甘蓝枯萎病抗性鉴定方法研究

甘蓝枯萎病是由镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans W.C.Snyder.）引起的土传病害。这种病害首先于2001年在北京市延庆县甘蓝种植基地发生[1]，随后在山西寿阳、大同阳高、河北张家口等越夏甘蓝种植基地陆续发生，尤其是在山西寿阳及阳曲县。由于越夏甘蓝是当地支柱产业，近年来甘蓝枯萎病的大面积蔓延已成为当地甘蓝产业的严重威胁。甘蓝枯萎病首先发现于美国纽约州的哈德逊峡谷[2]，目前在全球大部分夏秋甘蓝种植区均有发生[3-6]。甘蓝枯萎病在生产上的危害主要表现在苗期造成缺苗断垄。成株期发病明显，受害甘蓝病株一般在定植后2~4个星期表现出典型的症状，首先表现出的症状是植株一侧或整个下部叶片黄化，随后向上部叶片发展，叶片和茎部的维管组织变褐，病株逐渐死亡。病株的发病进程与植株的抗病能力和土壤温度密切相关，甘蓝植株在

25~30℃的土壤中一般可在发病后2个星期内死亡。基金项目：国家863计划“优秀多抗蔬菜和果树分子育种技术与品种创制”（2006AA100108）

第一作者简介：田仁鹏，男，1982年出生，硕士研究生，主要从事蔬菜分子育种研究。E-mail ：ttnntt135@https://www.360docs.net/doc/3d8780844.html, 。

通迅作者：康俊根，男，博士，副研究员，主要从事蔬菜遗传育种及分子生物学研究。通信地址：100097北京市海淀区蓝靛厂南路55号北京市农林科学院2443信箱蔬菜研究中心，E-mail ：kangjungen@https://www.360docs.net/doc/3d8780844.html, 。

收稿日期：2008-11-24，修回日期：2008-12-24。

甘蓝枯萎病抗性鉴定方法研究

田仁鹏1,2，康俊根2，耿丽华2，颉建明1，简元才2，丁云花2

（1甘肃农业大学农学院，兰州730070；2北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097）

摘要：甘蓝枯萎病是由镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.Conglutinans ）引起的土传病害，属于中国新发病害，近年来已发展成为中国北部夏秋甘蓝生产区的毁灭性病害，并且发病地域逐年扩大。抗病品种的使用是目前减少甘蓝枯萎病损失的最有效方法。而探索高效的甘蓝抗枯萎病鉴定方法以准确鉴定甘蓝种质资源的相应抗性基因是抗病育种的基础性工作。因此，在前期病原物分离和鉴定工作的基础上，采用来源于山西寿阳的强致病力株GLHW1作为病原，通过混合因子设计方法系统分析了3个接种方法，3个接种浓度及2个接种时期的接种效率及不同因素间的互作效应。结果表明：3个因素对接种效果的重要性影响依次为接种方法＞接种浓度＞接种时期，推荐给甘蓝育种者的接种程序是：在3叶1心期，将幼苗的根系浸入1×106cfu/ml 孢子悬浮液中15min 。

关键词：甘蓝；枯萎病；抗病性；鉴定方法

中图分类号：S635.1文献标识码：A

Study on the Method of Fusarium Wilts Resistance in Cabbage

Tian Renpeng 1,2

,Kang Jungen 2,Geng Lihua 2,Xie Jianming 1,Jian Yuancai 2,Ding Yunhua 2(1College of Agronomy,Gansu Agriculture University,Lanzhou 730070;2Beijing Vegetable Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing 100097)

Abstract:Fusarium

wilt,caused

by Fusarium

oxysporum

f.sp.conglutinans,was

becoming a

destructive disease of warm season-grown cabbage in North of China.The aim of this paper was to explore an optimized

method for screening and identifying disease resistant and susceptible cabbage genotypes.In this study,we took the most virulent isolate from Shanxi,named GLHW1,as the inoculums for optimized method screen.A factorial experiment was conducted to evaluate the effectiveness of different screen method.Based on the results of present study,the inoculation procedure recommended to cabbage breeders is dipping root of cabbage seedling at the 3-true-leaf stage with a suspension of spores containing 1×106spores per milliliter.

Key words:cabbage,Fusarium wilts,disease resistance,inoculation method 中国农学通报2009,25(04):39-42

Chinese Agricultural Science

Bulletin

中国农学通报https://www.360docs.net/doc/3d8780844.html,

表1甘蓝枯萎病抗性鉴定混合因子设计试验表由于引起甘蓝枯萎病的镰刀菌可以在土壤中存活多年。因此一旦一个地区发生病害后，利用传统的病害防控手段如轮作，种子处理，杀菌剂使用及清除病株残体等均对其效果甚微。因此抗病品种的使用是目前

减少甘蓝枯萎病发生的最有效方法[4]。苗期人工接种

鉴定是抗病品种选育和种质资源创新的重要方法，由

于十字花科枯萎病在中国属于新发病害，目前只有李

明远先生[1,7]和张杨等[8-9]对北京市延庆地区发生的甘蓝

枯萎病进行了病原菌的分离鉴定及致病力测定，甘蓝

枯萎病抗性鉴定方法深入研究尚未见系统的报道。近年来，笔者所在的国家蔬菜工程技术中心启动了甘蓝抗枯萎病种质资源创新和新品种选育工作，先期已经分别从北京市延庆县和山西省寿阳县采集了病株并进行了病原菌分离及致病力测定，初步结果表明两地的甘蓝枯萎病原镰刀菌在病原形态上基本一致，但致病力有一定差异，山西寿阳采集的枯萎病菌GLHW1接种后，植株出现症状较为严重，发病较快。鉴于此，笔者以来源于山西的致病力强的枯萎病菌株GLHW1做菌源，对甘蓝枯萎病人工抗性接种方法及发病条件进行研究，通过对不同的接种方法和接种浓度的系统比较，以期建立能准确鉴定甘蓝种质材料抗枯萎病的苗期人工鉴定方法，为甘蓝抗枯萎病的种质资源筛选及新品种的选育提供技术保障。1材料与方法1.1材料供试甘蓝品种为京研四季（感病品种）、夏强（抗病品种），以及供抗病性鉴定的甘蓝品种87份。均为北京农林科学院蔬菜研究中心甘蓝组提供。2007年在北京农林科学院蔬菜研究中心抗病温室内进行接种试验，供试甘蓝种子经0.5%NaClO 消毒1h 后播于10cm×10cm 育苗杯中，培养基质为121℃高温灭菌后的蛭石和草炭（1︰2，V ︰V ）。播种后置于抗病温室，保持稳定的苗床温度为（28±2）℃。1.2供试菌种及接种准备基于前期的致病力检测试验，采用致病力较强的甘蓝枯萎病原镰刀菌株GLHW1(来源于山西省寿阳县田间甘蓝病株，由北京农林科学院蔬菜研究中心保存)。GLHW1菌株接种于装有液体PDB 培养基的培养瓶中在28℃、150r/min 的恒温振荡培养箱内暗培养7天后，菌液用双层纱布过滤后3000r/min 离心10min ，倒掉上清液，将沉淀的孢子重新用无菌水配成所需的不同浓度孢子悬浮液备用。1.3试验设计采用3×3×2混合因子设计方法，3个影响因子和相应水平如表1，共18个处理，每处理3次重复，随机区组排列，每小区10株。

1.4接种方法

在植株三叶一心期和五叶一心期接种，每小区的处理如下：1、浸根法：将育苗杯中的植株轻轻拔起后，将幼苗根部用清水洗净，然后浸入特定浓度的孢子悬浮液中浸泡15min ，期间轻轻震荡，然后重新植入原来育苗杯中。2、灌根法：直接将1ml 特定浓度的镰刀菌孢子悬浮液浇灌在待接种的幼苗根系部位。3、伤灌根法：先用刀片在待接种的幼苗根系一侧将植株的部分根毛切断，给根系造成机械伤害，然后将1ml 孢子悬浮液灌到根系伤根部位。植株接种前24h 内停止浇水，使根系承受轻微干旱以促进病原菌孢子迅速侵入。接种后植株24h 内禁止浇水，防止将根部的接种孢子稀释，随后植株每48h 浇水1次。每处理均设5株清水对照。

1.5病害评价

植株接种后14天进行调查。每个植株以如下分

级标准分级：0级：无病；1级：仅子叶变黄，真叶无症状；2级：子叶枯死，下部真叶变黄；3级：有1、2片真叶枯死，但心叶完好；4级：整株枯死。每处理的病情指数（DI ）计算如下：

DI =

×100%(N =调查总株数，x i =发病级别，i=1，2，3，…n ，n=相应发病级别的株数)

1.6统计分析方法

试验数据用SAS 8.2的PROC GLM 程序(SAS Institute ，Cary ，NC ，USA)按照Kuehl [10]等的方法进行统计分析。处理平均数利用Tukey ’s 显著性检验(Tukey ’sHonest significant difference ，HSD)(P =0.05)进行显著性测验。当互作效应显著时(P <0.05)，进行进一步的互作效应分析。

2结果与分析

2.1抗枯萎病鉴定3个影响因子及互作效应显著性分

析

对甘蓝枯萎病抗性鉴定的3个因素的方差分析结

··

40

果表明，接种方法间及接种浓度间差异极显著（P <0.01），且接种方法和接种浓度的互作效应也达到极显著水平，而接种时期及接种时期与接种方法或接种浓度间互作效应均不显著（表2），这个结果表明在甘蓝枯萎病抗性鉴定中，接种方法和接种浓度影响抗病性鉴定效果的关键因子。而在三叶一心期或五叶一心期接种并不是甘蓝枯萎病抗性评价的重要影响因子。考虑到在较早的时期进行鉴定可以节省时间和空间，而更早的时期进行鉴定则苗子较弱，接种后不容易缓苗，因此推荐在三叶一心期进行接种。2.2不同接种方法及接种浓度的接种效率比较由于不同接种方法及接种浓度对于甘蓝抗枯萎病

鉴定效果有极显著差异，因此笔者进一步对这两个影响因子的不同水平利用Tukey ’s 显著性检验(P =0.05)进行显著性测验（表3）。结果表明：在使用不同接种方法的效果比较中，浸根法和伤灌根法的病情指数要显著高于灌根法，而浸根法和伤灌根法无显著性差异。因此，在甘蓝抗枯萎病接种时采用浸根法或伤灌根法的接种效率较高，而仅仅直接将菌液灌入土壤中接种效果较差。由于浸根法和伤灌根法均存在植株根系伤口，因此这个结果也表明根系受伤能够加速甘蓝枯萎病原镰刀菌的侵染和症状表现。不同的接种浓度比较结果表明（表3），用1×107cfu/ml 和1×106cfu/ml 的孢子进行接种无显著性差异，而使用1×105cfu/ml 孢子悬浮液其病情指数只有11.81，说明菌液浓度低于1×106cfu/ml 后接种效率已经显著下降，不能真实反应植株的抗病性。

2.3不同接种方法及接种浓度的互作效应比较

进一步对具有显著互作效应的两个接种影响因素进行HSD 显著性检验，从表4可以看出，采用浸根法接种时，不同的接种浓度均显著高于伤灌根法和灌根法，但不同浓度间差异不显著，而在采用伤灌根法时，其接种效率与接种浓度高度相关，使用1×107cfu/ml 的接种浓度其病情指数可达到64.58，而使用1×105cfu/ml

的接种浓度则病情指数迅速降低至16.67，已经不能达

到病害鉴定的目的。而灌根法不同浓度均不能在感病

的甘蓝品种京研四季中充分发病。这说明在抗病性鉴

定的影响因素中，接种方法是第一影响因素，在采用灌

根法时，接种浓度在1×106cfu/ml 左右均可达到较好的

接种效果，但在使用伤灌根法时，对接种浓度较为敏

感，使用较高的接种浓度如1×107cfu/ml 或更高的浓度才能达到较好的接种效果。而直接灌根法使用较大的浓度也不能达到抗病性鉴定的目的。

3结论与讨论

甘蓝枯萎病，由于其造成的主要病状是植株叶片变黄萎蔫，因此国内外也有人称其为甘蓝黄萎病（Yellows of cabbage ）[5]，其病原为镰刀菌。在中国属于新发病害，目前只有李明远等[1,7]和张杨等[8-9]对北京市延庆地区发生的甘蓝枯萎病进行了病原菌的分离鉴定及致病力测定，甘蓝枯萎病抗性鉴定方法深入研究尚未见系统的报道。笔者分别分离鉴定了北京延庆和山西寿阳的甘蓝枯萎病原镰刀菌并对其进行了致病力分

化研究，病原形态学观察与李明远先生报道的十字花科枯萎病原菌的鉴定结果基本一致。但其致病力有一

变异来源 自由度(d f ) 平方和(S S ) 方差(M S ) F 重复 2 156.25 78.12 0.42 接种方法(I M ) 2 65833.33 32916.67 177.59** 接种浓度(I D ) 2 7239.58 3619.79 19.53** 接种时期(S ) 1 489.00 489.00 2.64 I M *I D 4 5781.25 1445.31 7.80** I M *S 2 162.04 81.019 0.44 I D *S 2 1776.62 888.31 4.79 I M *I D *S 4 1869.21 467.30 2.52 误差 34 6302.08 185.36 表2不同接种方法接种效果显著性分析注：**表示在P =0.01水平下具有显著差异。表3不同接种方法及接种浓度的接种效率比较注：每一列中不同字母表示P =0.05水平下具有显著性差异，下同。田仁鹏等：甘蓝枯萎病抗性鉴定方法研究表4接种方法和接种浓度的接种效率互作效应分析互作效应 平均数

浸根法×1×107 c f u /m l 100 A 浸根法×1×106 c f u /m l 95.83A

浸根法1×105 c f u /m l 89.58A

伤灌根法×1×107 c f u /m l 64.58B

伤灌根法×1×106 c f u /m l 43.75C

伤灌根法×1×105 c f u /m l 16.67D

灌根法×1×107 c f u /m l 14.17D

灌根法×1×106

c f u /m l 4.58D E

灌根法×1×105

c f u /m l 2.08E

H S D (0.05)* 12.11

注：*表示显著差异(P <0.05)。

·

·

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定程度的差异，来源于山西寿阳的病原镰刀菌株GLHW1致病力较强（另文发表）。由于目前山西寿阳是全国重要的甘蓝生产基地，越夏甘蓝是当地支柱产业，近年来甘蓝枯萎病的大面积蔓延已成为当地甘蓝产业的严重威胁。甘蓝抗枯萎病鉴定是甘蓝抗病育种的一个基础性工作，而室内人工接种是抗病育种的重要组成部分，由于其具有快速高效、鉴定材料数量不受限制、环境条件人为可控的优点。因此在建立了高效的甘蓝抗枯萎病室内人工接种

鉴定方法后，就可以同时大批量筛选抗源、使育种工作者及时了解掌握育种材料的抗感性，从而合理选配亲本组合并迅速选育出抗病优良品种供生产上推广应用。因此率先在国内利用致病力较强的GLHW1菌株，进行了甘蓝抗枯萎病鉴定评价方法的分析。参照瓜类及茄果类枯萎病抗性鉴定方法的研究，影响接种效果的主要有3个影响因素，即接种方法，接种浓度和接种时期（苗龄）。因此笔者利用3×3×2因子设计方法设置了18种处理方法，对这3种影响因素及其相互的互作效应进行了较为深入的分析，确定3个影响接种效果的因素其重要性依次为接种方法＞接种浓度＞接种时期。接种时期在苗龄三叶一心期或五叶一心期接种无显著差异。这个结果与芦燕等在黑腐病等的研究结果一致[11]，考虑到在较早的时期进行鉴定可以节省时间和空间，而更早的时期进行鉴定则苗子较弱，接种后不容易缓苗，因此推荐在三叶一心期进行接种。接种方法是抗病鉴定最重要的影响因子，采用浸根法接种效果最好，而且这种方法对接种浓度的高低不敏感，即用1×106cfu/ml 左右的枯萎病孢子悬浮液均可获得较好的鉴定效果。采用伤灌根时要求较高的病原菌孢子浓度，可采用1×107cfu/ml 或更高的浓度才能达到较好的接种效果。由于浸根法和伤灌根法均存在植株根系伤口，而仅仅直接将菌液灌入土壤中接种效果较差。因此这个结果也表明根系受伤能够加速甘蓝枯萎病原镰刀菌的侵染和症状表现。

综合考虑各因素，甘蓝枯萎病抗性鉴定接种的推荐方法为：接种时期为苗龄三叶一心期，采用浸根法接种，在1×106cfu/ml 的孢子悬浮液中浸泡15min 。如果为了省工省力，采用灌根法，则必须人为制造根系伤口，以加速病原菌侵入，同时应采用1×107cfu/ml 或更大的接种浓度以保证足够的病原菌数量。

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42