江南大学考研 微生物PPT课件

第七章微生物的遗传变异与育种

Microbial Genetics and Variation

遗传和变异的几个概念:

遗传(heredity)生物的上一代将自己的遗传因子传递给下一代的行为或功能，具有极其稳定的特性。遗传型(genotype) 某一生物所含有的遗传信息即DNA中正确的核苷酸序列。生物体通过这个核苷酸序列控制蛋白质或RNA的合成，一旦功能性蛋白质合成，可调控基因表达。

表型(phenotype)某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环

境条件下的具体体现。是一种现实性。

遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。

饰变(modification)指不涉及遗传物质结构改变，只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点：每一个体都发生变化性状变化的幅度小；因遗传物质不变故饰变是不遗传的。

变异（Variation）是生物体在某种外因或内因作用下引起的遗传物质结构改变，亦即遗传型的改变。特点：l几率极低(一般为10-5~10-6)；2性状变化幅度大；3变化后的新性状是稳定的、可遗传的。

细菌变异变异(variation)：在一定条件下，子代与亲代之间以及子代与子代之间的生物学性状出现的差异。形态结构的变异毒力变异耐药性变异菌落变异

一. 形态结构的变异

细菌的大小和形态在不同的生长时期可不同，生长过程中受外界环境的影响也可发生变异。如：鼠疫耶氏菌在陈旧培养物上细菌的多形态性、细菌L型。

细菌的特殊结构v如：荚膜（肺炎链球菌）v芽胞（炭疽芽孢杆菌）v鞭毛（变形杆菌H-O变异）也可发生变异。

毒力变异(增强) 无毒力的白喉棒状杆菌常寄居在咽喉部，不致病；当感染了β-棒状噬菌体后变成溶原性细菌，则获得产生白喉毒素的能力，引起白喉。

毒力变异(减弱) 有毒菌株长期在人工培养基上传代培养，可使细菌的毒力减弱或消失。卡介苗(BCG)是有毒的牛分枝杆菌在含有胆汁的甘油、马铃薯培养基上，经过13年，连续穿230代，获得的一株毒力减弱但仍保持免疫原性的变异株。

耐药性变异细菌对某种抗菌药物由敏感变为耐药的变异。金黄色葡萄球菌耐青霉素的菌株已从1946年的14%上升至目前的80%。多重耐药性：有些细菌还表现为同时耐受多种抗菌药物，从抗生素广泛应用以来，细菌对抗生素耐药的不断增长是世界范围内的普遍趋势，给临床治疗带来很大的困难，并成为当今医学上的重要问题。

菌落变异细菌的菌落主要有光滑(smooth,S)型和粗糙(rough,R)型两种。S型菌落表面光滑、

湿润、边缘整齐。经人工培养多次传代后菌落表面边为粗糙、干燥、边缘不整齐，称S—R 变异。S—R变异常见于肠道杆菌，是由于失去LPS的特异性寡糖重复单位而引起的。变异时不仅菌落的特征发生改变，且细菌的其它性状也发生了变化。

S型菌的致病性强，但有少数R型菌的致病性强，如结核分枝杆菌

突变(mutation)：是细菌遗传物质的结构发生突然而稳定的改变，导致细菌性状的遗传性变异。

遗传性变异；非遗传性变异

遗传性变异：是细菌的基因结构发生了改变，故又称基因型变异。常发生于个别的细菌，不受环境因素的影响，变异发生后是不可逆的，产生的新性状可稳定地遗传给后代。

非遗传性变异：细菌在一定的环境条件影响下产生的变异，其基因结构未改变，称为表型变异。§易受到环境因素的影响，凡在此环境因素作用下的所有细菌都出现变异，而且当环境中的影响因素去除后，变异的性状又可复原，表型变异不能遗传。

第一节遗传变异的物质基础

一、遗传物质化学本质的确证二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式

一、三个经典实验

F.Griffith的转化实验

噬菌体感染实验

TMV重建实验

结论：核酸是负荷遗传信息的物质基础

（一）核酸存在的七个水平及质粒

细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核

细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA

染色体水平: 倍性(真核)和染色体数

核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链

基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录——翻译

密码子水平：信息单位,起始和终止

核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基二．遗传物质在细胞内的存在部位和方式

细菌遗传变异的物质基础：染色体质粒转位因子

细菌染色体：细菌属于原核细胞型微生物, 细菌染色体是环状双螺旋DNA，不含组蛋白, 无核膜包围。

基因, 是具有一定生物学功能的核苷酸序列，如编码结构蛋白、酶等功能。细菌基因的结构是连续的, 无内含子。细菌染色体DNA的复制：大肠埃希菌已证明是双向复制

基因是一段DNA

大肠杆菌基因：l4100个基因，4.7×106bp ；遗传信息的连续性；功能相关的结构基因组成操纵子；结构基因单拷贝及rRNA多拷贝；基因的重复序列少而短

质粒(plasmid)：是游离于原核生物基因组以外、具有独立复制能力的小型共价闭合环状的

dsDNA分子（cccDNA）目前仅发现于原核微生物和真核微生物的酵母菌有。

质粒存在的三种形态l麻花状的超螺旋结构1.5～300kb，Mw106～8，相当于约1％核基因组；线状质粒：天蓝色链霉菌、赫氏蜱疏螺旋体

质粒大小：约为2～100×106，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。

质粒的特征存在方式：可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；

1复制能力：质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，单拷贝或多拷贝。可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种。严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1～5）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10～200个或更多。

2 有转移性：可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。

3编码产物赋予细菌某些性状特征

4对于细菌的生存并不是必要的可自行丢失与消除

5功能多样化

6可整合性质粒可以与核染色体发生整合与脱离，如F因子，这种质粒称附加体

整合：指质粒或温和噬菌体、病毒、转化因子等小型非染色体DNA插入核基因组等大型DNA分子中的现象

7重组性

质粒与质粒之间、质粒与核染色体之间的基因重组

质粒的功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。

存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等? 质粒消除的因素：吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子、高温

质粒的分离与鉴定

质粒分离的步骤：细胞培养细胞裂解蛋白质和RNA的去除质粒DNA与染色体DNA分离：关键

质粒的鉴定：电镜琼脂糖凝胶电泳：确定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳密度梯度离心质粒的限制性酶切图谱

质粒在基因工程中的应用

质粒用于基因工程操作的优点：体积小环状独立复制起始点拷贝数多选择性标记：抗性基因

质粒的应用——克隆载体：能够完成外源DNA片段复制的DNA分子

质粒基因可编码多种重要的生物学性状

1)致育质粒（F质粒）与有性生殖功能关联；

2)耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。接合性耐药质粒（R质粒）非接合耐药性质粒；

3)毒力质粒（V i质粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子；

4)细菌素质粒编码细菌产生细菌素；

5)代谢质粒编码产生相关的代谢酶。

几种代表性质粒：致育因子或性因子—F因子（fertility factor）双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。与有性生殖有关，带有F质粒的为雄性菌，能长出性菌毛；无F质粒的为雌性菌，无性菌毛；存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别

耐药性质粒—R因子（resistence factor）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。

R因子由相连的两个DNA片段组成：抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF ）分子量约为11×106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。抗性决定R因子（r-determinant）。R-因子在细胞内的copy数可从1~2个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细胞。最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。

毒力质粒（V i质粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子。如致病性的大肠埃希菌产生的耐热性肠毒素是由ST质粒编码的。细菌粘附定植在肠粘膜表面是由K质粒决定的。u

降解性质粒只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，l例如分解CAM（樟脑）质粒，分解XYL（二甲苯）质粒，分解SAL（水杨酸）质粒，分解MDL（扁桃酸）质粒，分解NAP（奈）质粒，分解TOL（甲苯）质粒等。

降解性质粒的应用：污水处理与环境保护。

细菌素质粒——Col因子（colicinogenic factor）编码各种细菌产生的细菌素。Col质粒编码大肠埃希菌产生大肠菌素，大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约4~8×104D。l 大肠杆菌素都是由Col因子编码的。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。

mega质粒（巨大质粒）是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200~300×106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。

Ti质粒（tumor inducing plasmid）：诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。

当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。

杀伤性质粒发现于真菌的酵母菌（yeast）和黑粉菌的致死颗粒（killer particles），其性能如肠杆菌素质粒。但致死颗粒的基因组都为双链RNA，不是双链DNA，且有蛋白质外壳包

围，尤如双链RNA病毒。

酵母菌中的2μm质粒和其他质粒存在于真核微生物酵母菌细胞核中,但独立于染色体内的长度为2μm并与组蛋白相结合的DNA质粒。

酵母菌中还存在其他如编码细菌性纤维素酶的质粒。

转位因子

转位因子：是存在于细菌染色体或质粒DNA分子上的一段特异性核苷酸序列片段，它能在DNA分子中移动，不断改变它们在基因组中的位置，能从一个基因组转移到另一基因组中。转位因子有三类：插入序列(IS)；转座子(Tn)；转座噬菌体或前噬菌体。

插入序列：IS能在染色体上和质粒的许多位点上插入并改换位点，因此也称跳跃基因（jumping genes）。

转座子是能够插入染色体或质粒不同位点的一般DNA序列，大小为几个kb，具有转座功能，即可移动至不同位点上去，本身也可复制。转座后在原来位置仍保留1份拷贝。转座子两末端的DNA碱基序列为反向重复序列。转座子上携带有编码某些细菌表型特征的基因，如抗卡那霉素和新霉素的基因，且本身也可自我复制。

第二节基因突变和诱变育种

一、突变类型二、基因突变的规律三、基因突变的机制

四、DNA损伤及其修复五、突变和育种

突变率

每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。或每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数

突变率常为10－6~10－9 l一般突变是独立发生的。

突变的基因不会影响其他基因的突变率。双重突变的概率是各个突变概率的乘积。

突变菌株的检出由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（back mutant或reverse mutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。

回复突变：细菌由野生型变为突变型是正向突变，有时突变株经过又一次突变可恢复野生型的性状。

DNA的损伤修复：当细菌DNA受到损伤时，细胞会用有效的DNA修复系统进行细致的修复，使损伤降为最小。

突变的类型

三、突变的规律? 1.不对应性 2.自发性 3.稀有性 4.独立性 5.诱变性 6.稳定性7.可逆性

正向突变：由野生型基因变异为突变型基因的过程回复突变：由突变型向野生型表型的转变?

四、基因突变的自发性和不对应性的证明

两种观点：突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是―定向变异‖，也有人称它为―驯化‖或―驯养‖。

基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。

从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争

1.变量实验（fluctuation test ）

又称波动试验或彷徨试验1943年，S. E. Luria 和M. Delbrück 根据统计学原理设计

2. Newcombe涂布实验

3.平板影印培养实验（replica plating）

在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。

平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。

上为诱变机制

诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂

种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式

碱基置换（Substitution）移码突变（Frame-shift Mutation）染色体畸变（Chromosomal aberration）

1碱基置换（substitution）——染色体的微小损伤，一对碱基被另一对碱基所置换，

转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠换（transversion），即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。

导致置换的诱变剂

直接引起置换的诱变剂：直接与核酸发生化学反应, 亚硝酸、亚硝基胍、硫酸二乙酯等

间接引起置换的诱变剂：碱基类似物,通过活细胞代谢活动掺入到DNA分子中。l5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、6-氯嘌呤等碱基类似物

移码突变：DNA分子中增添（或缺失）一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变.

诱变剂：吖啶类染料吖啶橙吖啶黄原黄素α-氨基吖啶ICR（Institute of Cancer Research）类化合物

染色体畸变（chromosomal aberration）诱变剂引起染色体的大段损伤。缺失（Deletion）重复Duplication 插入Insertion 易位Translocation

倒位Inversion 染色体数目变化

诱变剂：lA、射线——UV lB、亚硝酸、烷化剂

2.自发突变（Spontaneous Mutaion）没有人工干预条件下生物体自然发生的低频率突变

自发突变的诱导因素：1背景辐射和环境因素：多因素低剂量的诱变效应

2微生物自身有害代谢产物的诱变效应：过氧化氢

3 DNA复制过程碱基配对错误

碱基错配频率10-7～10-11/次复制，每个基因1000 bp，自发突变频率为10-6，菌体浓度108CFU/ml

4互变异构效应：碱基发生了酮式至烯醇式的转变

5环出效应

环出效应：在DNA的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因在其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。

过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。它对Neurospora（脉孢菌）有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率。这就说明，过氧化氢很可能是―自发突变‖中一种内源性诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。

DNA损伤及其修复

DNA损伤类型很多，研究最多的是紫外线作用。

紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构发生扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而可能引起突变或死亡。在互补双链结构间形成嘧啶二聚体的机会少，但一旦形成会妨碍双链的解开因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。

紫外线的作用机制: 1、紫外线可引起DNA链断裂2、可引起嘧啶发生水合作用，造成氢链的断裂。3、可引起DNA分子内或分子间交联4、引起胸腺嘧啶（T）之间形成二聚体( TT ) ，这是引起突变最主要的原因。

DNA的修复1、光复活（Photoreactivation) 2、切除修复(Excision repair) 3、重组修复(Recombination repair) 4、SOS修复

光复活作用（photoreactivation）把经过紫外线照射后的微生物暴露于可见光时,出现突变效应和致死作用均下降的现象,称为光复活作用。这一现象最早是 A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。最明显的是在E.coli的实验中。

修复机制：在微生物细胞内存在光复活酶，此酶在黑暗中专一地识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，当给予可见光光照时，酶利用光能将二聚体解离，恢复原状，酶再释放出来。

由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。–

暗修复作用（dark repair）又称切除修复（excision repair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和γ射线等）损伤后的DNA的机制。这种修复作用与光无关。

暗修复作用的过程1、由核酸内切酶切开二聚体的5‘末端，形成3‘-OH和5‘-P的单链缺口2、核酸外切酶从5‘-P到3‘-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3‘-OH端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的3‘-OH与原有的5‘-P相连接。

重组修复：必须在DNA复制的情况下进行，所以又叫复制后修复。胸腺嘧啶二聚体不能被复制，不是在此位点阻塞，而是DNA聚合酶能跳过该损伤部位，沿着下面DNA的模板，恢复DNA继续合成。在新合成的DNA子链上二聚体对面留下一个缺口。

SOS修复SOS是紧急修复。细胞中有许多基因和操纵子受RecA蛋白协同调控和LexA蛋白阻遏转录。它涉及处理DNA损伤和称为SOS修复系统。SOS是一组基因，它是DNA 修复最重要最广泛的基因集团，通常称为DNA紧急修复基因（SOS DNA repair gene)。它们为DNA的损伤所诱导。

第三节诱变与育种

自发突变与育种诱变育种

微生物的育种目的：为了要人为地使某种微生物的代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，实现人为控制微生物，获得我们所需要的高产、优质和低耗的菌种。

一、自发突变与育种

从生产中选育：生产中菌自发突变→及时选育出所需性状的菌；正突变株Plus Mutant

定向培育优良品种：用某特定环境长期处理某微生物群体，同时不断对其移种传代，以达到累积并选择合适的自发突变体的育种方法。

定向培育获得卡介苗：牛型结核杆菌→牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上→移种230多代→显著减毒结核杆菌（卡介苗）

二、诱变育种Breeding by Induced Mutation

指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。一般通过营养缺陷型突变株、抗阻遏和抗反馈突变型、抗性突变型（抗生素抗性突变株、条件抗性突变）来筛选。

诱变育种：理化诱变剂→处理均匀、分散的微生物群体→提高突变率→巧妙筛选。诱变：随机的过程；筛选：定向的过程。

诱变育种的实践意义：工业与实验室：代谢产物的高产突变株；生产角度：提高代谢产物

的产量，减少杂质，扩大品种，改进产品质量，简化生产工艺；方法：简便易行，工作速度快，收效显著。

1．诱变育种的基本环节

诱变育种工作中应考虑的几个原则：

选择简便有效的诱变剂

选优良的出发菌株

处理单孢子（或单细胞）悬液

选用最适剂量

利用复合处理的协同效应

利用和创造形态，生理与产量间的相关指标

设计或采用高效筛选方案或方法

诱变育种中的几个注意事项：1 .出发菌株的选择：选择合适的出发菌株相当重要

出发菌株———用来育种处理的起始菌株。出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力。

出发菌株的来源：自然界直接分离到的野生型菌株；历经生产考验的菌株；已经历多次育种处理的菌株?

2.单孢子悬液在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂。

要求：l菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生；细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象

方法：玻璃珠打散10-15min；加０.3%吐温80（表面活性剂）；用无菌脱脂棉过滤。

3.诱变剂的选择

选择简便有效的诱变剂。物理诱变剂：X射线、γ射线、快中子、紫外线、α-射线、β-射线和超声波；

化学诱变剂：种类较多，根据作用机制分3类： 1 与一个或多个核酸碱基起化学变化，引起DNA复制时碱基配对的转换而发生变异如亚硝酸、硫酸二乙酯等；

2 与DNA中碱基十分接近的类似物，掺入到DNA分子中而引起变异。如5-溴尿嘧啶；

3 在DNA上减少或增加一、二个碱基，引起碱基突变点后全部密码转录、转译的错误，如吖啶类物质

常用的物理和化学诱变剂紫外线l15W紫外灯、照射距离30cm，无可见光的接种室或箱体中（只有红光），照射时间10-20秒～10-20min，小培养皿

亚硝基胍－超诱变剂：涂布平板上添加诱变剂颗粒或浸有诱变剂溶液的滤纸片

诱变剂的作用：提高突变的频率；扩大产量变异的幅度；使产量变异朝着正突变或负突变移动

最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70~80%）

4.选择合适的诱变剂量由于诱变剂常常是用来提高突变率，突变率往往随剂量的增高而提高。正突变较多出现在偏低的剂量中；负突变则较多出现在偏高的剂量中；所以要选择最适的剂量

在育种工作中，常采用杀菌率表示杀菌的剂量。杀菌率的计算是取同样量的被处理菌体和未被处理的菌体分别在完全培养基上进行培养，检测各自的生长的菌落。

剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。不同

诱变剂剂量的表达方式不同–致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法

–UV剂量=强度×作用时间–化学杀菌剂的剂量：在一定的外界条件下，诱变剂的浓度与作用时间–常用杀菌率作各种诱变剂的相对剂量

诱变过程中的两条重要曲线：

剂量存活率曲线：以诱变剂的剂量为横坐标、以细胞存活数的对数值为纵坐标绘制的曲线剂量诱变率曲线：以诱变剂的剂量为横坐标，以诱变后获得的突变细胞数为纵坐标绘制的曲线

艾姆斯试验（Ames test）利用细菌营养缺陷型的回复突变检出环境或食品中是否存在化学致癌剂的一种简便有效方法

Strain used in ames test：DNA修复酶缺陷型Salmonella typhimurium his；lE. coli try；λ噬菌体的诱导作用

原理：his -在基本培养基上不长；而发生回复突变则长

应用：检测食品、饮料、药物和饮水和环境中的致癌物质

快速、准确、费用低

艾姆斯试验方法示意图

菌种筛选

筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网。初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。

复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。

新型筛选方法产量突变株：初筛：摇瓶、平板（快速、简便、直观）

平皿快速检测法l变色圈法l透明圈法l生长圈法l抑菌圈法l梯度平板法

复筛：对产量突变株作生产性能的精确测定摇瓶、台式自动发酵罐

三类突变株的筛选方法

?一、产量突变株的筛选春日霉素生产菌的筛选——琼脂块培养法?

抗药性突变株的筛选用梯度平板法筛选抗代谢拮抗物突变株作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）作为菌株的遗传标记

与突变株的筛选相关的几个概念

野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。lys + ; bio + 可在MM上生长，如：[A+B+]

营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长。lys - ，bio- l只能在CM或相应的SM上生长。如：[A+B-]

原养型：指营养缺陷型突变菌株经回复或重组后产生的菌株。其营养要求在表现型上与野生型相同?

2.与筛选有关的三种培养基?①基本培养基（MM）：仅能满足某种微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基? 用[-]表示。?

②完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用[+]表示。?

③补充培养基（SM）：凡可满足相应的营养缺陷型菌株生长需要的组合培养基。在MM上添加有某一微生物营养缺陷型所不能合成的代谢物即构成SM，用[A]或[B]表示。? ? 补充培养基=基本培养基+缺陷的代谢物? ?

营养缺陷型的筛选步骤

1.诱变剂的处理（略）

2.淘汰野生型：（又称浓缩）a抗生素法：青霉素法；适合于细菌；制霉菌素法，适用于真菌。原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：将菌培养在含抗生素的MM基中

b.菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌或放线菌原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。

3.营养缺陷型的检出

同一培养皿上有：夹层培养法限量补充培养法

不同的培养皿上有：逐个检出法影印接种法

4.鉴定缺陷型

生长谱法（Auxanography）：在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围是否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速直观的方法。

操作过程：营养缺陷型细胞培养；制备菌种悬液；平板倾注，区域划分；添加营养物质粉末；培养观察。

类似方法可以测定双重或多重营养缺陷型

5.缺陷型的应用

作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种研究代谢过程时用作亲本标记；

作为生产菌种：氨基酸、核苷酸等生产菌种；

作为氨基酸、维生素、碱基的测定菌株

第四节基因重组

Genetic Recombination

原核微生物的基因重组

真核微生物的基因重组

基因重组定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传个体的方式。

基因重组的方式：原核微生物：转化、转导、接合和原生质体融合。真核微生物：有性杂交、准性杂交

基因重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新的遗传型的个体

一、原核微生物的基因重组原核生物的基因重组的类型转化（transformation）转导（transduction）接合(conjugation) 原生质体融合（Protoplast Fusion )

（一）转化（transformation）定义：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，经过交换，把它整合到自己的基因中而获得部分新的遗传性状的现象，称为转化。转化现象在肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜血杆菌等中被证实。

目前为止，已发现能发生转化作用的菌属主要有：lStreptococcus pneumoniae、Haemophilus （嗜血杆菌属）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus、Pseudomonas和Xanthomonas中多见。

在若干放线菌和蓝细菌以及Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa（粗糙脉胞菌）和Aspergillus niger中，也有转化现象。

有关名词：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者

供体菌：donor，转化基因的提供者

转化因子：来自供体菌的DNA片段

转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子。

转化的条件：1.菌株 2.菌株间的亲缘关系。 3.受体菌所处的状态（即感受态）

4.感受态的出现与菌株的遗传特性、培养条件有关。

5.供体细胞的DNA片段的分子量一般在107。

转化转化因子（transforming principle ）：在转化过程中，转化的DNA片段称为转化因子，分子量小于107，最多不超过10~20个基因。

感受态（competence）受体细胞最容易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。受体菌只有处于感受态时，才能摄取转化因子。细菌处于感受态是因为其表面有一种吸附DNA的受体.

影响感受态出现的因素：培养时间：生长的对数期、稳定期；群体比例和维持时间；外界环境因子：cAMP（提高1万倍）和Ca2+；感受态因子：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素、核酸酶

转化的类型：根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化natural genetic transformation 人工转化artificial transformation

转化的过程

①受体细胞出现感受态②吸收ssDNA

③掺入DNA形成复合物④受体菌染色体复制，杂合区也跟着复制，细胞分裂

参与转化的基因供体只是游离的DNA分子，整个转化过程不需要细胞间的直接接触。转化的频率：很低，仅有0.1~1%

转化过程示意图

人工转化——是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导

入细胞内。方法：①CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态.

②电穿孔法electroporation：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA）能通过这些小孔进入细胞。

转染（transfection）定义：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。与转化的区别：病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌；中间不发生任何遗传因子的交换或整合；最后不产生具有杂种性质的转化子

（二）转导（transduction）1.转导及其发现J.Lederberg等（1952）在Salmonella typhimurium （鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。

是利用温和性噬菌体作媒介，将供体细胞的DNA的小片段（部分DNA）传递给另一受体细胞，通过交换与整合，从而使受体菌的遗传性状发生改变的现象。

存在范围：除Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）外，其它原核微生物中如E.coli、Bacillus、Proteus、Pseudomonas、Shigella、Staphylococcus、V ibrio和Rhizobium等属中都曾发现转导现象。

普遍性转导Complete T randuction 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行不精确的―误切‖，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。

噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1）包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体）2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。

供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数（m.o.i）<1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内

由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；

导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。

感染复数：由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的噬菌的数量,m.o.i一般很大，可达250~360。

由于超m.o.i的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体的裂解，称为自外裂解（lysis from without）。

流产转导Abortive T ransduction 在经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体

菌内，外源DNA既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅表现为稳定的转录、转译和性状表达

局限转导（Specialized/ restricted T randuction）通过部分缺陷的温和噬菌体将供体少量特定基因带入受体菌实现的，并与后者的基因组整合、重组，宿主细胞成为一个局限转导子而不是溶源菌

局限转导的类型：根据出现频率的高低低频局限转导高频局限转导

特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体

只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）

该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带

缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约10 –5）―误切‖，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）

3.溶源转变概念：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。

性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。

区别：当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失

温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状

温和噬菌体使完整的，不是缺陷的

获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子

（三）接合（conjugation）供体菌通过其性纤毛与受体菌相接触，前者传递不同长度的ssDNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。

接合是一种较为低级的有性生殖方式，少数G+是链霉菌和诺卡氏菌等放线菌能发生接合作用的细菌大多数是G-，如E.coli和假单胞菌等，

存在范围细菌：G –较为多见如E. coli、Salmonella、Shigella、Serratia、Vibrio 、Azotobacter 、Klebsiella和Pseudomonas等最为常见

放线菌：Streptomyces 、Nocardia

接合还可发生在不同属的菌种之间，如 E. coli与Salmonella typhimurium之间或S. typhimurium与Shigella dysenteriae之间

接合：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。

接合性质粒：能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，F质粒、R质粒、Col质粒和毒力质粒。接合作用是在被称为雄性菌株和雌性菌株之间进行的，决定其性别的是一种F因子质粒。

E. coli的接合现象

F质粒是决定大肠杆菌E. coli性别分化的质粒，是一种属于附加体性质的质粒，既可在细胞中单独存在，也可整合到核染色体组上。通过接合而获得；通过吖啶化合物、溴化乙锭或丝裂霉素等处理而发生质粒消除（抑制F质粒的复制）；合成性菌毛基因的载体；决定细菌性别的物质基础。

四种接合型E. coli菌株根据F因子在E. coli中的有无，及与染色体的关系，可将E. coli 分为四种类型：F+（―雄性‖）菌株、F-（―雌性‖）菌株、Hfr（高频重组high frequency recombination,Hfr ）菌株、F?菌株。F+ 、Hfr、F′都为雄菌

F–（―雌性‖）菌株：细胞中不含有F因子，细胞表面不具有有性纤毛。可以通过与F+、F‘或Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、F‘因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、F‘菌株或重组子。据估计，从自然界分离到的2000株E. coli 中约有30%是F–菌株。

F+（―雄性‖）菌株：细胞内含有（1~4个）游离的F因子，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。与F–相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F–细胞中，使之也变成F+菌株。F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。Hfr（高频重组，high frequency recombination）菌株：含有与染色体特定位点整合的F因子。因该菌株与F–接合后的重组频率比F+ 菌株高几百倍而得名。

F‘菌株：细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F–菌株接合，使其成为F′菌株。F′菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失，F因子也缺失一段DNA. l由Hfr异常释放所生成的F‘菌株，称为初生F’菌株；由F–接受外来F′因子所产生的F′叫作次生F′细胞；

F质粒的接合方式：F+×F－Hfr × F－F′ × F－

F质粒四种存在方式及相互关系

接合中断试验：由Wollman和Jacob首创（1955），首先认识了原核微生物染色体的环状特性。Hfr菌株与F–菌株的接合随时都可能被中断，所以极少出现转性的结果，而是形成各种各样的重组子。

R质粒的接合日本首先分离到抗多种药物的宋内志贺菌多重耐药株，多重耐药性很难用基因突变解释。健康人中大肠埃希菌30%~50%有R质粒，而致病性大肠埃希菌90%有R质粒。R质粒与耐药性有关，尤其与多重耐药性有关。耐药质粒从一个细菌转移到另一个细菌中。

R质粒接合R质粒耐药传递因子（resistance transfer factor,RTF）；与F质粒相似，编码性菌毛的产生和通过接合转移

耐药（r）决定子：r-dir能编码对抗菌药物的耐药性，可由几个转座子连接相邻排列，如Tn9带有氯霉素耐药基因，Tn4带有氨苄青霉素、磺胺、链霉素的耐药基因，Tn5带有卡那霉素的耐药基因。

接合R质粒决定耐药的机制：使细菌产生灭活抗生素的酶类；R质粒控制细菌改变药物作用的靶部位；R质粒可控制细菌细胞对药物的通透性

R质粒的接合：细菌的耐药性与耐药性的基因突变及R质粒的接合转移等有关。R质粒有耐药传递因子(RTF)和耐药决定子(r)两部分组成。RTF的功能与F质粒相似，可编码性菌毛的产生和通过接合转移；R决定子能编码对抗菌药物的耐药性。

四、原生质体融合(protoplast fusion)

原生质体融合定义：通过人为的方式，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子的过程。

原生质体与上述各种杂交方式的比较： 1.杂交频率高 2.致育型的限制较少 3.遗传物质的传递更完整

原生质体融合的对象：能进行原生质体融合的细胞有：细菌、放线菌，及各种真核细胞，如霉菌、酵母菌以及高等动植物的细胞。

原生质体的融合步骤如下 1.原生质体的制备：作为制备原生质体的亲本菌株必须具备两个特点： a.具有良好的生产性状，以经融合使优点叠加； b.具有一些稳定的明显的遗传标记

制备原生质体时所选用的菌体一般为对数后期的微生物，不同微生物破壁所用的酶的种类、浓度以及破壁时处理的温度、时间、PH均不同。

2.原生质体融合仅用等量的原生质体混合时，融合的频率很低，加入PEG及Ca2+、Mg2+，可使原生质表面形成电极性，相互吸引，形成聚合物。

3.再生成正常细胞

4.鉴定

二、真核微生物的基因重组

真核微生物的基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。

（一）有性杂交

（二）准性生殖定义：是一种类似于有性生殖，但比其更原始的生殖方式，可使同种生物两种不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致的低频率的基因重组。霉菌的准性生殖包括： 1.异核体的形成 2.杂合二倍体的形成 3.分离?

第五节基因工程

遗传工程是用人工的方法，把一种生物体的遗传物质转移到另一种生物体的细胞中去，使它表现出新的遗传特性来。

包括：细胞核工程染色体工程基因工程

基因工程育种的特点：体外重组性远缘杂交性定向性

基因工程的基本操作步骤 1.目的基因的取得 2.载体的选择

3.目的基因与载体DNA的体外重组

4.重组载体引入受体细胞

1.目的基因的取得从适当的供体细胞的DNA中分离。通过逆转录酶的作用由mRNA 合成cDNA。由化学方法合成特定功能的基因。

2载体的选择优良载体的条件：复制子；高复制率；最好只有一个限制性内切酶切口；带有选择性遗传标记。

符合条件的载体：原核受体—质粒（松弛型）、λ噬菌体；真核人、动物—SV40病毒；真核植物—Ti质粒

3 目的基因与载体DNA体外重组

限制性内切酶处理或人为连接粘性末端低温混合―退火‖ 连接酶使目的基因与载体

DNA连接重组载体（嵌合体）形成

（4）重组载体引入受体细胞

常见的受体细胞：E. coli lB. subtilis lS. cerevisiae

通过转化可将重组载体带入E.coli受体细胞中质粒：转化法氯化钙促进E. coli对质粒DNA和λ－DNA的吸收病毒载体：感染法

第六节菌种的保藏

菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作。

生物进化中：遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性是相对的。

大量：退化性的变异个别：进化性的变异

一. 菌种的退化?1. 菌种退化的表现：生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型等①菌落及细胞形态的改变②生长速度缓慢，产孢量减少③代谢产物生产能力或