价工程菌阳性克隆

２．４表达蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析

果胶裂解酶不含信号肽的开放阅读框基因序列为ｌ１２５ｂｐ，编码３７４个氨基酸，用ＤＮＡＭＡＮ６．０软件预测表达蛋白分子量约为４３ｋｕ，对Ｐ２在不同时间段甲醇诱导表达产物进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳（图５）分析，结果表明相对分子量约在４３ｋｕ处呈现表达蛋白条带．与推算的表达蛋白质分子量一致。木聚糖酶不含信号肽的开放阅读框基因序列为６９０ｂｐ。编码２２９个氨基酸，用ＤＮＡＭＡＮ６．０软件预测表达蛋白分子量约２１ｋｕ；对Ｘ５在不同时间段甲醇诱导表达产物进ＳＤＳ一

图５重组菌株Ｐ２表达产物ＳＤＳ—ＰＡＧＥ

圈６重组菌株Ｘ５表达产物ＳＤＳ—ＰＡＧＥ

ＰＡＧＥ电泳（图６）分析，结果表明相对分子量约在２ｌｋｕ处呈现表达蛋白条带．与推算的表达蛋白质分子量一致。

对ＰＸ６的不同时间段甲醇诱导表达产物进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳（图７）分析．结粜表明果胶裂解酶约在４３ｋｕ处呈现表达蛋白条带．木聚糖酶约在２ｌｋｕ处呈现表达蛋白条带，与推算的表达蛋白质分子量一致。

图７重组菌株ＰＸ６表达产物ＳＤＳ—ＰＡＧＥ

２．５重组表达酶的活力测定

将Ｐ２、Ｘ５、ＰＸ６分别接种于ＢＭＧＹ培养基中，过夜后离心收集菌体。用无菌水洗３次，将菌体转移至ＢＭＭＹ诱导培养基中。每２４ｈ补加适量甲醇至体积分数１％。每１２ｈ取样。离心５ｍｉｎ，收集上清液，即为粗酶液。对Ｐ２、Ｘ５、ＰＸ６进行产酶周期的研究（图８）。发现Ｐ２在６０ｈ其果胶裂解酶活力最高，为１４．２Ｕ／ｍＬ：Ｘ５在６０ｈ其木聚糖酶活力最高，为５．８Ｕ／ｍＬ；ＰＸ６在６０ｈ其果胶裂解酶

；２

錾

０

０１２２４３６４８６０７２８４９６

时问（ｈ）

图８重组菌株Ｐ２、×５、ＰＸ６的产酶历程万方数据

活力最高为１２．６Ｕ／ｍＬ。木聚糖酶活力最高为４．２Ｕ／ｍＬ。对照菌株ＧＳｌｌ５未检测出具有果胶裂解酶和木聚糖酶的活力。

２．６Ｐ２产果胶裂解酶、Ｘ５产木聚糖酶、ＰＸ６产果胶裂解酶、木聚糖酶性质分析

测得Ｐ２、ＰＸ６分泌的果胶裂解酶的最适作用温度为５０℃。在３５～６５℃之间酶活保持５５％以上：最适ｐＨ值为５．４，在ｐＨ３．０～７．０的酸性条件下酶活保持在８５％以上。Ｘ５、ＰＸ６分泌的木聚糖酶的最适作用温度为５０℃．在３０～６０℃之间酶活保持６０％以上；最适ｐＨ值为６．０，在ｐＨ３．０。７．０的酸性条件下酶活保持在６０％以上。

３结论与讨论

我国有着丰富的菠萝叶纤维资源。目前。这些资源南于尚未得到充分利用而成为农业废料。而国际上。许多国家已经或正在对菠萝叶纤维等天然纤维的纺织应用进行研究Ｉ叫，菠萝纤维的服装制品受到了人们的青睐。菠萝叶纤维的木质素和半纤维素含量较高．而纤维素含量则偏低，半纤维素和果胶含鼍高是形成菠萝叶纤维吸湿。放湿快的主要原因［ｓｌ。因而选用低廉的方法处理菠萝叶脱胶问题是具有开发前景的课题。

本研究运用ＲＴ—ＰＥＲ技术，从绿色木霉（ＡＳ３．３７１１）ｍＲＮＡ中扩增出ｘｙｎ２，并与质粒ｐＰＩＣ９Ｋ相连．构建了表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ—ｘｙｎ２。转化毕赤酵母ＧＳｌｌ５。并且将ｐＰＩＣ９Ｋ—ｘｙｎ２和ｐＰＩＣ９Ｋ—ＰｅｌＣ（果胶裂解酶１同时转化毕赤酵母ＧＳｌ１５。通过组氨酸营养缺陷型筛选。Ｇ４１８高拷贝菌株筛选，以及摇瓶诱导表达筛选，分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株Ｘ５和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株ＰＸ６。同时，将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株Ｐ２保存。重组酶酶学性质分析表明。Ｐ２和ＰＸ６分泌果胶裂解酶。Ｘ５和ＰＸ６分泌木聚糖酶最适温度均为５０℃：Ｐ２分泌果胶裂解酶最适ｐＨ５．４，最大酶活为１４．２Ｕ／ｍＬ；Ｘ５分泌木聚糖酶最适ｐＨ６．０，最大酶活为５．８Ｕ／ｍＬ：ＰＸ６分泌果胶裂解酶最适ｐＨ５．４，最大酶活为１２．６Ｕ／ｍＬ．分泌木聚糖酶最适ｐＨ６．０．最大酶活为４．２Ｕ／ｍＬ。

邓伟科等【。Ｉ将果胶裂解酶基因转入大肠杆菌ＢＬ（ＤＥ３）获得表达；王向明等［１０ｌ实现了木聚糖酶在酿酒酵母菌株ＹＰＨ４９９中表达，但这些研究均以单个基因为基础。本研究通过对电转化条件的修改，将ｐＰＩＣ９Ｋ—ＰｅｌＣ和

５

ｐＰＩＣ９Ｋ—ＸＹＮ２同时转化ＧＳＩ１５．得到的转化子能够分泌表达这２个外源酶。酶活测定显示果胶裂解酶或木聚糖酶在毕赤氏酵母中单个表达酶活都比共表达时酶活要高。这可能是由于共表达两个酶的基因比表达单个酶基因对宿主菌的毒性更高，使菌体的密度无法达到很高，因此酶活较低。

根据文献报道中国科学院遗传研究所将木聚糖酶与果胶酶复配试验用于苎麻脱胶取得了良好的效果．酶法脱胶后残胶率小于１％，并改善了劳动条件．减少环境污染，减轻对纤维的损伤１¨～２１。果胶酶脱胶对棉麻的质量有所提高，残胶率低ｆ１３１；因此，果胶酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共表达．为后续的菠萝叶纤维脱胶奠定了良好的基础。

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万方数据

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤

酵母中的表达

作者：高秋芳，郭安平，孔华，邓伟科，贺立卡， GAO Qiu-fang， GUO An-ping， KONG Hua ， DENG Wei-ke， HE Li-ka

作者单位：高秋芳,邓伟科,GAO Qiu-fang,DENG Wei-ke(中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物技术重点开放实验室,海南,海口,571101;海南大学农学院,海南,海口

,570228)，郭安平,孔华,贺立卡,GUO An-ping,KONG Hua,HE Li-ka(中国热带农业科学院热

带生物技术研究所/农业部热带作物生物技术重点开放实验室,海南,海口,571101)

刊名：

广东农业科学

英文刊名：GUANGDONG AGRICULTURAL SCIENCES

年，卷(期)：2010,37(8)

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本文链接：https://www.360docs.net/doc/215695363.html,/Periodical_gdnykx201008001.aspx