2010-Immobilization of Ni by synthesising zeolite at low temperatures in a polluted soil

2010-Immobilization of Ni by synthesising zeolite at low temperatures in a polluted soil
2010-Immobilization of Ni by synthesising zeolite at low temperatures in a polluted soil

Technical Note

Immobilization of Ni by synthesising zeolite at low temperatures in a polluted soil

Claudia Belviso *,Francesco Cavalcante,Pietro Ragone,Saverio Fiore

Istituto di Metodologie per l’Analisi Ambientale,CNR,Tito Scalo (PZ),Italy

a r t i c l e i n f o Article history:

Received 4September 2009

Received in revised form 16December 2009Accepted 16December 2009

Available online 15January 2010Keywords:

Synthetic zeolites Pollution Nickel Fly ash

a b s t r a c t

Over the last few years a great deal of research has been carried out in order to develop remediation methods for reducing environmental risks due to polluting metals.Zeolite formation in contaminated soils mixed with coal ?y ash could be a useful method to reduce both the availability and the mobility of metals in contaminated areas.In this study a soil sample –treated with coal ?y ash and arti?cially con-taminated with a high concentration of Ni –was used for synthesizing zeolite at low temperatures.The role played by this mineral in the immobilization of heavy metal was investigated.The materials were analysed chemically (sequential extraction)and by XRD and SEM–EDS analyses.The synthesis was car-ried out both in the laboratory and on a bench-scale for 1year.Zeolite crystallization readily occurred after a month.The presence of Ni does not exert any in?uence on zeolite formation.On the other hand newly-formed zeolites reduce the toxicity of the element in the polluted soil.A reduction in heavy metal availability was observed after ammonium acetate extraction.The use of the modi?ed BCR three-step sequential extraction (sequential extraction protocol developed by Community Bureau of Reference of the Commission of the European Communities)suggests that Ni mobilization takes place when zeolite structure collapses after the BCR second step.The Ni thus available was mobilized in the third step.

ó2009Elsevier Ltd.All rights reserved.

1.Introduction

It is well-known that high concentrations of heavy metals in soils can pose long-term health risks both to ecosystems and hu-man beings.Over the last few years the amount of research on soils contaminated with heavy metals has shown that metals can occur in different fractions and chemical species in soils and sediments.The geochemical form of toxic elements in?uences their mobility,bioavailability and the risk of water pollution (Harrison,1981;Xian,1989).

Several remediation technologies have been developed in order to clean up contaminated soils.Some techniques lean towards hea-vy metal immobilization through the addition of reactive constitu-ents that alter solid-phase partitioning of the metal contaminant in a manner that reduces bioavailability without dramatically dis-turbing natural soil function.As a matter of fact many studies de-scribe the positive results obtained by adding natural and synthetic zeolites to polluted soils (Gworek,1992;Shanableh and Kharab-sheh,1996;Lin et al.,1998;Moreno et al.,2001a,b;Fernandez-Pereira et al.,2002;Ponizovsky and Tsadilas,2003;Castaldi et al.,2004;Penilla et al.,2006;Querol et al.,2006;Kocaoba et al.,

2007;Stefanovic

′et al.,2007).Other authors describe the role played by zeolite synthesized in soils contaminated with Cu,show-ing that the formation of these minerals can have the advantage of

entrapping a toxic element in their structure (Terzano et al.,2005b,2006).

In order to determine the effective contribution of zeolite or other minerals to soil remediation,different methods,which in-clude chemical extraction,are widely used.Chemical extraction is for assessing operationally-de?ned toxic metal fractions,which can be related to chemical species as well as potentially mobile,bioavailable or ecotoxic phases.Various single step extractions are widely used because of their simplicity and rapidity (Li et al.,1995;Quevauviller et al.,1996;Ford et al.,1999;Alvarez et al.,2006).However,these techniques do not provide any information on heavy metal speciation.On the contrary,sequential extractions can provide information on the possible chemical forms of the me-tal in addition to the physicochemical availability and the mobili-zation of toxic elements providing a good indicator under what conditions sorbed/bound contaminants would likely to be mobilized.

There are many multi-step extraction procedures and the scheme proposed by Tessier et al.(1979)was one of the ?rst.This procedure and the relative modi?cations (e.g.Campanella et al.,1995)were used for distinguishing trace metals in:exchangeable,bonded with carbonates,bonded with iron–manganese oxides or organic matter and residual metal in soils and sediments.The growing interest in sequential extraction aroused by the work of Tessier et al.(1979)has led to the use of several procedures with a different number of steps,reagents and extraction conditions.As a consequence,drawing comparisons between the results

0045-6535/$-see front matter ó2009Elsevier Ltd.All rights reserved.doi:10.1016/j.chemosphere.2009.12.046

*Corresponding author.Tel.:+390971427224;fax:+390971427222.E-mail address:belviso@https://www.360docs.net/doc/297126933.html,r.it (C.Belviso).Chemosphere 78(2010)

1172–1176

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Chemosphere

j o u r n a l h o m e p a g e :w w w.e l s e v i e r.c o m /l o ca t e /c h e m o s p h e r

e

obtained in different laboratories has become dif?cult.The Com-munity Bureau of Reference of the Commission of the European Communities(BCR Measurement and Testing Programme)devel-oped a three-step sediment sequential extraction protocol(Ure et al.,1993;Quevauviller et al.,1997),which could be considered as a standard method to be used in laboratories working in the ?eld of trace elements in contaminated soils.According to this method metals are divided into acid-soluble/exchangeable,reduc-ible and oxidizable fractions.

Our study involved1-year-long experiments carried out both in the laboratory and on a bench-scale,with the aim of developing a method for reducing the mobility and the availability of the toxic element in a natural and economical way,based on the direct for-mation of zeolites in contaminated soil by using?y ash under envi-ronmental conditions.Zeolite formation is generally based on a complex mechanism.In the case of the synthesis of aluminium-rich zeolite such as zeolite X,the mechanism consists of a?rst step during which an alluminosilicate gel is formed by mixing alumina, silica and alkali metal hydroxide ions in water.Nucleation occurs in a following step.Our procedure concerns the synthesis of zeolite X,in a soil arti?cially polluted by a high amount of Ni(10mg Ni gà1 of soil dry weight).The alumina and reactive silica sources were supplied by soil forming minerals and amorphous material of?y ash.In order to better evaluate the chemical process responsible for Ni immobilization during zeolite formation,and whether Ni can be trapped in the newly-formed zeolite,the BCR sequential extraction method was employed in addition to the ammonium acetate extraction step.The solid residues of each extraction step were analysed by XRD.

2.Materials and methods

2.1.Soil contamination and experiments in the laboratory and on a plant scale

The experiments were carried out using coal?y ash obtained from the ENEL thermoelectric power plant of Brindisi(Italy)and a soil sample collected from an area near Potenza(Southern Italy). Table1reports the chemical and mineralogical composition of both source materials.

A1:1.2weight ratio of?y ash and NaOH was grounded in a mechanical mortar for a few minutes,and then the well-mixed powder was fused at550°C for1h in accordance with previous studies(Chang and Shih,1998).The resultant fused mixture was cooled and milled again.The powder thus obtained was mixed with the soil contaminated arti?cially with Ni(the?nal concentra-tion of10mg Ni gà1of the total dry solid matter).In particular,lab-oratory experiments were carried out by mixing8g of soil with 17mL of Ni solution in polypropylene bottles.The mixture was stirred for24h at room temperature and atmospheric pressure, and then1.8g of fused?y ash were added and stirred again for 1h.Finally,the mixture was incubated in a water bath at27°C.

The procedure used in bench-scale experiments was the same in terms of soil contamination,relative amounts of?y ash,soil and Ni solution and mode of incubation.In fact,a particular type of water bath was set up in order to carry out experiments using about33kg of arti?cially contaminated soil and7.8kg of pre-fused?y ash.The water content was kept constant.The temperature of incubation was around30°C,ranging from27to31°C.This temperature value was chosen in order to approximate environmental conditions as much as possible and speed up the reaction time a bit.

In both experiments samples were collected periodically up to 1year of incubation.Experiments with non-contaminated soil were carried out by Terzano et al.(2005a)using source materials analogous to those used in these experiments.2.2.Investigation of solid phases

Soil samples from laboratory and bench-scale experiments were collected at the above mentioned regular intervals.

The pellets were centrifuged at4500rpm for15min,washed twice with Milli-Q water,centrifuged and dried at80°C overnight. The same amount of each pellet was?nally used for mineralogical, morphological and chemical analyses.

The characterization of zeolites was performed by XRD using a Rigaku Rint2200diffractometer with Cu K a radiation and graphite monochromator.The morphology was observed by FE-SEM(Zeiss Supra40).

Adsorbed and exchangeable Ni was determined by ammonium acetate extraction.One gram(dry weight)of each pellet obtained after centrifugation was suspended in8mL of1M solution of NH4–CH3COOH(pH7.0).The suspension was shaken for2h at room temperature and centrifuged at4500rpm for45min.The solution was?ltered and analysed for Ni by inductively-coupled plasma spectrometry(ICP-MS).The solid residues were analysed by XRD.

The stability and speciation of toxic elements were determined by modi?ed BCR three-step sequential extraction proposed by Quevauviller et al.(1997).This chemical method is the result of a ring test carried out by18EU laboratories.

The solid residues of a single-step chemical procedure were washed twice with40mL of Milli-Q distilled water,dried over-night and subjected to a sequential chemical extraction.The proce-dure was conducted in three steps,assuming that the forms of Ni extracted were:(1)exchangeable and/or weakly bonded with car-bonate fractions;(2)correlated with reducible phases and(3) organically bonded and sulphide fractions.The reagents were for trace metals analysis and the analytical procedures utilized are the following:(i)?rst step(exchangeable fractions and fractions bounded with carbonate):the soil sample was extracted with 40mL of0.11M acetic acid solution(pH2.86)shaken for16h at Table1

Chemical and mineralogical properties of soil and?y ash.Minerals and major elements as wt.%;trace elements as ppm.

Parameter Fly ash Soil pH13.207.88

Organic carbon– 1.75

P

Phy–84 K-feld–2

Cal–4

Qtz610 Mullite17–

Amorphous77–

SiO246.8049.3 Al2O328.2116.7 Fe2O3 5.23 6.6 TiO2 1.490.9 MnO0.060.1 MgO 1.43 2.3 CaO 5.57 6.3 Na2O0.540.4 K2O 1.26 1.8 P2O50.780.2 LOI8.6615.6 SiO2/Al2O3 1.66 3.0 As14.58.0 Cd0.300.10 Co48.316.2 Cr138105 Cs 3.41 5.47 Cu68.342.8 Pb74.623.0 Se 4.000.90 Zn76.3106

C.Belviso et al./Chemosphere78(2010)1172–11761173

room temperature.The supernatant was separated by centrifuga-tion and analysed by ICP-MS in order to determine the dissolved Ni.The solid residue was washed twice with 40mL of distilled water and dried overnight;(ii)second step (reducible fraction):40mL of 0.1M of hydroxylamine hydrochloride solution,acidi?ed by the addition of HNO 3(65%),was added to the residue of the ?rst step and shaken for 16h at room temperature.The extract was separated and Ni determined.The residue was washed as in the ?rst step;(iii)third step (oxidisable fraction):10mL of hydrogen peroxide (acid-stabilized at pH 2–3)was added to the residue of second step and kept for 1h at room temperature.The mixture was then digested for 1h at 85°C.A second aliquot of 10mL of H 2O 2at pH 2.0–3.0was added and the mixture was digested for 1h at 85°C.The supernatant was separated by centrifugation and the residue was extracted with 40mL of ammonium acetate solution adjusted to pH 2.0and by shaking for 16h at room tem-perature.The extract was separated and analysed by ICP-MS as in the previous steps.

The solid residues of each extraction step were also analysed by XRD.

3.Results and discussion 3.1.X-ray diffraction

The XRD patterns of the Ni-contaminated soil incubated at 27°C in laboratory experiments show that the formation of zeolite X (Fig.1)takes place readily after 1month,and the amount of the newly-formed mineral increases during the entire incubation per-iod (Fig.2a).

The data from bench-scale experiments con?rm the general trend of zeolite formation resulting from laboratory experiments.XRD pro?les show a clear presence of zeolite X after only 1month of incubation (Fig.2b).

The presence of Ni does not exert any in?uence on zeolite crystallization.

The chemical and mineralogical composition of the ?y ash and soil used are favourable to zeolite synthesis.In fact,kaolinite and a high amount of amorphous phase are the main source of Si and Al for the formation of the zeolite.3.2.Chemical extraction procedures

Fig.3a shows the Ni concentration determined after a single-step chemical extraction both in laboratory and bench-scale exper-iments.Considering that zeolite formation takes place after 1month of incubation (Fig.2a),a smaller amount of Ni was ex-tracted from the samples of soil containing zeolite.Starting with the 1-month-incubated soil samples,a reduction in the total metal content of the ammonium acetate fraction can be seen.The

XRD

Fig.1.SEM image of zeolite X synthesized in soil contaminated with

Ni.

Fig.2.X-ray diffraction patterns of:(a)contaminated soil treated with ?y ash and incubated at 27°C in laboratory experiments;(b)untreated soil and contaminated soil treated with ?y ash and incubated at about 30°C for a month in experiments at bench-scale.X =zeolite

X.

Fig.3.(a)Ni extraction with single-step procedure in experiments in laboratory and bench-scale;(b)XRD pro?les of soil residues after single-step chemical extraction.

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patterns of solid residues (Fig.3b)still show the presence of zeolite X thus documenting that the ammonium acetate treatment does not attack the mineral.The chemical solution did not determine any ion exchange reaction in zeolite,and therefore it did not liber-ate the metal ion entrapped in its structure.

When applying the modi?ed BCR procedure to the samples de-rived from bench-scale experiments,the average quantities of me-tal extracted from the different three steps changes depending on the presence of synthetic zeolite.Fig.4shows that a lower concen-tration of Ni was found in the exchangeable and reducible fractions of the samples with a high amount of synthetic zeolite.The behav-iour is completely different when the soil samples –incubated for 3,6,9months and 1year –were treated with the procedure of the chemical sequential third step.In this case Ni mobilized is signi?-cantly higher when compared with the samples incubated for a shorter time.XRD analysis carried out on the solid residues of each BCR-extraction step (Fig.5)shows that the zeolite X is still present after the ?rst step but it is not detectable in the patterns of the so-lid residue of the subsequent two steps.

The data obtained clearly show that zeolite X captures Ni in its structure while forming,thus reducing the mobilization of the toxic element.When the structure of the newly-formed mineral is destroyed by chemical extractions,the toxic element is mobi-lized through the action of the different reagents depending on Ni speciation.Fig.4shows a lower mobilization of metal in the samples characterized by the presence of zeolite (samples of soil incubated for more than 1month)after an acid acetic attack.The similar trend of the second step shows that Ni cannot be found

as oxide–hydroxide in the zeolite structure.A higher concentration of Ni mobilized by peroxide +ammonium acetate solutions shows that the speciation of the metal,previously entrapped in the zeolite destroyed after the BCR ?rst step,took place in the oxidable form.The higher Ni-content mobilized from the samples containing a higher amount of zeolite (samples aged more than 1month)clearly suggests that organic matter and clay minerals have a neg-ligible role in binding the element.Although further investigations are necessary to determine exactly the Ni occupancies in the zeo-lite X synthesized in our experiments,it is clearly that the toxic element is mobilized only with a strong chemical attack.4.Conclusions

The results obtained from our research show that the direct synthesis of zeolite X takes place at low temperatures in the con-taminated soil treated with coal ?y ash.The experiments carried out in the laboratory and on a bench-scale at 27and about 30°C,respectively,show the formation of zeolite readily after a month and the amount of the newly-formed mineral increases during the entire incubation period.

The presence of Ni does not exert any in?uence on zeolite for-mation which,on the contrary,plays a leading role in the mecha-nism of the toxic element immobilization.In fact,a reduction in heavy metal availability characterizes the soil samples in which zeolite X was synthesized.The sequential chemical extraction sug-gests that Ni mobilization takes place after zeolite structure is de-stroyed.This causes the availability of the metal,previously trapped in the mineral and/or co-precipitated on its surfaces in the oxidable form.In all cases synthetic zeolite forms stable com-plexes with the toxic metal which are not broken under normal environmental conditions but as result of strong chemical attacks.Although the bench-scale experiments provided interesting re-sults under conditions close to the natural ones as much as possi-ble,they still represent an intermediate step between laboratory and natural system aimed at studying the mechanism of zeolite formation and Ni immobilization in the structure of newly-formed mineral.These studies could be a starting-point for on-site applica-tion also evaluating the possibility of restoring vegetation.Acknowledgements

Our thanks go to the management of ENEL Thermal Power Sta-tion (Brindisi)for their cooperation and Mr.Garofalo for collecting ?y ash for this research.We also wish to thank Dr.A.Lettino for SEM analysis.We also wish to thanks two anonymous referees and the Journal Editor for their detailed and constructive criticism.

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Fig.4.Results of three-step BCR procedure in experiments at

bench-scale.

Fig.5.XRD patterns of soil residues after chemical sequential extraction of samples incubated at bench-scale experiments.

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蛋白纯化离子交换层析

蛋白纯化离子交换层析 离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相,常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质,通过共价键结合某种电荷基团,形成带电基质,带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上,而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上,不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同,可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂,在阳离子交换剂中,带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂,当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基(DEAE)时,形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H,可与带负电荷的蛋白质进行结合,交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同,又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂,强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离,而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离,如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有:磺酸甲基、磺酸乙基;中等酸型阳离子交换剂有:磷酸基团和亚磷酸基团;弱酸型离子交换剂有:酚羟基和羧基类; 在阴离子交换剂中,带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换,例如阴离子交换剂CM纤维素,当纤维素交换剂分子上结合羧甲基(CM)时,形成带有负电荷的阴离子(纤维素-O-CH2-COO一),可与带正电荷蛋白质结合,交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同,可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂,结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质,当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时,蛋白质的静电荷为0,当溶液pH值大于蛋白质等电点时,羧基电离,蛋白质带负电荷,蛋白质能够被阴离子交换剂所吸附,相反,当溶液的pH值小于蛋白质等电点时,则氨基电离,蛋白质带正电荷,被阳离子交换剂所吸附,溶液的pH值距蛋白质等电点越远,蛋白质带电荷越多,与交换剂的结合程度也越强,反之则越弱。 当溶液的pH值发生改变时,蛋白质与交换剂的吸附作用也发生变化,因此可以通过改变洗脱液的pH值来改变蛋白对交换剂的吸附能力,从而把不同的蛋白质逐个分离,当pH值增高时,抑制蛋白质阳离子化,随之对阳离子交换剂的吸附力减弱,当pH值降低时,抑制蛋白质阴离子化,随之降低蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 另外,无机盐离子(如NaCl)对交换剂也具有交换吸附的能力,当洗脱液中的离子强度增加时,无机盐离子和蛋白质竞争吸附交换剂。当Cl-的浓度大时,蛋白质不容易被吸附,吸附后也易于被洗脱,当Cl-浓度小时,蛋白质易被吸附,吸附后也不容易被洗脱。 因此,洗脱阴离子交换剂结合的蛋白时,则降低pH值,增加盐离子浓度;洗脱阳离子交换剂结合蛋白时,则升高溶液pH值,增加盐离子浓度,能够洗脱交换剂上的结合蛋白。

超深冷处理

一、深冷處理(Sub-Zero)VS超冷處理(Cryogenic Treatment) 殘留沃斯田鐵(AUSTENTTE)不僅會降低刀具、模具的磨耗強度、而且在受到外力刺激時會將已經安定的沃斯田鐵不安定化而變態成初生型的麻田散鐵(MARTENSTTE),使耐衝擊性惡化,又因兩種組織的容積比不同,成型精密刀具、模具會產生體積膨脹、及應力破裂的情形,嚴重影響尺寸精度,使工件付之流水。 如何使鋼材在成型後得到具有優良機械性質的回火麻田散鐵組織、降低沃斯田鐵的殘留量及消除淬火、加工(線割、放電、研磨)過程中所產生的應力集中為目前精密工業界主要的課題之一。我們先從麻田散鐵變態的時機(Ms~Mf)圖一開始探討,再說明超冷處理的理論基礎及所產生的效益,與深冷處理的不同處。 二.麻田散鐵的變態時機(Ms~Mf) 將高溫的淬火組織施以適當的冷卻處理可得到高機械性質的麻田散鐵,由(圖一)可知溫度曲線閃過波來鼻到達+200℃附近時,冷卻速度變的緩慢,該溫度既為Ms點,麻田散鐵開始變態的溫度,溫度持續下降至常溫,麻田散鐵比率約83%如果溫度可以持續下降則麻田散鐵變態可以繼續進行,至-196℃時麻田散鐵比率可達97~98%,約有殘留沃斯田鐵2~3%。然以上為學界實驗室中進行的實驗研究及麻田散鐵變態推演。 以目前業界的環境及熱處理的調任,麻田散鐵的變態(Ms~Mf)是不可能一次完成的,而是分段進行的,有人認為淬火完成後1小時內須進行金屬過冷處理,亦有文章發表在淬火完成後6分鐘立刻進行過冷處理,其目的只有一,當殘留沃斯田鐵安定後不易再不安定化而變態成麻田散鐵,

是目前金屬過冷處理所須要求克服的技術重點,並非只要有經冷處理就能達到效果。 目前業界有數種冷處理的方式,以下將針對其基礎理論、效益逐一說明: 三.深冷處理(屬Sub-Zero) 處理方式: 以液態氮做為冷凍劑,於淬火後進行(約6分鐘)。如果先以100℃熱水從事1小時熱水回火就可於淬火稍後進行(約1小時內)不必畏懼殘留沃斯田鐵安定的問題,並且可以直接滲入液態氮氣中保溫時間長短並不重要,只到達所須要的溫度即可,,保溫不會發生不良後果,但不符合經濟原則。若想從深冷溫度加到室溫並非采自然解凍,而是將工件直接投入水中或熱水中解凍。(以上節緣模具熱處理一書,作者大和久重雄)。 處理時間: 以20-40分鐘內將溫度下降到-80℃~-130℃,再將工件以自然解凍或水中解凍方式回到室溫,就算完成,約1-3小時。 所得效率:

蛋白纯化层析柱

蛋白纯化层析 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业,小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年,但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的,经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration,GF),离子交换层析技术(ion exchange,IEX),羟基磷灰石层析(hydroxyapatite,HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction,HI),以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography,HPLC)。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言,从哪儿下手也许是令人头疼的一件事,但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell 解释道,通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步: 捕获——从细胞其它成份,比如DNA和RNA中分离需要的蛋白; 区分——从与目的蛋白具有相近的大小,或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白; 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。第一步捕获步骤,也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白,这需要一个具有高容量和高流量(flow rate)的填料。bead大小比较大,范围比较宽(比较于bead大小平均值)的“fast flow”填料比较理想,

这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。 第二步则对分辨率要求更高,需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比,因此在这一部中比较小的bead 比较合适。吸附性的技术,比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤,而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步,用于小体积,高浓度的样品。另外要注意,进行凝胶过滤层析时,样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。 选择柱料的时候有两个因素要考虑到,针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力,IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用,而GF的选择性依赖于填料的分馏范围(fractionation range)。 柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力,Mitchell表示,“如果你的峰值不集中,比较宽,那么即使是选择性很好,分辨率仍然会被消弱”。bead越大,洗脱峰就越不集中,柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性,高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 凝胶过滤法(gel filtration)也称为排阻层析(exclusion chromatography)、凝胶层析(gel chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatofraphy),它是在1960年后发展出来的技术。

A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

摘要:世界首个单克隆抗体(monoclonal antibody,简称单抗)于1986 年,获得美国食品与药品监督管理局的上市批准,拉开了单抗药物发展的序幕,成为生物医药领域中最耀眼的明珠。单克隆抗体纯化过程中a蛋白(protein a)层析介质的选择尤为重要,可以影响抗体的纯度。本文主要阐述单抗纯化过程中a蛋白亲和层析的相关内容。 关键词:a蛋白;耐碱性;动态载量 全球医药行业走向趋势是精准医疗时代,单抗是其中较为成熟的领域,引领了生物制药产业发展最为重要的驱动力。单抗药物主要是由中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell,简称 cho 细胞)表达产生,由 cho 细胞分泌的外源蛋白分子,通过纯化过程实现由细胞培养液中回收。随着单抗生产上游改造、培养参数的优化,其产量已达5-10g/l,同时也增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。宿主蛋白残留的组成随着培养条件的改变显现出显著的变化,单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。 根据终产品纯度、杂质含量的严格要求,单抗目前采用三步纯化策略:粗纯(样品捕获)、中度纯化和精细纯化,该策略工艺复杂、对操作要求严格,导致纯化成本一般占总生产成本的 50%-80%。用a蛋白亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首要步骤,一步纯化可使蛋白纯度达 95%以上。但a蛋白树脂价格昂贵,在大规模生产中,a蛋白纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的 35%以上。因此,蛋白 a 纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[1]。 1 a蛋白的性质金黄色葡萄球菌 a蛋白(staphylococal protein a,spa)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体(主要是igg)的fc区域结合。天然的a蛋白是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸,所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为 a275nm %=1.65,等电点为ph5.1。spa十分稳定,用4mol/l尿素、硫氰盐酸、6mol/l的盐酸胍和ph2.5的酸性条件,以及加热煮沸均不影响其活性。分子量:全长的spa 54kd,去掉与细胞壁结合部分的spa 42kd。spa与igg结合的亚类主要是igg1、igg2和igg4。近几年来基因工程的spa出现,解决了天然a蛋白的耐碱性问题,mabselect sure是基因工程的spa,去掉了天然spa的dace 区域,对于b区域进行了修饰,将不耐受naoh的氨基酸去掉。使修饰后的spa可以耐受0.1-0.5m的naoh;这就很好的解决了层析介质cip的问题,同时修饰后的spa也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对spa的作用,使洗脱收集液中spa的脱落更低。 2 结合单抗的a蛋白层析介质的选择 在a蛋白捕获步骤中主要去除的杂质大部分是hcp和基因组dna;由于a蛋白层析介质对聚体没有去除作用,所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略,例如:提高洗脱ph,加入添加剂等;在此捕获步骤中会有a蛋白(配基)的脱落。在a蛋白捕获过程中,培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基a蛋白,以及a蛋白与介质骨架的偶联方式,这些都是protein a的脱落原因,所以选择a蛋白脱落较低的层析介质是非常必要的[2]。 2.1 a蛋白层析介质相关指标 耐碱性:药物gmp生产最基本的要求是无菌、无热源。naoh 是最好的除菌、出热源的试剂。同时naoh也是公认的cip试剂,使用naoh 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质,以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命;?郧?naoh的成本低。naoh是公认的cip试剂,实验表明,naoh的清洗效果高于其他试剂,适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架(cpg)填料的清洗结果表明,盐酸胍比磷酸更为有效。cpg填料在高ph下不稳定,不适合用naoh 清洗。传统的a蛋白的清洗试剂,如:尿素,盐酸胍等的清洗试剂效果不理想,?郧以谂渲檬

低温深冷操作规范

上海纳福希阀门有限公司 指导文件 零件低温深冷处理作业规程 (A/0版) 编制: 日期: 审核: 日期: 批准: 日期: 2013年10月28日发布 2013年11月01日实施

1 目的 为了指导低温阀门制造过程中零部件进行深冷处理,以确保低温阀门性能确保符合要求。 2 适用范围 本规范规定了低温阀门零部件的深冷处理要求。低温阀门除满足常规阀门制造及检验要求外,必须满足下列要求。 3 职责 3.1 低温测试专职人员负责低温深冷处理的操作。 3.2 质量部检验员负责低温深冷处理过程的记录。 4 工作程序 4.1 处理前准备工作 4.1.1 深冷处理的零部件须在粗加工之后精加工之前进行。 4.1.2 现场工作人员要求穿戴合适有效的保温防护服饰。 4.1.3 深冷处理作业现场应清洁,通风良好,工作通道畅通。 4.1.4 工作前检查低温操作设备,确保安全装置良好。 4.2 降温介质 4.2.1 降温介质为-196℃的液氮。 4.2.2 操作时必须注意低温介质的危险性,严格遵守安全操作规程。 4.3 深冷处理 a)根据每次处理的零部件规格数量,选择合适的不锈钢筐篮将零部件放入其中,再将筐篮放入适当的低温试验槽内,连接好测温传感器,盖好试验槽盖。 b) 先打开低温试验槽上的浸液开关,再缓慢的打开液氮储罐上的放液阀,此时液氮会因压力差流入试验槽内,间断停止进液查开液位,当液氮将零部件完全浸泡即可,当温度达到-196℃时开始保温。保温时间按4.4的试验时间。

4.4 试验时间 4.5 重复试验 4.5.1 保温结束后取出零部件,等待恢复常温后即可,若根据技术协议和产品图样要求需要进行二次深冷处理的零部件再按4.3重复操作1次。 4.6 质量部检验员根据深冷处理的起止时间,做好记录。 5 相关文件(无) 6 记录 6.1 《深冷处理过程记录》

重组蛋白和多肽的分离纯化

重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理(downstream processing)阶段,这一过程又和上游过程紧密相联系,上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化,所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计,并充分考虑上游因素对下游的影响,如是否带有亲和标签,是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类,分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统,不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程,目标蛋白表达是否形成包涵体,目标蛋白表达的定位(胞内、细胞内膜、周质空间和胞外),蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤,并且由于蛋白质种类少,目标蛋白容易纯化;而在细胞质内表达蛋白,可能是可溶性表达,可能形成包涵体,可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤,而包涵体易于分离,纯度较高,但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难,需要对聚集的蛋白进行变复性,通常活性蛋白的得率比较低,表1列出了不同策略对表达、纯化的影响,对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免,如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签,有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化,并能保护目标蛋白不被降解(96)。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平,简化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平,简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生长 没有大的影响,通常可获得高的表 达水平需要体外的折叠和溶解,得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解 具有不确定的N末端 在细胞的提取物中,除了目标蛋白外,还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中,蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离,得到一定的量,达到一定的纯度,同时要尽可能保留蛋白的生物活性,并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程,总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位,而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定,对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度,并对处方有活性和稳定性的要求,对于某些酶的纯度则要求较低,需要在纯度和得率之间进行一个平衡,所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构,对于有生物活性的蛋白质,在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点,采用合适的操作条件和方法,保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期,要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质,还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素,来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠(f)和去折叠(u)间自由能的变化(ΔG f→u)来衡量,ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间,单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化,一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化,因此ΔG f→u相对比较小,这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点,所以必须克服蛋

深冷处理工艺

深冷处理工艺 随着机械工业的不断发展,对金属材料的要求也越来 越高,如何在材料以及热处理工艺既定的前提下尽量提高 金属工件的机械性能及使用寿命,这成为很多热处理行业 前沿人士思考并探索的问题。 一、问题的提出: 钢材在热处理工艺之后,其硬度及机械性能均大大提 高,但热处理后依然有残存的以下问题: 1、残余奥氏体。其比例大约有10%-20%,由于奥氏 体很不稳定,当受到外力作用或环境温度改变时,易转变 为马氏体,而奥氏体与马氏体的比容不一样,将造成材料 的不规则膨胀,降低工件的尺寸精度。 2、组织晶粒粗大,材料碳化物固溶过饱和。 3、残余内应力。热处理后的残余内应力将降低材料 的疲劳强度以及其他机械性能,在应力释放过程中且易导 致工件的变形。 二、深冷工艺的优点: 经过国内外许多金属材料研究者的不懈研究,深冷及 超深冷处理工艺被认为是解决以上问题的最优方法,其优 点如下: 1、它使硬度较低的残余奥氏体转变为较硬的、更 稳定的、耐磨性和抗热性更高的马氏体。 2、马氏体的晶界、晶界边缘、晶界内部分解、细 化,析出大量超细微的碳化物,过饱和的 马氏体在深冷的过程中,过饱和度降低,析出的超细

微碳化物,与基体保持共格关系,能使马氏体晶格畸变并减小,微观应力降低,而细小弥散的碳化物在材料塑性变形时可以阻碍位错运动,从而强化基体组织;同时由于超细微的碳化物析出,均匀分布在马氏体基体上,减弱了晶界催化作用,而基体组织的细化既减弱了杂质元素在晶界的偏聚程度,又发挥了晶界强化作用。从而使材料的综合力学性能得到三个方面的提高:材料的韧性改善,冲击韧性高,基体抗回火稳定性和抗疲劳性得到提高;耐磨损的性能得到提高;尺寸稳定性提高。从而达到了强化基体,改善热处理质量,减少回火次数,延长模具寿命的目的。 3、材料经深冷处理后内部热应力和机械应力大为降低,并且由于降温过程中使微孔或应力集中部位产生了塑性流变,而在升温过程中会在此类空位表面产生压应力,这种压应力可以大大减轻缺陷对工件局部性能的损害,从而有效地减少了金属工件产生变形、开裂的可能性。 三、深冷工艺的生产使用效果 1、高速钢冷作模具深冷处理 不同处理工艺对W6Cr5Mo4V2Co(M2)钢残留奥氏体的影响(体积百分数%) 深冷处理过程中,大量的残留奥氏体转变为马氏体,特别是过饱和的亚稳定马氏体在从-196℃至室温过程中

Protocol蛋白质纯化步骤

Protocol 蛋白质纯化方法(镍柱) 柱前操作 1.IPTG诱导后,收菌,8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer(BB)溶解(每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min(工作:5s,停止:5s),1500r/m离心10min,去除杂质; 3.取上清,12000r/m离心20min, 得包涵体; 4.用含2M尿素的BB洗包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳);??? 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳); 6.对照电泳结果,将上清或包涵体溶解液上柱; 平衡柱子(柱体积:V) 7. 3V(3倍柱体积)ddH2O(洗乙醇); 8. 5V Charge Buffer(CB); ??? 9. 3V BB; 柱层析 10.上样; 11. 10V Washing Buffer(WB); 12. 6V Elute Buffer(EB); 13.分管收集,每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑),pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素:60.06×6=360.36g

蛋白质纯化的一般原则及方法选择

随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸

非晶态合金催化剂的制备方法及应用

非晶态合金催化剂的制备方法及应用 摘要:综述了非晶态合金催化剂的制备方法,包括骤冷法、原子(离子)沉积法等,可以通过这些方法获得满足不同催化反应所需要的非晶态合金催化剂。简单介绍了非晶态合金催化剂在CO、CO2、烯烃、炔烃、苯或含氮化合物等的加氢反应中的应用。分析了非晶态合金催化剂制备和应用的特点,并展望其发展前景。关键词:非晶态合金催化剂制备方法应用 A general review of processing methods and applications of amorphous alloy catalysts Abstract: In this review article, processing methods of the amorphous alloy catalysts are introduced, including rapid quenching method, chemical reduction method and impregnation-chemical reduction method., thought which acquired various amorphous adjusting to different reactions. Made a brief introduction of the application in hydrogenation and dehydrogenation reaction and so on. Analyzed the characteristics of preparation and application of amorphous alloy catalysts and the application foreground are prognosticated. Key words: amorphous alloy, catalyst, processing method, applications 1.引言 非晶态合金,又称为“金属玻璃”,是一类具有长程无序、短程有序结构特点的材料[1-2]。非晶态合金以金属键作为其结构特征,虽然不是长程有序,但在几个晶格常数范围内保持短程有序。自从1934年用蒸发沉积法制备出非晶态合金以来,对于非晶态合金的合成与应用研究获得了飞速发展。由于它具有独特的电磁性能、机械性能和耐磨性能,在配电设备、电动机、电磁传感器等电力设备上得到了广泛的应用。此外,由于非晶态合金具有独特的结构,它在催化领域也表现出优异的性能。自从1980年Smith G V 发表第一篇关于非晶态合金催化剂的研究报告以来,得到了国内外许多催化剂研究者的广泛亲睐[3]。 非晶态合金引起催化工作者的兴趣是因为它具有以下特点[4]:第一,非晶态合金在很宽的范围内可以制成各种组成的样品,从而可以在较宽大范围内调变它们的电子性质;第二,催化活性中心可以以单一的形式均匀分布在化学均匀的环境中;第三,非晶态合金表面具有浓度较高的不饱和中心,且不饱和中心的配位数具有一定的范围,因而使其催化活性和选择性一般优于相应的晶态催化剂;第四,其表面的非多孔性是其摆脱了多项催化剂存在的反应物种的扩散影响表面反应的问题。非晶态合金催化剂是将来有望开发的一种高效、环境友好的新型催化

深冷处理原理及其在工业上的应用

深冷处理原理及其在工业上的应用 班级: 热能12-2 姓名:黄靖 学号: 120123206067

深冷处理,又称超低温处理(SSZ),是指在以液氮为制冷剂、-l30C以下对材料进行处理的方法而达到给材料改性的目的。它是常规冷处理(CSZ)的一种延伸,其英文名称为Cryogenictreatment,是一种从上世纪中期开始广泛应用于工业生产的一种新工艺[l]。现有研究表明,深冷处理不仅可以显著提高黑色金属、有色金属、金属合金、碳化物、塑料(包括尼龙,泰弗龙)、硅酸盐等材料的力学性能和使用寿命,稳定尺寸,改善均匀性,减小变形,而且操作简便、不破坏工件、无污染、成本低。具有可观的经济效益和市场前景. 1.1深冷处理工艺简介 深冷处理的设备一般用于普通冷处理(0~-l00C)的设备,通常用干冰,氨(或甲醇)和氟里昂压缩机来制冷。也有用液氧制冷的,如l965年山西机床厂研制的液氧冷处理设备,使用温度为-80~-l00C,最低可以达到-l35C。至于深冷处理有采用压缩空气来致冷的,如杭州制氧机研究所的大型轧辊深冷设备最低使用温度为-l30C和航空航天部青云仪器厂的空气涡轮深冷机等最低使用温度为-l60C。最常用的深冷设备都采用液氮致冷,它既经济又方便,一般用液氮深冷罐来存储液氮。国内外众多学者和厂家研制了多种气体制冷的液氮深冷设备,其中天津市热处理研究所于l989年研制的液氮汽化型深冷箱,温度调节范围为常温至-l80C,液氮消耗量为每千克工件0.7kg液氮。华中理工大学于93年研制的嵌套式深冷设备采用了双重致冷方式,即外层箱机械致冷至-l8~-24C,内层箱采用液氮制冷至-l50C,温度偏差为3C以内。中科院低温技术 实验中心于96年研制的深井式冷处理装置,最低工作温度为-l00C,温度偏差为2C以内,升、降温速率为5~40C/1,不仅可调节还可以自动控制。此外国内也有一些从国外引进的深冷处理设备,如宝钢双频淬火车间引进的轧辊深冷装置,采用液氮制冷,最低温度可达-l80C以下。在美国,六七十年代出现了许多液氮气体法的深冷设备,如BOC公司的Ellenite设备,可以均匀的冷却,精确控温。且可以在-l50C保温。八十年代以来,出现了电脑控制升降温和处理飞机机翼的大型液氮深冷设备,如Cosmos公司的CI系列带电脑控制的深冷设备。采用固化的程序严格控制升温降温速度,可实现-l90C下的长时超低温保温。工件处理周期为40~721。表l为各种冷处理设备的主要性能对比表。 1.2深冷处理的制度 深冷处理根据制冷剂使用方法的不同可以分为液体法和气体法,但前者因为冷却温度较高(-l50C),且具有热冲击性容易导致某些脆性部件的断裂,现在已经不大采用,而气体法则因为冷却温度低(-l96C)也没有热冲击性而得到广泛采用。关于深冷处理工艺参数中的升降温速度、保温时间、深冷处理次数和是否采用回火工艺以及回火工艺和深冷处理工艺顺序的关系,由于研究的结果不同,至今尚未有一个统一的认识,但一般认为适当地控制升降温速度(缓慢升降温)对于材料的深冷处理效果为佳。而保温时间和相关回火工艺的问题则与所要进行深冷的材料本身有关,如材料本身体积越大,导热性越差以及组织的稳定性越好则所需的保温时间越长;而对于受冲击载荷较大、易弯曲载荷的模具,应采用淬火+回火一次+深冷+回火一次的处理工艺,对于要求高硬度、动载荷较小的模具材料采用淬火+深冷+回火一次的工艺较佳.

非晶合金的制备方法

纳米非晶合金制备简介 摘要:本文主要介绍了国内外几种非晶合金制备技术,其中包括水淬法、射流成型法、金属模铸造、复合爆炸焊接法及机械合金化法、粉末固结成形法等,并对各种制备技术的进行了比较分析。 关键词:块体金属玻璃块体金属玻璃的连接制备 Introduction of the Preparation amorphous alloy Abstract:In this paper, Several fabricating methods of bulk metallic glass matrix composites from both home and abroad were presented,such as water quenching method, jet molding, metal mold casting, composite explosive welding and mechanical alloying, powder consolidation and forming method,than Analysis and comparing these preparation techniques bulk metallic glass. Key words: bulk metallic glass, joining of bulk metallic glass, preparation 1.引言 非晶态合金也称金属玻璃,与晶态合金相比,其三维空间的原子排列呈拓扑无序状,结构上没有晶界与堆垛层错等缺陷存在,但原子的排列也不像理想气体那样的完全无序。非晶合金是以金属键作为其结构特征,虽然不存在长程有序,但在几个晶格常数范围内保持短程有序[1]。与非晶聚合物及无机非晶材料一样,非晶合金在物理性能、化学性能及力学性能方面是各向同性的,并随着温度的变化呈现连续性[2]。通常其具有以下四个基本特征:(1)结构上呈拓扑密堆长程无序,但在长程无序的三维空间又无序的分布着短程有序的“晶态小集团”或“伪晶核”,其大小不超过几个晶格的范围;(2)不存在晶界、位错、层错等晶体缺陷;(3)具有非晶体的一般特性:物理、化学和机械性能各向同性;(4)热力学上处于亚稳态,当处于晶化温度以上时将发生晶态结构相变,但晶化温度以下能长期稳定存在[3]。 美国加州理工学院的Duwez教授是研究非晶合金最早的一个人,于1960年首次采用 快淬方法制得Au 70Si 30 非晶合金薄带[4][5]。1969年,Pond等[6]制备出具有一定宽度的连续 薄带状非晶合金,为大规模生产非晶合金提供了条件。至此为止,非晶合金材料由于受到冷却速度的限制,为保证热量快速散出,制得的非晶合金为薄带、薄片、细丝或粉末等。由于形状的限制,非晶合金材料的许多优良特性无法在实际应用中得到发挥,人们希望得到可与晶态合金相比拟的大尺寸非晶合金,因此,随后很多人投入到开发新的制备非晶合金的方法中去,发明了许多固相非晶化技术,如机械合金化、离子束注入、氢吸收等。1974年,贝尔实验室的H. S. Chen[7]发表文章指出原子尺寸和混合热对玻璃合

蛋白纯化层析柱

蛋白纯化层析柱 2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数:1164 网友评论 0 条 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业,小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年,但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的,经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是... 关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业,小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年,但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的,经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration,GF),离子交换层析技术(ion exchange,IEX),羟基磷灰石层析(hydroxyapatite,HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction,HI),以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography,HPLC)。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言,从哪儿下手也许是令人头疼的一件事,但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道,通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步: 捕获——从细胞其它成份,比如DNA和RNA中分离需要的蛋白; 区分——从与目的蛋白具有相近的大小,或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白; 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2.1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果,在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2.2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来,毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想办法脱盐,可用的方法有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液,并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达到平衡,若增加对蛋白溶液的压力,还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱,柱内的填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流出,从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失,缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上,剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2.3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用,通过选择不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂(能结合带负电荷的分子)结合,也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种:二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂;羧甲基用于弱的阳离子交换树脂;季铵用于强阴离子交换树脂;甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成,氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH(pH6~8)下带负电荷,需用阴离子交换柱纯化,极端的pH下蛋白会变性失活.应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同,与树脂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值,因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制,所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比,离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较便宜。值得一提的是,即便是用最精确控制的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,还需要其他的纯化步骤。

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段:目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段:目标是除去大多数大量杂质,如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段:除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法:蛋白质的性质方法电荷(等电点)离子交换(IEX)分子量凝胶过滤(GF)疏水性疏水(HIC)反相(RPC)特异性结合亲和(AC)每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率:由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说,当杂质和目标蛋白性质相似时,在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量:一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度:在初纯化中是重要因素,此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率:随着纯化的进行渐趋重要,因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表:技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率(使用Supedex)样品体积(<总柱体积的5%)和流速范围有限制缓冲液更换(如果需要)样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中,有损失生物活性的风险提示:1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少,以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法,所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法(IEX、 HIC、 AC)后使用,凝胶过滤对上样体积有限制,但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或/和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下,可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下,可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注:应该指出,三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要:蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质,综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异,利用一种同时多种性质差异,在兼顾收率和纯度的情况下,选择蛋白质提纯的方法。 关键词:蛋白质分离纯化 前言: 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务,到目前为止,还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来,但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

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