东亚三角涡虫胰蛋白酶 Djtry 的表达和酶活分析
HEREDITAS (Beijing) 2012年5月, 34(5): 609―614 ISSN 0253-9772 https://www.360docs.net/doc/2412977917.html,
研究报告
收稿日期: 2011?10?03; 修回日期: 2011?11?21
基金项目:国家自然科学基金项目(编号：31172074)和山东省自然科学基金项目(编号：ZR2009DM029)资助
作者简介:周鲁明, 硕士研究生, 专业方向：发育与进化生物学。Tel: 0533-*******; E-mail: zhouluming@https://www.360docs.net/doc/2412977917.html,
通讯作者:赵博生, 教授, 博士, 研究方向：发育与进化生物学。E-mail: zhaobosheng@https://www.360docs.net/doc/2412977917.html,
网络出版时间: 2012-3-16 02:50:48
URL: https://www.360docs.net/doc/2412977917.html,/kcms/detail/11.1913.R.20120316.1450.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.00609
东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry 的表达和酶活分析
周鲁明, 刘殿辰, 孙欢欢, 赵博生
山东理工大学生命科学学院发育与进化生物学实验室, 淄博 255049
摘要: 通过对东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry 氨基酸序列比对分析, 发现保守的催化三联体结构中第一位的His
被Lys 所取代。为了探究这种突变是否会对胰蛋白酶的活性有影响, 文章构建了原核表达重组质粒pET-28a- Djtry, 转化到 E.coli BL21中, 利用IPTG 诱导表达, 对表达的重组蛋白进行变性、复性、纯化以及Western blotting 鉴定, 获得成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品, 胰蛋白酶特异性底物BAEE, 检测Djtry 酶活力与比活力。SDS-PAGE 电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体, 分子量约为26 kDa, Western blotting 结果显示为目的蛋白, 对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现, 突变型胰蛋白酶Djtry 仍然保持了胰蛋白酶催化性质, 但是催化活性相对较弱。
关键词: 东亚三角涡虫; 胰蛋白酶; 蛋白表达; 酶活
Expression and enzyme activity analysis of Djtry in planarian Duge-sia japonica
ZHOU Lu-Ming, LIU Dian-Chen, SUN Huan-Huan, ZHAO Bo-Sheng
Laboratory of Developmental and Evolutionary Biology , School of Life Sciences , Shandong University of Technology , Zibo 255049, China
Abstract: The cDNA Djtry , encoding a planarian trypsin, was identified from the cDNA library of Dugesia japonica . Multiple alignment analysis showed that the Tryps_SPc domain contained the incompletely conserved catalytic triad in which the first amino acid His was substituted by Lys. Phylogenetic analysis indicateed that Djtry protein falls at the base of other animal trypsins. The Djtry cDNA was cloned into a bacterial vector pET-28a and was transferred into E. coli BL21. The His-tagged Djtry fusion protein expression was induced by IPTG . SDS-PAGE analysis revealed that the Djtry was ex-pressed as inclusion bodies in E. coli BL21 with the estimated molecular weight of approximately 26 kDa. Western blotting with His-tag antibody showed that the antibody was reacted with the fusion protein after refolding. Compared to bovine trypsin using BAEE as special substrate of trypsin, the enzyme activity of Djtry was measured. These results indicate that Djtry represents the archetype of animal trypsins, and this type of mutational trypsin Djtry still performs the trypsin nature with slightly weaker activity.
Keywords: Dugesia japonica ; trysin; protein expression; enzyme activity
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胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(Trypsin-like serine protease, Tryps_SPc)作为丝氨酸蛋白酶家族中的一员广泛存在于生物有机体中, 发挥着食物消化[1]、血液凝结[2]、抗菌肽的合成[3, 4]、黑色素形成[5]以及补体激活[6]等重要的生理功能。这一类蛋白家族成员通常具有一个保守的催化三联体结构：His(H)、Asp(D)和Ser(S), 从而形成它的活性部位, 选择性催化底物蛋白形成具有碱性氨基酸C末端的产物[7]。其催化中心的3个主要残基中有2个(His57和Asp102)位于N端结构域, 最重要的Ser195位于C端结构域上, 且其他重要的功能位点都位于C端结构域。C端结构域还含有两个十分重要的保守二硫键, 另外还包含了绝大多数的功能位点, 它们通过对蛋白酶原的激活或抑制而起到调节因子的作用[8]。因此C端结构域主要执行丝氨酸蛋白酶的催化功能, 而N端结构域的主要功能则可能是同C端结构域配合, 从而保证催化中心三联体的结构稳定和活性。
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在无脊椎动物中普遍存在, 主要行使消化和免疫的功能。在按蚊(Anopheles gambiae)中, Tryps_SPc在肠道中主要与血液的消化作用相关[9], 而在青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)中[10], 具有Tryps_SPc domain的卵质素可以作为一种免疫分子, 抵抗如大肠杆菌和副溶血弧菌等病原微生物的感染。另外, 突变型胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶也在其他物种中存在, 如Mj-SPH[11]和Fctry4[12], 它们催化三联体中第三位Ser分别被Gly和Phe所取代, 都失去了正常的催化功能。
东亚三角涡虫(Dugesia japonica)在动物学分类上隶属于扁形动物门(Platyhelminthes)、涡虫纲(Turbellaria)、三肠目(Tricladicla)、三角涡虫科(Dugesiidae)、真涡虫属(Dugesia), 是扁形动物门涡虫纲的代表动物, 是进化史上首次出现三胚层分化的动物。涡虫进化地位的原始性以及极强的再生能力成为研究进化、发育以及再生的模式生物[13, 14]。本文通过对东亚三角涡虫Djtry序列的生物信息学分析, 发现Djtry基因编码的蛋白保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代, 进一步构建东亚三角涡虫Djtry基因的原核表达载体、诱导融合蛋白表达、蛋白鉴定以及酶比活检测表明, 该融合蛋白具有一定酶活力, 为深入探究涡虫体内这种原始的胰蛋白酶的进化和酶学特性奠定了基础。1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 东亚三角涡虫
东亚三角涡虫(Dugesia japonica)采集于山东省博山泉河头, 并饲养于灭菌并充氧过夜的凉开水中, 每周喂食猪肝一次, 实验用涡虫一周前停止喂食。
1.1.2 载体与质粒
pcDNA3.0-Djtry为本实验室构建, 表达载体pET-28a以及宿主菌E.coli BL21为本实验室保存。
1.2方法
1.2.1 引物设计与PCR扩增
根据实验室已经获得的东亚三角涡虫Djtry基因(GenBank登录号：JN648901)完整的ORF序列, 设计带有酶切位点的特异性引物, 由上海Sangon公司合成。上游引物序列：5′-CGGGATCCAGGAATTC GGCGATTAC-3′(下划线表示Bam H I 酶切位点), 下游引物序列：3′-CCCAAGCTTTCGACTAGGACG AGGCG-3′(下划线表示Hin d Ⅲ酶切位点)。以pcDNA3.0-Djtry质粒为模板进行PCR扩增。反应程序：94℃预变性5 min; 94℃30 s, 55℃30 s, 72℃ 1 min, 共35个循环; 最后再72℃延伸10 min, 冷却至4℃。PCR扩增结束后, 取PCR反应液5 μL加1 μL上样缓冲液(Loading Buffer)在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
1.2.2 重组质粒的筛选与鉴定
将PCR得到的Djtry基因片段和pET-28a质粒载体分别用Bam H I酶和Hin d Ⅲ酶 (Fermentas公司)进行双酶切, DNA回收试剂盒分别回收纯化, T4 DNA连接酶4℃连接过夜, 连接产物转化 E.coli BL21感受态细胞。
将转化完毕的感受态细胞涂布于含有卡那霉素的LB平板上于37℃倒置培养过夜, 挑取阳性克隆进行菌液PCR鉴定, 同时使用Bam H I 酶和Hin d Ⅲ酶进行双酶切鉴定, 并交由上海博尚测序公司进行测序。阳性重组质粒命名为pET-28a-Djtry。1.2.3 融合蛋白诱导表达
挑取pET-28a-Djtry单个阳性菌落接种于1 mL含
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50 μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中, 200 r/min, 37℃振荡培养过夜, 次日以1:50的比例接种于LB液体培养基中, 37℃、200 r/min振荡培养, 至A600=0.6左右时, 加入0.4 mmol/L的IPTG, 20℃、110 r/min振荡培养过夜。
1.2.4 重组蛋白的制备、纯化和鉴定
重组蛋白的制备：收集培养过夜的菌体, 4800 r/min、10 min离心, 去上清, 用预冷的TE缓冲液(pH 8.0)洗涤菌体后, 再加入预冷的50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 500 mmol/L NaCl溶液各5 mL重悬菌体。采用VC650型超声波细胞粉碎机以550 W的功率在冰浴下超声4个循环(超声3 s, 间歇9 s重复80次为一个循环), 破碎细菌细胞。4℃、12 000 r/min离心30 min后去上清, 取沉淀进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析重组蛋白表达情况。
重组蛋白的变性、纯化：用Binding Buffer(20 mmol/L NaH2PO4, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L 咪唑, pH 7.4)溶解包涵体, 4℃、12 000 r/min离心30 min, 取上清, 过滤后用组氨酸亲和层析柱进行纯化, 用Washing Buffer(20 mmol/L NaH2PO4、0.5 mol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑, pH 7.4)进行洗脱收集, SDS-PAGE检测纯化结果。
Western blotting鉴定：以纯化后的蛋白液用12 %的SDS-PAGE凝胶电泳后, 进行PVDF转膜, 之后用5 %的BCA在37℃封闭2 h, TBST室温洗膜, 加入抗His-Tag小鼠单克隆抗体(1:500)于4℃孵育过夜, TBST室温洗膜, 加入碱性磷酸酯酶标记的羊抗小鼠二抗(1:4000) 37℃ 2 h, TBST室温洗膜, 加入底物NBT/BCIP显色。
1.2.5 包涵体内重组蛋白的复性及检测
把透析袋剪成适当长度10~20 cm的小段, 在2 %的NaHCO3中将透析袋煮沸10 min, 然后用蒸馏水彻底清洗透析袋, 放在1 mmol/L EDTA 中煮沸10 min, 冷却后存放于4℃冰箱中(在EDTA中)。
将纯化后的包涵体用Washing Buffer稀释至0.1mg/mL左右, 装入煮好的透析袋中。在复性液Ⅰ(尿素0.6 mol/L、Tris-HCl 2.0 mmol/L、GSSG 1 mmol/L、GSH 1 mmol/L、1 %甘氨酸, pH 9.0)中冰浴磁力搅拌透析1 h, 取出透析袋放入另一复性液中透析 2 h, 取出透析袋放入复性液Ⅱ(25 mmol/L Tris- HCl、10 mmol/L NaCl、1mmol/L DTT、1 %甘氨酸, pH 9.0)冰浴磁力搅拌2 h。透析后蛋白液4℃、12 000 r/min 离心30 min, 测定蛋白浓度, PEG反透析浓缩蛋白。
1.2.6 酶活测定
配制反应工作液(4 mmol/L BAEE、50 mmol/L Tris-HCl、0.2 % CaCl2, pH 8.0), 将工作液置于25℃水浴中5 min, 取预热的反应工作液2.8 mL, 加入0.2 mL 0.5 mg/mL的复性蛋白液并迅速混匀, 对照加入0.2 mL透析液Ⅱ, 每30 s记录253 nm处光吸收值。另外, 以0.05 mg/mL牛胰蛋白酶为标准蛋白, 每30 s测定253 nm处光吸收值。
2结果与分析
2.1生物信息学分析
从本实验室构建的东亚三角涡虫cDNA文库中得到的Djtry基因, 序列全长706 bp, 最大开放阅读框(ORF)为609 bp, 编码203个氨基酸残基组成的多肽, 蛋白分子量22.6 kDa。与无脊椎动物类群氨基酸序列比对发现, 与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei, CAA75310)胰蛋白酶相似性为31.7 %, 与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, NP_494910 )胰蛋白酶-1相似性为17.3 % (图1), Djtry保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代, C端具有4个保守的Cys组成两个发卡结构。利用Philip 3.5c软件包, 采用邻位相连法, 1 000次重复, 对代表物种的Trypsin蛋白进行进化树分析(图2)。结果表明, Djtry 位于进化树的基部, 是一种原始的Trypsin类型。2.2融合蛋白的表达、纯化及Western blotting鉴定
以pcDNA3.0-Djtry质粒为模板, PCR扩增产物和质粒pET-28a用Bam H I和Hin d Ⅲ双酶切, 连接并转化E.coli BL21细胞。重组菌经菌液PCR和双酶切检测后测序(上海博尚生物公司)。对测序结果进行比对, 发现序列完整、正确, 说明目的基因Djtry 片段已经连接到表达载体上, 重组质粒构建成功。含有重组质粒pET-28a-Djtry的工程菌经0.4mmol/L IPTG诱导后, SDS-PAGE分析, 在26 kDa处有一条清晰的条带(图3), 这与融合蛋白Djtry理论分子量相符, 均为包涵体表达, 表达量较高, 说明该蛋白经诱导后成功高效表达, 为纯化蛋白提供了可行性。
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图1 东亚三角涡虫Djtry 和其他物种Trypsin 的Alignment 分析
序列比对用DNAstar 软件中MegAlign 程序的Clustal W 方法。阴影表示相同的氨基酸序列。
对诱导后的菌液进行离心、超声破碎, 收集包涵体, 用变性液溶解, His 亲和层析柱纯化以及Western 杂交鉴定, 在26 kDa 处出现阳性信号, 与目的蛋白大小相符(图3), 结果表明目的蛋白纯化成功。
蛋白复性后透析袋中出现少量沉淀, 离心收集上清, 对透析复性后的蛋白上清液进行SDS-PAGE 检测, 在26 kDa 处有特异清晰的条带, 与纯化后蛋白条带相符, 说明透析复性蛋白成功(图4)。 2.3 酶活测定
透析后的蛋白液经PEG 反透析, 将终浓度定于
0.5 mg/mL,另外以牛胰蛋白酶绘制标准曲线, 苯甲酰-L-精氨酸乙酯(benzoyl L-arginine ethl ester, 简称BAEE)为底物, 测定5 min 内两者OD 253值的变化。胰蛋白酶活力单位定义为：以BAEE 为底物反应液, pH 8.0, 25℃, 反应体积3 mL, 光径1 cm 条件下, 测定OD 253 nm, 每分钟OD 253增加0.001, 反应液中所加入的酶量为一个BAEE 单位。酶比活公式为：酶活力单位数/mg 蛋白质。
根据公式可得, 标准牛胰蛋白酶的比活力为2000 BAEE U/mg, 重组蛋白Djtry 的比活力为64 BAEE U/mg (图5)。可见包涵体中经过复性后, 这种
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图2东亚三角涡虫Djtry和其他物种Trypsin通过邻位相连法构建进化树
该系统进化树采用Philip 3.5c软件包, Bootstrap值采用1 000次重复。
图3重组蛋白SDS-PAGE分析
M：蛋白Marker; 1：带有pET-28a 空载体的菌; 2：含有重组质粒未诱导的菌; 3：带有重组质粒pET-28a-Djtry超声后包涵体; 4：带有重组质粒pET-28a-Djtry菌总蛋白。
图4包涵体纯化、复性SDS-PAGE检测及Western杂交M：蛋白Marker; 1：纯化后重组蛋白; 2：复性后重组蛋白; 3：His 标签抗体Western杂交信号。
图5在OD253nm处检测标准牛胰蛋白酶和Djtry酶活曲线
突变型胰蛋白酶Djtry具有一定的催化活性, 可以水解精氨酸形成肽键, 具有精氨酸肽酶活力。
3讨论
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶广泛分布于生物体中, 行使的功能也多种多样, 作为丝氨酸蛋白酶家族中的一员, 绝大多数Tryps_SPc都具有保守的催化三联体结构, 即His、Asp和Ser, 但是也有小部分酶的催化三联体保守氨基酸残基被取代的情况, 例如Mj-SPH[11]和Fctry4 [12], 它们的第三位Ser分别被Gly和Phe所取代, 并且失去了催化功能。这些酶被称之为丝氨酸蛋白酶同系物。在丝氨酸蛋白酶中, 催化三联体结构之间通过氢键相互作用, 通常情况下, 氢键的作用部位在于His的Nδ1-H和Asp的Oδ1, 以及Ser的OH和His的Nε2-H。His通过吸收来自Ser 的一个质子, 从而激活催化反应[15]。从丝氨酸蛋白酶催化机制出发, 肽链的水解是通过酰化和脱酰化两步进行的[16], 在这个过程中, Ser是行使催化功能的主要活性位点, 所以Ser的突变会直接导致催化活性的丧失, 如Mj-SPH和Fctry4。在我们发现的Djtry 氨基酸序列中, 催化三联体结构第一位的His被Lys 所取代, Ser位点正常, 而Lys作为一种碱性氨基酸, 我们推测Lys的Nε1-H同样具有形成氢键以及吸收电子激活催化反应的作用。另外, His的突变可以通过底物中含有的His残基恢复胰蛋白酶的催化活性[17-20]。所以, 我们推测这种His突变型Tryps_SPc可能依然保持丝氨酸蛋白酶催化活性。至今为止, 在三角涡虫种群的相关研究中, 该基因在其他种群中都没有报道, 而这种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三联体突变的情况在其他物种中也很少出现, 这种突
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变可能会在该基因物种进化和功能的多样性上具有一定的意义。
本实验室成功构建了重组表达载体pET-28a- Djtry, 在IPTG诱导下, 对含有重组质粒的大肠杆菌进行诱导表达, 表达的目的蛋白均为无活性的包涵体形式, 对包涵体进行变性纯化, SDS-PAGE电泳以及Western杂交检测, 证明目的蛋白被成功纯化, 利用透析复性方法, 对包涵体进行复性以及酶活检测, 发现目的蛋白对胰蛋白酶特异性底物BAEE具有一定的水解能力, 与牛胰蛋白酶相比, 比活力为牛胰蛋白酶的1/30, 活性较弱, 可能受到了突变氨基酸或者复性条件的影响, 但是催化三联体中His被Lys 取代, 并没有使Djtry丧失酶活特性。
综上所述, 本文对涡虫Djtry氨基酸序列进行了Blast比对分析, 针对保守催化三联体中His被Lys 取代这一现象构建重组表达质粒, 成功地对重组蛋白包涵体进行变性、纯化与复性,
并检测到了胰蛋白酶的活性。期望能以此进一步探索其体内和体外的生物学功能、蛋白分子结构, 同时也为其在生物进化方面的研究奠定了基础。
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