什么叫色谱,气相色谱仪,液相色谱仪,气质,液质联用仪

第一课色谱法概述

色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些物质在

两相中进行多次反复分配而实现分离。在色谱技术中，流动相为气体的叫气相色谱，流动相为液体的叫液相色谱。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。

根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪，目前，主要有气相色谱仪和液相色谱仪。色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特。1905年，他将从植物

色素提取的石油醚提取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石

油醚淋洗，结果使不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名。这就是最初的色谱法。后来，用色谱法分析的物质已极少为有色物质，但色谱一词仍沿用至今，在50年代，色谱法有了很大的发

展。1952年，詹姆斯和马丁以气体作为流动相分析了脂肪酸同系物并提

出了塔板理论。1956年范第姆特总结了前人的经验，提出了反映载气流

速和柱效关系的范笨姆特方程，建立了初步的色谱理论。同年，高莱(Golay)发明了毛细管拄，以后又相继发明了各种检测器，使色谱技术更加完善。

50年代末期，出现了气相色谱和质谱联用的仪器，克服了气相色谱不适

于定性的缺点。则年代，由于检测技术的提高和高压泵的出现，高效液相色谱迅远发展，使得色谱法的应用范围大大扩展。目前，由于高效能的色谱往、高灵敏的检测器及微处理机的使用，使得色谱法已成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析仪器。

在这里主要介绍气相色谱分析法。同时也适当介绍液相色谱法。气相色谱法的基本理论和定性定量方法也适用于液相色谱法。其不同之处在液相

色谱法中介绍。

第二课气相色谱仪

典型的气相色谱仪具有稳定流量的载气，将汽化的样品由汽化室

带入色谱柱，在色谱柱中不同组分得到分离，并先后从色谱柱中流出，

经过检测器和记录器，这些被分开的组分成为一个一个的色谱峰。色

谱仪通常由下列五个部分组成:

载气系统（包括气源和流量的调节与测量元件等）

进样系统（包括进样装置和汽化室两部分）

1.分离系统（主要是色谱柱）

2.检测、记录系统（包括检测器和记录器）

3.辅助系统（包括温控系统、数据处理系统等）

第三课气相色谱仪－载气系统

载气通常为氮、氢和氢气，由高压气瓶供给。由高压气瓶出来

的载气需经过装有活性炭或分子筛的净化器，以除去载气中的

水、氧等有害杂质。由于载气流速的变化会引起保留值和检测灵敏度的变化，因此，一般采用稳压阀、稳流阀或自动流量控制装置，以确保流量恒定。载气气路有单柱单气路和双柱双气路两种。前者比较简单，后者可以补偿因固定液流失、温度被动所造成的影响，因而基线比较稳定。

第四课气相色谱仪－进样系统

进样系统包括进样装置和汽化室。气体样品可以用注射

进样，也可以用定量阀进样。液体样品用微量注射器进样。固体样品则要溶解后用微量注射器进样。样品进入汽化室

后在一瞬间就被汽化，然后随载气进入色谱柱。根据分析样品的不同，汽化室温度可以在50一400℃范围内任意设定。通常，汽化室的温度要比使用的最高柱温高 10一50℃以保证样品全部汽化。进洋量和进样速度会影响色谱柱效率。

进样量过大造成色谱柱超负荷，进样速度慢会使色谱峰加宽，影响分离效果。

第五课气相色谱仪－分离系统

色谱柱是色谱仪的分离系统。试样中各组分的分离在色谱

柱中进行，因此，色谱柱是色谱仪的核心部分。色谱往

主要有两类：填充柱和毛细管柱，现分别叙述如下:

1．填充柱

填充柱由柱管和固定相组成，柱管材料为不锈钢或玻璃，

内径为2—4毫米，长为1—3米。往内装有固定相，固定相又包括固体固定相和液体固定相两种。

2．毛细管往

毛细管柱又叫空心柱，空心柱分涂壁空心柱，多孔层空心柱和涂载体空心柱。涂壁空心柱是将固定液均匀地涂在内径0．1—0．5毫米的毛钢管内壁而成。毛细管的材料可以是不锈钢、玻璃或石英。这种色谱柱具有渗透性好、传质阻力小等特点，因此柱子可以做得很长(一般

几十米，最长可到三百米)。和填充柱相比，其分离效率高，分析速度快,样品用量小。其缺点是样品负荷量小，因此经常需要采用分流技术。柱的制备方法也比较复杂；多孔层空心柱是在毛细管内壁适当沉积上一层多孔性物质，然后涂上固定液。这种柱容量比较大，渗透性好，故有稳定、高效、决速等优点。

第六课气相色谱仪－检测系统

1．热导检测器热导检测器

( Thermal coductivity detector，简称 TCD )，是应用比较多的检测器，不论对有机物还是无机气体都有响应。热导检测器由热导池池体和热敏元件组成。热敏元件是两根电阻值完全相同的金属丝(钨丝或白金丝)，作为两个臂接入惠斯顿电桥中，由恒定的电流加热。如果热导池只有载气通过，载气从两个热敏元件带走的热量相同，两个热敏元件的温度变化是相同的，其电阻值变化也相同，电桥处于平衡状态。如果样品混在载气中通过测量池，由于样号气和载气协热导系数不同，两边带走的热量不相等，热敏元件的温度和阻值也就不同，从而使得电桥失去平衡，记录器上就有信号产生。这种检测器是一种通用型检测器。被测物质与载气的热导系数相差愈大，灵敏度也就愈高。此外，载气流量和热丝温度对灵敏度也有较大的影响。热丝工作电流增加—倍可

使灵敏度提高3—7倍，但是热丝电流过高会造成基线不

稳和缩短热丝的寿命。

热导检测器结构简单、稳定性好，对有机物和无

机气体都能进行分析，其缺点是灵敏度低。

2．氢火焰离子化检测器

氢火焰离子化检测器(Flame Ionization Detector，FID)

简称氢焰检测器。它的主要部件是一个用不锈钢制成的

离子室。离子室由收集极、极化极(发射极)、气体入口

及火焰喷嘴组成。在离子室下部，氢气与载气混合后通

过喷嘴，再与空气混合点火燃烧，形成氢火焰。无样品

时两极间离子很少，当有机物进入火焰时，发生离子化

反应，生成许多离子。在火焰上方收集极和极化极所形

成的静电场作用下，离子流向收集极形成离子流。离子

流经放大、记录即得色谱峰。

有机物在氢火焰中离子化反应的过程如下：当氢和空气

燃烧时，进入火焰的有机物发生高温裂解和氧化反应生

成自由基，自由基又与氧作用产生离子。

在外加电压作用下，这些离子形成离子流，经放大后被

记录下来。所产生的离子数与单位时间内进入火焰的碳

原子质量有关，因此，氢焰检测器是一种质量型检测器。这种检测器对绝大多数有机物都有响应，其灵敏度比热

导检测器要高几个数量级，易进行痕量有机物分析。其

缺点是不能检测惰性气体、空气、水、C0，CO2、NO、

S02及H2S等。

3．电子捕获检测器

电子捕获检测器是一种选择性很强的检测器，它只对合

有电负性元素的组分产生响应，因此，这种检测器适于

分析合有卤素、硫、磷、氮、氧等元素的物质。在电子

捕获检测器内一端有一个多放射源作为负极，另一端有

一正极。两极间加适当电压。当载气(N2)进入检测器时，受多射线的辐照发生电离，生成的正离子和电子分别向

负极和正极移动，形成恒定的基流。合有电负性元素的

样品AB进入检测器后，就会捕获电子而生成稳定的负离子，生成的负离子又与载气正离子复合。结果导致基流

下降。因此，样品经过检测器，会产生一系列的倒峰。

电子捕获检测器是常用的检测器之一，其灵敏度高，选

择性好。主要缺点是线性范围较窄。

第七课液相色谱仪

气相色谱法是一种很好的分离、分析方法，它具有分析

速度快、分离效能好和灵敏度高等优点。但是气相色

谱仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质。据估计，在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物

约占15％，加上制成衍生物的化合物，也不过20％左右。对于高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物、离子

型化合物及高聚物等，很难用气相色谱法分析。为解决

这个问题，70年代初发展了高效液相色谱。高效液相色

谱的原理与经典液相色谱相同，但是它采用了高效色谱拄、高压泵和高灵敏度检测器。因此，高效液相色谱的分离效率、分析速度和灵敏度大大提高。就其分离机理的不同，高效液相色谱可以分为液－固吸附色谱、

液－液分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱四类。液—固色谱的色谱柱内填充固体吸附剂，由于不同组分具有不同的吸附能力，因此，流动相带着被测组分经过色谱柱时，各组分被分开。液—液色谱的流动相和固定相都是液体。作为固定相的液体涂在惰性担体上，流动相与固定液不互溶。当带有被测组分的流动相进入色谱柱时，组分在两相间很快达分配平衡，由于各

组分在两相间分配系数不同而彼此分离。以非极性溶

液作流动相，极性物质作固定相的液—液色谱叫正相

色谱；极性溶液作流动相，非极性物质作固定相的液—液色谱叫反相色谱。离子交换色谱的色谱柱内填充离子交换树脂，依靠样品离子交换能力的差别实现分离。而凝胶色谱是按试样中分子大小的不同来进行分

离的。在上述四类色谱中，应用最广泛的是液—液色谱，因此，在本节的讨论中以液—液色谱为主。高

效液相色谱的基本理论和定性定量分析方法与气相色

谱基本相同。高效液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。

第八课液相色谱仪－输液系统

输液系统

高效液相色谱的输液系统包括流动相贮存器、高压泵和梯度淋洗装置。流动相贮存器为不锈钢或玻璃制成的容器，可以贮存不同的流动相。高压泵是高效液相色谱仪最重要的部件之一。由于高效液相色谱仪所用色谱柱直径细，固定相粒度小，流动相阻力大，因此，必须借助于高压泵使流动相以较快的速度流过色谱这。高压泵需要满足以下条件：能提供150－450kg/cm2的压强；流速

稳定，流量可以调节；耐腐蚀。目前所用的高压泵有机械泵和气动放大泵两种。

梯度淋洗装置可以将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以达到提高分离效果，缩短分离时间的目的。它的作用与气相色谱中的程序升温装置类似。

梯度淋洗装置分为两类：一类叫外梯度装置；一类内梯度装置。外梯度装置是流动相在常压下混合，靠一台高压泵压至色谱柱；内梯度装置是先将溶剂分别增压后，再由泵按程序压入混合室，再注入色谱柱。

第九课液相色谱仪－进样系统，分离系统

进样系统

一般高效液相色谱多采用六通阀进样。先由注射器将样品常压下注入样品环。然后切换阀门到进样位置，由高压泵输送的流动相将样品送人色谱柱。样品环的容积

是固定的，因此进样重复性好。

分离系统

分离系统包括色谱柱、连接管、恒温器等。色谱柱是高

效液相色谱仪的心脏。它是由内部抛光的不锈钢管制成，一般长10—50cm，内径2—5mm，柱内装有固定相。液相色谱的固定相是将固定该涂在担体上而成。担体有两类：一类是表面多孔型担体；另一类是全多孔型担体。

近年来又出现了全多孔型微粒担体。这种担体检度为5 —10 um，是由nm级的硅胶微粒堆积而成，又叫堆积硅珠。由于颗粒小，所以柱效高，是目前最广泛使用的一

种担体。在高效液相色谱分析中，适当提高柱温可改善传质，提高桂效，缩短分析时间。因此，在分析时可以采用带有恒温加热系统的金属夹套来保持色谱拄的温度。温度可以在室温到60℃间调节。

第十课液相色谱仪－检测系统

检测系统

高效液相色谱的检测器很多，最常用的有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。

(1)紫外检测器

紫外检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，适用有紫外吸收物质的检测。在进行高效液相色谱分析的样品中，约有80％的样品可以使用这种检测器。紫外检测器的工作原理如下：由光源产生波长连续可调的紫外光或可见光，

经过透镜和遮光板变成两束平行光，无样品通过时，参比池和样品池通过的光强度相等，光电管输出相同，无信号产生；有样品通过时，由于样品对光的吸收，参比池和样品池通过的光强度不相等，有信号产生。根据朗伯—比尔定律，样品浓度越大，产生的信号越大，这种检测器灵敏度高，检测下限约为 10(-10) g／ml，而且线性范围广，对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱。

(2)示差折光检测器

示差折光检测器是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的。凡是具有与流动相折射率不同的组分，均可

以使用这种检测器。如果流动相选择适当，可以检测所

有的样品组分。示差折光检测器分为反射式和沂射式两种。反射式示差折光检测器是根据下述原理制成的：光在两种不同物质界面的反射百分率与入射角和两种物质的折射率成正比。如果入射角固定，光线反射百分率仅与这两种物质的沂射率成正比。光通过仅有流动相的参比池时，由于流动相组成不变，故其折射率是固定的；光通过工作池时，由于存在待测组分而使折射串改变，从而引起光强度的变化，测量光强度的变化，即可测出该组分浓度的变化。偏转式示差折光检测器是根据下述原理：当一束光透过折射率不同的两种物质时，此光束会发生一定程度的偏转，其偏转程度正比于两物质折射率之差。示差折光检测器

的优点是通用性强，操作简便；缺点是灵敏度低，最小检出限约为 10(-7)g/ml ，不能做痕量分析。此外，由于

洗脱液组成的变化会使折射率变化很大，因此，这种检测

器也不适用于梯度洗脱。

(3)荧光检测器

物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光

波长较长的光，这种光称为荧光。在其他条件一定的情况

下，荧光强度与物质的浓度成正比。许多有机化合物具有天

然荧光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反应法或柱前

反应法加入荧光化试剂，使其转化为具有荧光活性的衍生物

。在紫外光激发下，荧光活性物质产生荧光，由光电倍增管

转变为电信号。荧光检测器是一种选择性检测器，它适合于

稠环芳烃、氨基酸、胺类、维生素、蛋白质等荧光物质的测定。这种检测器灵敏度非常高，其检出限可达10(-12)_10 (-13)g/ml，比紫外检测器高2—3个数量级，适合于痕量分析。而且可以用于梯度洗脱。其缺点是适用范围有一定的局限性。第十一课离子色谱法

离子色谱法

离子色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术测定溶液中

阴离子和阳离子的一种分析方法。离子色谱是液相色谱的一种。

离子色谱是利用不同离子对固定相亲合力的差别来实现

分离的。离子色谱的固定相是离子交换树脂，离子交换树脂

是苯乙烯- 二乙烯基苯的共聚物。树脂核外是一层可离解的

无机基团，由于可离解基团的不同，离子交换树脂又分为阳

离子交换树脂和阴离子交换树脂。当流动相将样品带到分离

柱时，由于样品离子对离子交换树脂的相对亲合能力不同而

得到分离，由分离柱流出的各种不同离子，经检测器检测，

即可得到一个个色谱峰。然后用通常的色谱定性定量方法进

行定性定量分析.

离子色谱法是进行离子测定的快速、灵敏、选择性好的

方法，它可以同时检测多种离子.

特别是对阴离子的测定更是其他方法所不能相比的。

如果说高频感应等离子光谱是同时测定多种元素的快速、

准确的分析方法，那么，同时测定多种阴离子的快速、灵敏

的方法便是离子色谱法了。

离子色谱自1975年问世以来，已经得到了飞快的发展，

并且引起了分析工作者的广泛注意

。目前，离子色谱法已经在能源、环境、冶金、电镀、半导体、水文地质等方面广泛应用，并且开始进入了与生命科学

有关的分析领域。我国从80年代初期引进离子色谱仪，开始了离子色谱的应用研究工作，同时也开始了仪器的研制，目

前已能生产离子色谱仪。随着离子色谱技术的发展，离于色

谱仪在我国的应用将日益普及。

一。离子色谱的工作原理

（1）离子交换平衡

离子色谱中使用的固定相是离子交换树脂。离子交换

树脂上分布有固定的带电荷的基团和

能游动的配位离子。当样品加入离子交换色谱往后，如果用

适当的溶液洗脱，样品离子即与树脂上能游动的离子进行交换，并且连续进行可逆交换吸附和解吸，最后达到吸附平衡。

（2）化学抑制型离子色谱工作原理

待测样品由流动相带入分离柱，由分离柱将不同离子

分开，由检测器得色谱峰。但是，用

于离子色谱的洗脱液，一般都是强电解质溶液，其电导值

一般较待测离子高2—3个数量级，如果用电导检测器检测

待测离子，待测离子信号将完全被洗脱液所淹没。为了解

决这一问题，采取（未完待续）

第十二课气质联用

色谱法是有机物的有效分离分析方法，特别适用于进行有机物的定量分析，但定性分析比较困难。质谱法擅长定性分析，但对复杂的有机混合物分析则无能为力。如果把二者结合起来，则能发挥两种仪器各自的优点。因此，目前所有的质谱仪都与气相色谱相连。组成气相色谱－质谱联用(GC—MS)系统。

该技术是在50年代后期开始研究的。到60年代后期

已经成熟并出现了商品仪器。色谱仪是在常压下工作，而质谱仪是在高真空下工作，因此，必须有一个连接装置，将色谱流出的载气去掉，使压强降低，样品气进入离子源。这个连接装置叫分子分离器。目前一般使用喷射式分子分离器，样品气和载气(He)一起由色谱柱流出进入分子分离器。由于载气分子量小，扩散快；经过喷咀后，很快扩散开并被抽走。样品气分子量大，扩散慢，依靠惯性进入质谱仪。这样，经过分子分离器后，压强由常压降到10(-2)Pa，载气被抽除，实现了载气和样品气的分离。如果色谱仪使用毛细管柱，由于毛细管柱流量很小，可以不必经过分子分离器而直接进入离子源。这样，混合物样品由色谱仪一个一个分开，由质谱仪一个一个鉴定，并且根据需要由数据系统进行数据处理，快速地得到各种信息。因此，GC—MS系统已成为有机物分析的重要工具。

第十三课液质联用

对于热稳定性差或不易汽化的样品，使用GC—MS有一定的困难。因此，近年来又发展了液相色谱—质谱(LC—MS)联用技术。LC和MS连接的主要问题是如何去除溶剂。目前应用较多的接口装置有传送带式和热喷雾式两种。

传送带接口是依靠不锈钢或高聚物的传送带将样品送入

离子源。在传送过程中，溶剂被加热汽化并用泵抽走，

样品在离子源汽化并电离,这种接口适用于非极性溶剂。对于极性溶剂，由于汽化慢，需要分流，因而样品利

用率低，影响了整个系统的灵敏度。热喷雾接口是80 年代发展起来的新的接口装置。这种装置包括汽化器、

电窝室和抽气系统三部分。汽化器是一根金属毛细管

，内径约0．15mm,毛细管采用直接电加热法加热。电

离室有发射电子的灯丝和放电电离装置。抽气系统主要

是一个机械泵，有的加冷阱，目的为了捕集溶剂。热

喷雾接口的电离方式有三种：直接热喷雾电离、放电

电离和电子束电离。热喷雾电离是在流动相中加入电

解质(如醋酸铵)，当流动相通过加热的汽化器后，以接

近汽化(或部分汽化)的状态从毛细管喷出，形成合有

细微雾滴的气流，因为溶液中合有电解质，溶液中就

含有一定量的离子，微小雾滴因而带电。随着雾滴的

不断蒸发变小，形成局部强电场，发生场解吸电离。

场解吸电离生成的溶剂离子和样品离子还可以通过离

子分子反应生成新的离子。此外，还可以利用放电电

离和电子束使热喷雾气流产生化学电离。先使溶剂分

子电离，然后与样品分子反应生成样品离子。电离生

成的离子进入分析器，溶剂气体由抽气系统抽出。热

喷雾方式的特点：

(1)直接热喷雾电离产生的样品离子一般为质子化的离

子或所加阳离子与样品分子的合成离子，如(M十H)+，(M十NH4)+等。这种电离方式比化学电离温和，谱图往

往有较强的准分子离子。因而更适用于难汽化和热不

稳定样品的分子；

(2)能满足一船液相色谱流量要求，100%的水也能分析；

(3)有良好的色谱分辨率，灵敏度等于或优于传送带方式；

(4)需加入电解质，操作麻烦，结构信息少，适合于四

极质谱而不适合于磁质谱。

以上两种联接装置，虽然使液相色谱和质谱的联

用成为可能，但都有不足之处。目前正在发展中的超

临界流体色谱(SFC)和质谱(MS)联用，可能是对难挥发、易分解物质进行联用分析最有前途的方法。

第十四课质－质联用

质谱—质谱联用

80年代初，在传统的质谱仪基础上，发展了质谱—

质语(MS—MS)联用技术。它和GC—MS不同， GC—MS是依靠GC将混合物分离，然后由MS定性。而MS—MS则是依靠第一级MS分离出特定的离子，经过碰撞活化后，再依靠

第二级MS进行定性分析。质谱—质谱联用方式很多，既

有磁式质谱—质谱联用，如BEB型、EBE型、BEBE型(B：磁分析器，E：静电分析器)，又有四极质谱—质谱联用

，如QQQ型(Q：四极场)，也有混合质谱项谱联用，如EB QQ型。无论哪种类型的联用，都采用了碰撞诱导分解(CID)技术。质谱—质谱联用技术对于有机物结构研究

是非常有用的。利用它可以进行于离子扫描、母离子

扫描以及中性丢失扫描。子离子扫描可以用来研究某个

化合物的结构；母离子扫描则用以研究一组相关的化合物；而中性丢失扫描。可以在复杂的混合物中，寻找县

有相同官能团的系列化合物。同时，采用MS—MS技术还

可以直接进行混合有机物的分析。由第一级MS选择复杂

混合物中的特定离子，碰撞活化后由第二级MS定性测定

。另外，对于分子量大的热不稳定的化合物，可以利用

场解吸—质谱—质谱(FD—MS—MS)或快原于轰击—质谱—质谱(FAB—MS—MS)联用方法，充分发挥MS—MS联用的优势。

HPLC培训教程作者：阿飞更新时间：2003-12-9

高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：

方法项目

数量

1985年版1990年版1995年版2000年版

HPLC法

鉴别934150检查1240160含量测定760117387

鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I．概论

一、液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。

二、HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点：

高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。

高速——流速为0.1~10.0 ml/min。

高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

三、色谱法分类

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。

按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。）

按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。

四、色谱分离原理

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的

组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如

C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相

色谱法(RPC)。

正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最

为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品

柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法

固定相极性高～中中～低

流动相极性低～中中～高

组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。

3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH

值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

5．排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

被分离组分在柱中的洗脱原理

II．基本概念和理论

一、基本概念和术语

1．色谱图和峰参数

?色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。

?基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

?噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

?漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

?色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。

不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。

?拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。

?峰底——基线上峰的起点至终点的距离。

?峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。

?峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ

?半峰宽(peak width at half-height，W h/2)——峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ

?标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽

之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

?峰面积(peak area，A)——峰与峰底所包围的面积。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 W h/2 h

2．定性参数（保留值）

?死时间(dead time，t0)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

?死体积(dead volume，V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，V m）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有V m参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）

?保留时间(retention time，t R)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

?保留体积(retention volume，V R)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。V R＝F×t R

?调整保留时间(adjusted retention time，t'R)——扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或t R）可用于定性。t'R＝t R－t0

?调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)——扣除死体积后的保留体积。

V'R＝V R－V0或V'R＝F×t'R

3．柱效参数

?理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。

N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：

N＝()2＝16()2＝5.54()2

N为常量时，W随t R成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N

有效或N eff)。

?理论塔板高度(theoretical plate height，H)——每单位柱长的方差。H＝。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H＝，H

＝。

有效

4．相平衡参数

?分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K＝。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（C s、C m 很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。

在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

?容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。k＝。因此容量因子也称质量分配系数。

分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积V s、V m无关；k除了与性质及温度有关外，还与V s、V m有关。由于t'R、t0较V s、V m易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

?选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。

α＝＝（设k2＞k1）。因k＝t'R/t0，则α＝，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。

要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

5．分离参数

?分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R＝。当W1＝W2时，R＝。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。

R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。

?基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有如下关系：

R＝××