支原体PCR检测步骤
支原体PCR检测步骤
一、提取支原体DNA
1，取1ml 细胞培养液，（对照为1ml新鲜培养液）13000g离心5min，用1ml D-PBSA（即无钙离子、镁离子的PBS）重悬，离心再重悬，重复两次。
2，沉淀加0. 2ml D-PBSA重悬，90℃，15min。
3，抽提DNA：氯仿，异丙醇抽提法
二、pcr体系：
灭菌水： 6 ul
F primer：0.5ul
R primer：0.5ul
cDNA 1 ul
d NTP MIX：0.8ul
buffer: 1 ul
放在PCR仪中：进行下列步骤：95℃7min 、72℃3min、65℃2min、72℃5min 打开热盖，美管中加入0.2ul taq酶
继续下面步骤：（95℃4s、65℃8s、72℃16s）每次外延1s 32个循环，
最后延伸72℃10min
附支原体16s 引物：（已blast过）
（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
产物大小：705bp
解脲支原体检查方法
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 解脲支原体检查方法 导语：解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会 解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会表现出来的，而解脲支原体的检查方法有是有很多的，一般在做这个检查的时候都是很多男性出现了尿多尿急尿频繁的现象，所以才到医院做检查，那么解脲支原体检查方法有哪些？ 解脲支原体的检查方法主要有三种，第一种检查方法就是血液检查，主要是通过抽血化验。第二种检查方法就是通过口腔的涂片的培养来进行检查。第三种检查方式就是PCR的技术检测，这种检查方式可以检查出igm的抗体情况，然后再判断感染的情况。这种疾病的治疗可以使用四环素，比如米诺环素、多西环素等等，但是建议最好两种到三种的抗生素结合一起使用，治疗效果更好。 支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细胞，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。 男性支原体检查方法有哪些？男性支原体检查方法如下： 1、血常规：周围血白细胞计数一般正常嗜酸性粒细胞增多。 2、血清学检全：采用补体结合试验着恢复期血清抗体效价比急性预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
1医学检验毕业论文 (三种肺炎支原体检测法的临床应用分析)
毕业论文 题目：三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 地市: 学校: 准考证号: 考生姓名: 王莹 指导老师: 二〇一八年八月十四日
三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 摘要 目的探讨肺炎支原体（MP）咽拭子快速液体培养法、咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清MP被动凝集法（MP-Ab）等方法在儿童MP感染诊断治疗过程中的敏感性方法采用3MP检测法对362例临床拟诊呼吸道（非细菌性）感染的患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，每患儿取咽拭子做快速培养和PCR，同时取血清做MP-Ab检测，对3种方法的检测结果与临床诊断治疗病例进行回顾性分析。结果回顾临床病例诊断MP感染患儿152例。MP快速培养法检出阳性78例，阳性率为51.3%，病程为（4.5±2.6）天；PCR法检测出阳性103例，阳性率为67.8%，病程为（6.2±3.5）天；MP-Ab法检测出阳性127例，阳性率83.5%，病程（8.1±4.5）天。结论 3种MP检测法的敏感性与病程有相关性，临床医生应根据患儿病程选取检测方法，以提高阳性检出率和敏感性。 关键词肺炎支原体，快速培养法，咽拭子聚合酶链反应，血清抗体，配对研究
目录 前言 (4) 第一章文献综述 (5) §1.1 肺炎支原体的定义 (5) §1.2 肺炎支原体的发病机制 (5) §1.3 肺炎支原体的分类 (5) §1.4 肺炎支原体的临床表现 (5) §1.5 肺炎支原体的临床诊断 (5) §1.6 肺炎支原体的实验室检查 (6) 第二章材料和方法 (7) §2.1 样本 (7) §2.2方法概述 (7) §2.3临床诊断MP感染的诊断标准 (7) §2.4实验方法 (7) §2.5统计学方法 .................................................................... .. (8) 第三章结果 (9) 第四章讨论 (10) 结论 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 错误！未定义书签。
支原体检查
附录XIIB支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法 第一法培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基
内。每个稀释度接种3支试管，置36℃ 士1℃ 培养7～14天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定以接种后培养基管数的2 / 3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 )应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。 检查法（1）供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃ ；超过24小时应置一20℃ 以下贮存。 ( 2 )检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 )，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml的支原体半流体培养墓（已冷至36℃ 士1℃ ）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃ 士1℃ 培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃ 士l℃ 培养21天，每隔3天观察1次． ( 3 )结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。 试剂（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank 's平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank ' s溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。 （3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。 （4）封片液量取0.1mol / L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol / L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。 培养墓及指示细胞（1） DMEM完全培养基。 ( 2 ) DMEM无抗生素培养基。
儿童支原体RNA检测及肺炎支原体抗体的比较
儿童支原体RNA检测及肺炎支原体抗体的比较 发表时间：2016-05-09T11:40:39.230Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2016年1月第2期作者：王玉琪 [导读] 比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 王玉琪 浙江大学医学院附属儿童医院浙江杭州 310052 【摘要】目前：通过对肺炎支原体（MP）RNA检测及抗炎支原体抗体（MP-IgM）的研究，探讨两种检测方法在临床中的应用。方法：对208例肺炎住院患儿行呼吸道分泌物MP-RNA及血清MP-IgM测定，比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 【关键词】肺炎支原体；抗体检测；RNA检测 肺炎支原体是（MP）是小儿呼吸道感染常见的病原体之一，可引起上呼吸道及下呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原[1]。MP的实验室检测方法有很多，血清学检测是目前MP感染的常规实验室手段[1]，利用酶联免疫吸附试验，如检测持续高滴度MP-IgM或恢复期抗体滴度较急性期4倍或4倍以上变化可诊断。近年随着分子生物学技术的发展，RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT）技术应用于临床，为MP感染的早期诊断提供了新的检测方法。本研究对本院208例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集呼吸道分泌物及血清同时检测患儿的MP RNA及MP-IgM，现将结果报告如下。 1资料与方法 1.1 一般资料 选择2015年6月1日~2015年12月1日在本院住院的疑似MP呼吸道感染的患儿208例，其中男性106例，女性102例，年龄1个月~13岁。根据年龄分为两组，A组（0~3岁，n=128），B组（3~12岁，n=80）。两组患者的一般资料具有可比性（P<0.05）。 1.2 仪器与试剂 杭州……………… 1.3方法 采集患静脉全血，常规分离血清后检测肺炎支原体抗体（MP-IgM），同时用灭菌棉签采集受试者咽部样本（大于1岁患儿）或痰液（小于1岁）行MP RNA检测。操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。 1.4 肺炎支原体肺炎临床诊断标准：持续咳嗽，可伴有发热，白细胞计数正常或稍高，X线提示两肺均匀一致改变的片状阴影或大叶性肺炎改变。 1.5 统计学处理采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 208例患中，MP-IgM阳性率34.1%（71/208），MP RNA检测结果阳性共率31.2%（65/208），两者比较差异无统计学意义 （P>0.05）。 3 讨论 肺炎支原体（MP）是引起儿童呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎的常见病原体之一，临床表现为干咳、发热，部分患儿可出现胸腔积液、肺纤维化，肺外损害，如皮肤、胃肠道、血液系统损害、骨关节肌肉、中枢神经系统、心血管系统等[2-4]。MP感染症状可持续或迁延数周或数月，常可引起慢性咳嗽和反复呼吸道感染，还可能引起喘息。MP感染患儿临床表现常不典型，常规抗生素治疗效果欠佳，因此，早期诊断对临床治疗有着重要意义。目前，多种检测方法针对MP-IgM，具有灵敏度高，特异性强，操作简便快速的特点，已作为早期诊断MP感染的客观指标而应用于临床。本研究结果显示，208例患儿中，痰液标本或咽拭子SAT法，MP RNA阳性率34.6%，ELASA法测定MP-IgM阳性率29.3%，两者比较有统计学意义（P<0.05），这可能与血清标本留取时间有关，MP感染后约7d可在血清中检测出MP-DNA抗体，疾病早期可呈假阴性[5]。同时，在组内两种检测手段也呈现了不同结果。A组中的MP RNA的阳性率高于MP-IgM的检测 （P<0.01），这可能由于婴儿免疫系统发育不完善，当MP感染后不能产生或产生效价较低的抗体而导致漏诊，提示MP RNA方法更适于年幼儿和免疫损害患儿的MP感染的早期诊断[5]；而核酸检测受年龄影响较小，故阳性率较高。B组中，两种检测方法阳性率分别相比较无统计学意义（P>0.05），说明咽拭子MP RNA检测方法同样具有较高的敏感性，但同时需结合MP-IgM检测结果，以除外假阳性结果。综上所述，MP-IgM检测及MP RNA检测在诊断MP感染均有较高的价值，二者联合应用可提高检测的准确性，为临床诊断提供有力的依据。 参考文献： [1]Vervloet LA，Marguet C，Camargos PA．Infection byMycoplasma pneumoniae and its importance as an etiologicalagent in childhoodcommunity-acquired pneumonias[J]．Braz J Infect Dis，2007，11（5）：507—514． [2]Gaillat J，Elahault A，deBarbeyrac B，et https://www.360docs.net/doc/372667984.html,munity epidemiology of Chlamydiaand Mycoplasma pneumoniae in LRTI in France over 29 months[J].Eur JEpidemiol，2005，20（7）：643-651. [3]Blasi F．Atypical pathogens and respiratory tract infee—tions[J]．Eur Respir J，2004，24（1）：171—181． [4]Hansbro PM，Beagley KW，Horvat JC，et a1．Role ofatypical bacterial infection of the lung in predisposition／protection ofasthma[J]．Pharnlaeol Ther，2004，101（3）：193-210． [5] Kim NH，Lee JA，Eun BW，et a1．Comparison of poly-merase chain reaction and the indirect particle agglutinationantibody test for
PCR法支原体检测
PCR法支原体测定PROTOCOL 生效日期（年-月-日） 有效期至（年-月-日） 分发部门：质量部
1.目的 规范PCR法支原体检测的操作方法。 2.范围 适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。 3.责任 质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。 4.定义 N/A 5.设备、材料和试剂 5.1设备、材料 设备名生产商型号/货号备注PCR仪Thermo ARKTIK5020 N/A VORTEX IKA GENIUS 3 N/A 小型台式冷冻离心 机Thermo HERAEUS Fresco 21 N/A 单道移液器 (10ul,20ul,100ul) Eppendorf Research plus N/A 多功能水平电泳槽Tanon HE-120 N/A 凝胶成像系统BIORAD ChemiDoc? XRS+ System N/A 5.2试剂 试剂名称生产商货号TaKaRa PCR Mycoplasma Detection Set TaKaRa 6601 TaKaRa Ex Taq? TaKaRa RR001A Regular Agarose G-10 Biowest N/A Goldview 国产N/A
10×Loading Buffer TaKaRa 9157 DL5000 DNA Marker TaKaRa 3428A 内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司 6.溶液配制 6.1 50× TAE Buffer 称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml 超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。 6.2 1× TAE Buffer 量取10ml 50× TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。 7.操作步骤 用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR 反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。 7.1 1st PCR反应 7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系） 试剂用量（ul） 内毒素检查用水37.75~38.75 10× PCR Buffer 5 dNTP Mixture 4 MCGp F1 Primer 0.5 MCGp R1 Primer 0.5
肺炎支原体检测方法的选择
肺炎支原体检测方法选择的几个注意点 肺炎支原体（MP ），主要引起咽炎及支气管炎，少数累及肺。以其顶端结构与宿主细胞上受体结合粘附于上皮细胞上，一般为表面感染，除穿透支原体外（艾滋病人感染）大多不侵入血液。产生有毒代谢产物如外毒素或过氧化氢等引起发热及局部细胞损伤。 选择检测方法的注意事项： 1.临床常用全血（指尖血）或血清（橘黄管）检测IgM 来判定肺炎支原体的感染，但是，抗体检测只是各种实验室方法的一种，尚有其他方法可用，如培养及DNA 检测，每种方法各有利弊，对不同病程各有针对性。 2.每一种实验结果都需要另外一种实验结果来验证，正常人咽部或支气管可携带MP ，所以不能用一种实验数据来下诊断。 3.初次感染时， IgM 、IgG 都会产生，再次感染时，有时IgM 不产生。 4.儿童由于初次感染几率大，常能产生IgM ，成人由于机体可能感染过多次，常不产生IgM 。 5. 检测方法的选择需要根据病程确定： <6个月 6-12个月 1-9岁 IgM + IgM — 年龄对IgM 抗体产生的影响
抗体 抗原 MP感染不同时段产物的比较 由此图可以看出： a.感染早期，7天之内以检测抗原为主，宜培养或DNA检测： 培养为“金标准”，据国内文献显示，快速培养法阳性率为24%；PCR--DNA检测为96%。美国一篇文献显示，培养阳性率为5%，DNA为57%。 b.早期未产生抗体，导致延误治疗，后期抗体阳性，病原体消失，导致过用抗生素。 c.7天之后可检测IgM抗体； d.IgM可持续较长时间，感染后三个月抗体浓度依然较高，有的可以终生阳性，如果短时间内检测抗体，常不能分辨是否为MP现症感染或其他感染。 e.感染早期宜病原体筛查，此时抗体尚未产生，可导致延误治疗；中后期适宜抗体检测，主要用于回顾性验证试验，此时病原体消失，可导致过用抗生素。
肺炎支原体两种检测方法的比对分析
肺炎支原体两种检测方法的比对分析 目的：探讨肺炎支原体（MP）咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）两种检测方法的不同。方法：将198例疑似MP感染的患儿根据年龄分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123），分别取咽拭子用PCR法测MP-DNA，取血清用IIFA法测MP-IgM，比较两种方法的阳性率。结果：MP-DNA检测阳性率为57.07%，MP-IgM检测阳性率为47.47%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）。A组MP-DNA阳性率48.00%明显高于同组MP-IgM阳性率25.33%，差异有统计学意义（P＜0.01）；B组MP-DNA和MP-IgM阳性率分别为62.60%、60.98%比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PCR与IIFA联合检测可以提高MP感染诊断的准确性。 标签：肺炎支原体；聚合酶链反应；间接免疫荧光法；肺炎支原体抗体 肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是小儿呼吸道感染的常见病原体之一，主要通过呼吸道传染，临床表现多种多样，以呼吸道感染最为多见，并可引起全身各脏器损害[1]。MP的实验室检测方法有很多，近年来发展的咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）法均具有快速、敏感性高的优点[2]。为了客观评价这两种方法的异同，本研究对198例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集咽拭子和血清同时用咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）检测MP，现将结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料选取本院儿科收治的疑似MP感染的急性呼吸道感染患儿198例，年龄0～12岁，根据年龄将其分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123）。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 仪器与试剂杭州博日line gene PCR扩增仪，ZEISS型荧光显微镜。PCR 法试剂盒由凯杰生物工程有限公司生产提供；IIFA法检测试剂盒由西班牙VIRCELL公司生产提供。 1.3 方法用灭菌棉签采集受试者咽部样本用PCR法检测MP-DNA，同时采集患儿静脉全血，常规分离血清后用IIFA 法检测MP-IgM。操作方法均严格按照说明书进行。 1.4 小儿肺炎支原体肺炎临床诊断标准持续剧烈咳嗽；全身症状比胸部体征明显；X射线所见较体征显著，胸片可见两肺均匀一致的片状阴影成似大叶性肺炎改变，肺门阴影增浓；白细胞计数正常或稍高，血沉多增快；应用大环内酯类效果好，其他抗生素如青霉素、头孢无效[3-4]。 1.5 统计学处理
肺炎支原体及其快速培养法概要
肺炎支原体及其快速培养法 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它既不同于细菌，也不同于病毒，是介于细菌和病毒之间，能在无活细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物。它广泛分布于自然界，与人类、nbsp;动植物的疾病有密切的关系。支原体的种类繁多，造成的危害非常广泛。 作者：罗三艳作者单位：412001 湖南株洲，株洲田心医院检验科支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它既不同于细菌，也不同于病毒，是介于细菌和病毒之间，能在无活细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物。它广泛分布于自然界，与人类、动植物的疾病有密切的关系。支原体的种类繁多，造成的危害非常广泛。目前证明对人体有致病作用的支原体有肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体等几种，但临床以肺炎支原体最为常见［1］。肺炎支原体主要以飞沫传播，引起儿童、青少年呼吸道感染、咽炎、气管炎、肺炎等。近年肺炎支原体感染病例明显增多并有局部流行的趋势，早期诊断极为重要。 1 肺炎支原体的实验室检测方法目前，肺炎支原体的实验室检测方法有支原体分离培养、 PCR法检测质粒核酸、抗体检测、支原体快速培养法、分子生物学方法等。支原体细胞分离培养可获得肺炎支原体，可以确诊。由于支原体分离培养要求苛刻，一般医院实验室难以推广。此法阳性率低，需时3 周甚至更长时间，对临床快速诊断意义不大。PCR法检测质粒核酸快速、特异、敏感，但需昂贵设备，不易普及，且方法过于敏感，容易受污染。传统的冷凝集法检测肺炎支原体的IgM 抗体，方法简单、易行，但其敏感性和特异性均较差，易受病程影响。ELISA 检测支原体抗体法较为简便、可靠。由于发病初期，机体中尚未产生抗体不能被检出，发病时间较长此法才有意义。而快速培养法正以其简单、快速、经济、无创伤等优点，被越来越多的临床实验室所推广，也被越来越多的患者所接受。 2 肺炎支原体快速培养法肺炎支原体快速培养法是利用肺炎支原体的代谢产物使培养基液体中的指示剂颜色发生改变来判断其生长，标本中的其他支原体和细菌则被培养基中的青霉素和醋酸陀抑制［2］。此法操作简便、快速、无痛苦。先从冰箱中取出快速培养基，复温，按常规方法采集患者咽拭标本，将标本棉签浸入培养液，沿瓶壁挤压棉签，取出棉签、丢弃。旋紧瓶盖，登记标本号，35℃～37℃孵育24～ 48h，观察结果。培养基由红色变为绿色、黄色，且仍保持清晰透明，说明有肺炎支原体生长，明显混浊变色者不能视为阳性。培养液颜色不变，应判为无肺炎支原体生长。我院检验科是从2007年4月份开始展开此项检测，共检测293 例疑似肺炎支原体感染病例，阳性病例161 例，阳性率54.9%，及早为临床诊断、治疗肺炎支原体感染提供了依据。 3 讨论近年来，肺炎支原体感染明显上升，危害较大，其临床表现常无特异性，易与一般病毒性感冒相混淆。临床医生为了尽快缓解患者的症状，需根据患者症状、体征及肺炎支原体的相关检测，及早诊断、治疗。快速培养法不受病程影响，感染初期就可检测出肺炎支原体。有资料报道，在肺炎支原体检测的各种方法中，该法阳性病例病程最短，提示病程时间较短的患者选择此法检测的阳性率较高。快速培养法是诊断肺炎支原体的金标准 ［2］。肺炎支原体快速培养法采咽拭标本，采集标本前，用生理盐水漱口。所采集的标本应迅速接种，若不能及时接种，室温保存不超过2h。使用
支原体检测
支原体检验法 1 培养基 1.1 检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey 氏培养基。 1.2 检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基 1.3 检验血清用无血清的支原体培养基 2 检查法 2.1 样品处理每批制品取样3-5瓶，液体制品混合后备用；冻干制品加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。 2.2 疫苗的检测 2.2.1 接种于观察每个样品需同时用以下两种方法检测 2.2.2.1 液体培养基培养将疫苗混合物5.0ml接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。 2.2.2.2 琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的
环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。 2.2.2 对照每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。 2.3 血清的检测取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。 3 结果判定 3.1 接种本物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判定血清或者疫苗不合格。 3.2 阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。 附注：上述小瓶培养基是指在100ml小瓶中盛20ml液体培养基；小管培养基是指在1.0cm*10cm中盛1.8ml培养基。小管与小瓶须用胶塞封口。
肺炎支原体感染的血清学检验
肺炎支原体感染的血清学试验 参考范围： 补体结合试验(CF) <1:8 代谢抑制试验(M1) 阴性 问接血凝试验(PHA) 阴性 酶联免疫吸附试验(ELISA) 阴性 MG链球菌凝集试验<1:40 临床评价： 1．肺炎支原体（MP）是主要的病原性支原体之一，在临床上主要引起上呼吸道感染、气管艾气管炎及支原潍肺炎。过去称为“原发性非典型性肺炎”的病原体中，MP最为常见。约有80％的慢性支气管炎患者合并MP感染。肺炎病例中约有10％～20％由MP引起。MP感染后，可用各种血清学试验检测体内产生的特异性抗体，有助于疾病的诊断。 2．测定病人血清中特异性抗体，常用的方法有CF、MI、PHA和ELISA等，其中CF 试验是诊断支原体肺炎最常应用的方法。支原体有较强的补体结合反应，单份血清抗体效价>1：6 4或恢复期较急性期抗体滴度增加4倍以上即有诊断价值。一般补体结合抗体在感染后7～9天开始上升，3～4周达到高峰，维持4～6个月。问接血凝试验在MP感染的急性期即可出现阳性，血凝抗体可存在数年。代谢抑制试验可测定MP脂多糖胞膜抗原的相应抗体，方法敏感且特异性强。这种抗体的出现较上二者为迟。ELISA所用抗原为MP表面P蛋白，采用间接法检测特异IgM抗体，具有早期诊断意义。 MG链球菌凝集试验是检测患者血清中MG链球菌凝集素效价的一种方法。MG链球菌是从某些原发性非典型性肺炎病人的呼吸道或肺部分离出的一种非溶血性菌株，约有40％～50％的支原体肺炎患者恢复期血清中常产生MG链球菌凝集素，本试验呈阳性，故检测患者血清内凝集素效价对支原体肺炎有辅助诊断意义。本试验还有助于与病毒性肺炎的鉴别，病毒性肺炎不出现MG链球菌凝集反应。 3．采用分离培养的方法检测患者痰、咽拭等标本中的MP，对支原体肺炎具有病原确诊意义，但需要2周以上时间，且阳性率不等，在临床上不能早期、快速诊断。寒冷凝集试验是一种非特异性反应，在临床上常用作支原体肺炎的辅助诊断，约有50％以上病例可出现冷凝集抗体。应用PCR技术检测患者呼吸道分泌物和支气管肺泡冲洗物中MP的DNA，是敏感、特异且快速的实验室诊断方法。 4．影响本试验结果的因素 (1)CF试验的敏感性和特异性不高，所用的MP糖脂抗原可与许多微生物、植物及人体组织有交叉反应。 (2)MG链球菌凝集试验在某些严重感染性疾病也可呈阳性。 寒冷凝集试验 参考范围： 寒冷凝集试验 临床评价： 1．寒冷凝集素是由I抗原刺激机体产生的一种非特异性抗体，属IgM类，在0～10℃的寒冷情况下，能与O型人红细胞或自身红细胞的膜抗原结合，产生凝集现象。此种凝集反应具有可逆性，若将已凝集的红细胞再放置于37℃时，凝集现象即可消失。支原体肺炎患者血清中常可出现高效价的寒冷凝集素，寒冷凝集试验可用于测定该抗体的效价，有助于支原体肺炎的诊断。 2．寒冷凝集素大多在发病后1～2周开始出现，以后继续增高，于病程3～4周达到
药典三部(2015版)-通则-3301支原体检查法
3301 支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。 第一法培养法 推荐培养基及其处方 ⑴支原体液体培养基 支原体肉汤培养基 猪胃消化液500ml 氯化钠 2.5g 牛肉浸液（1︰2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟 精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液500ml 葡萄糖 1.0g 牛肉浸液（1︰2）500ml L-精氨酸 2.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红0.02g 氯化钠 2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟 ⑵支原体半流体培养基按⑴项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂 2.5～ 3.0g。 ⑶支原体琼脂培养基按⑴项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂 13.0～15.0g。 除上述推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度必须符合要求。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）⑴菌种肺炎支原体（ATCC 15531株）、口腔支原体（ATCC 23714株），由国家药品检定机构分发。 ⑵操作将菌种接于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原
体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。 ⑶结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714株）应达到10-4。 检查法 ⑴供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查可贮存于2～8℃；超过24小时应置-20℃以下贮存。 ⑵检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能小牛血清（培养基︰血清为8︰2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支（已冷却至36℃±1℃），每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行代次培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。 ⑶结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。 试剂⑴二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst 33258）浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank’s平衡盐溶液中，在室
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍 （2016年10月16日） 哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。 目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有： 一、培养法 ●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转 接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体 培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。 ●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可 的方法之一。 ●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支 原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最 常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无 法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有细胞 支原体污染的20-50%。 ●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中 收录的培养法支原体检测方法进行操作。 二、荧光染色法 ●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培 养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色， 如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料 染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。 ●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。 ●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污 染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细
支原体检测PCR方法
PCR法检测支原体 实验原理： 通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR条件在进行检测。 实验目的： 检测培养的细胞是否有支原体污染。 实验材料： 0.5 ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100 ul，10 ul）及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10 x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统； PCR引物： LZY-5 Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACG LZY-5 Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG 产物大小：500bp LZY-6 mycotest F ：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT LZY-6 mycotest R ：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC 产物大小：250bp 实验步骤： 1、取样： 直接取培养细胞的培养基上清。 2、PCR（为25ul体系） 1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR 样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
肺炎支原体检测的SOP内容
HQBJS/MYXM-9-2015 SOP文件B9.1【检验目的】 肺炎支原体是人类原发性支原体肺炎的病原体，经呼吸道感染。多发生于儿童、青年，发病初期临床症状不明显，隐性感染和轻型感染较多，也可致严重肺炎，出现头痛、发热、咳嗽等，本试验用胶体金法定性检测人血清中的肺炎支原体IgM 抗体。 B9.2【检验原理】 用肺炎支原体抗原固相硝酸纤维素膜，应用渗滤式间接法原理，检测血清中肺炎支原体抗体。 B9.3【样本要求】 血清样品不能溶血，应为新鲜血清或2℃～8℃条件保存不超过3天。高脂血症血清不能使用。 B9.4【样本采集】 不抗凝血2ml，避免溶血、混浊、或脂血标本 B9.5【试剂盒主要组成成份】 斑点反应板：40块（或20块） 试剂A： 1瓶, 约10ml 试剂B: 1瓶,约8ml, 胶体金标记物 B9.6【储存条件及有效期】 产品应储存在2℃～8℃条件中，不能冷冻；有效期8个月。
HQBJS/MYXM-9-2015 SOP文件 B9.7【检验方法】 滴入二滴试剂A于反应板中央孔中，待完全渗入； 滴入100μl血清于反应板孔中，待完全渗入； 滴加三滴试剂B于反应板孔中，待完全渗入； 渗入三滴试剂A于反应板孔中，待完全渗入。 B9.8【结果解释】 阳性：反应板孔中出现红色圆斑和清晰的红色质控线，为肺炎支原体抗体阳性； 阴性：反应板孔中只显现清晰的红色质控线，为肺炎支原体抗体阴性；失效: 反应板孔中未显现红色质控线，为操作失误或试剂失效。 B9.9【检验方法的局限性】 本试剂试验仅用于检测肺炎支原体抗体而非直接检测肺炎支原体，因而阳性结果并不能确诊是肺炎支原体感染。对患者状况的诊断应结合患者临床体征与症状和试验结果的综合分析。 抗体含量低的血清样品，不能被检测出来是可能的。部份肺炎支原体感染的患者，不产生抗体或产生少量的抗体。此时，可能显示阴性结果。 试验结果可疑时，应用培养基进行培养确诊。
肺炎支原体抗体检测试剂盒(胶体金法)
B19病毒抗体检测试剂盒（胶体金法） 说明书 【产品名称】B19病毒抗体检测试剂盒（胶体金法） 【包装规格】24人份/盒 48人份/盒 【预期用途】用于检测试验血清中的B19病毒抗体(IgM/IgG) 【检验原理】用B19病毒抗原固相硝酸纤维素膜，应用渗滤式间接法原理，检测血清中B19病毒抗体。 【主要组成成份】 1、反应板 24份或48份 2、试剂Ⅰ 1瓶 0.02mol/L PH 7.4 PBS 3、试剂Ⅱ 1瓶胶体金标记物 【储存条件及有效期】产品应储存在2℃～8℃条件中，不能冷冻；有效期24个月。 【样本要求】 1、血清样品不能溶血，应为新鲜血清或2℃～8℃条件保存不超过一周。 2、高脂血症血清不能使用。 【检验方法】 1、滴入二滴试剂Ⅰ于反应板中央孔中，待完全渗入； 2、滴入100μl血清于反应板孔中，待完全渗入； 3、滴加三滴试剂Ⅱ于反应板孔中，待完全渗入； 4、渗入三滴试剂Ⅰ于反应板孔中，待完全渗入。 【结果解释】 阳性：反应板孔中C端出现红色圆斑，T端出现红色圆斑，为B19病毒抗体阳性； 阴性：反应板孔中C端出现红色圆斑，T端不出现红色圆斑，为B19病毒抗体阴性。 失效：反应板孔中C端不出现红色圆斑，或C端、T端均不出现红色圆斑，为试剂盒失效。 【检验方法的局限性】 1、本试剂试验仅用于检测B19病毒抗体而非直接检测B19病毒抗原,因而阳性结果并不能确诊是B19病毒感 染。对患者状况的诊断应结合患者临床体征与症状和试验结果的综合分析。 2、抗体含量低的血清样品，不能被检测出来是可能的。部份B19病毒感染的患者，不产生抗体或产生少量 的抗体。此时，可能显示阴性结果。 3、试验结果可疑时，应用PCR法确诊。 【产品性能指标】 1、批内精密度：阳性符合率和阴性符合率均应≥95%，反应斑点颜色深浅程度应接近。 2、批间精密度：阳性符合率和阴性符合率均应≥95%。 【注意事项】 1、本产品尚未获得产品注册证号，仅供研究，不用临床诊断。 2、试验一旦开始操作，应按操作步骤连续进行，直至结束。 3、试剂盒从冰箱取出时，应使试剂恢复至室温。
肺炎支原体资料
肺炎支原体肺炎的诊断 空军总医院刘春灵 支原体是介于细菌和病毒之间的一类缺乏细胞壁、呈高度多型性、能通过滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。迄今分离到的支原体已达150余种，已确定与人类疾病关系最大的有3种，肺炎支原体（mycoplasma pneumonia, MP）是其中的一种。MP在国内外都是儿童和成人呼吸道感染的重要病原体之一，主要导致肺炎，所有肺炎的15-20%，约50%的儿童和青少年肺炎是由MP引起的.因此MP肺炎（MP pneumonia,MPP）是常见病和多发病。但迄今为止，MPP仍缺乏快速、可靠的诊断试验，因而临床确诊困难。 MPP的诊断包含两个层面：临床诊断（经验性）和结合了实验室病原学检测的确定诊断。 一、MPP临床诊断：根据流行病学、临床症状、体征、实验室辅助检查等特点经验性综合判断而出。MPP有着不同于一般感染性疾病的的特点：一般肺炎多发于冬季，MPP一年四季均可发病，但多发生于夏秋季节；临床症状大多只有发热和咳嗽；外周血白细胞总数大多不高；疾病早期X线检查即可出现肺炎，约10%-20%的病例会出现肺不张；因MP无细胞壁，临床常用的、作用于细胞壁的、安全性高的治疗肺炎的药物如β-内酰胺类的青霉素类、头孢类抗生素对其无作用；因此易被误诊为病毒性肺炎。综合上述特点，可作出初步的经验性临床诊断。 二、实验室病原学诊断：包括直接病原体检测和血清学检测。下面介绍几种常用或经典的MP实验室诊断方法。 （一）直接病原体检测：主要有MP分离培养和聚合酶链反应（PCR）法检测MP-DNA。检测用标本可取自可疑患者呼吸道的痰、咽拭子、鼻咽吸出物、支气管肺泡灌洗液、胸水等。 1、MP分离培养与鉴定：MP很挑剔，培养基的营养要求比一般细菌高，生长速度慢，较一般细菌难培养；分离培养需要10-14天，而通常需要2-5周才能生长成肉眼可见的菌落。通过生化反应和免疫学方法进行鉴定。还有其它影响因素，如MPP无细胞壁，对环境的影响更为敏感，易被灭活；标本采集后接种到培养基的过程也是培养可能失败的一个环节。由于其费时、费力、阳性率低，实际临床已经弃用此方法，目前主要用于研究性项目。 2、PCR法检测MP-DNA：PCR是一种模拟体内DNA复制的体外扩增法，以其灵敏性、特异性高，检测所需时间短，能够直接从标本中检出病原体并可定量及分型，已广泛应用于各种感染性疾病的诊断中，如SARS、禽流感、A/H1N1流感的确诊都主要用此方法。常用于MP 检测的是双引物两次扩增反应的套（巢）氏PCR（nested PCR，nPCR）和基于荧光能量传递技术的实时定量PCR（real-time quantitative PCR），其中实时定量PCR可以检测到少于5个基因拷贝的MP。美国1996年的一次MP感染暴发的流行病学调查，对部分患病者的呼吸道分泌物以PCR检测MP-DNA阳性率为57%，同样患者的MP培养阳性率仅5%。 3、直接镜检：MP没有细胞壁而没有固有型态而呈高度多型性，且革兰氏染色不易着色，因此难于用光学显微镜观察。 （二）血清学检测：检测MPP患者血清抗体有多种方法，传统、经典和常用的有4种，为冷凝集试验、补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验。 1、冷凝集试验（CA）: MP感染后患者血清中产生一种非特异性冷凝集素（IgM型），可能是MP作用于红细胞Ⅰ型抗原，使其变性后产生的自身抗体。将患者的稀释血清与人O型红胞混合，4℃过夜，观察红细胞凝集现象，放37℃后其凝集现象消失，故称为冷凝集试验。