LEK_China BD Forum_August 2012_pub_EN
Collaborations Between Local and International Pharmas in China: Opportunities Along the Value Chain
August 24, 2012
iKbKhK=`???ì?íá??=iá?áíé?I=c???ê=PQI=`fqf`=pèì~êéI=NNSU=k~?àá??=o?~?=té?íI=pü~??ü~á=OMMMQNI=`üá?~==
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Global Capability
Life Sciences Experience & Expertise
20 offices worldwide, including 2 in China Founded in 1983 in London; 1998 in China 900+ consulting professionals; 100+ partners Advised 25% of largest 200 companies globally
Highly differentiated from peer consultancies in analytically driven decision-making
Leading advisor to life sciences companies around the world with over 3000 engagements ; advised 9 of the top 10 pharmas, 4 of the 5 top global biotechs and more than 150 biotechnology companies More than US$115B in transactions in life sciences
Awarded Healthcare Sector Adviser of the Year 2010 by Acquisitions Monthly and Consultant of the Year at the 2011 Health Investor Awards On the ground capabilities and experiences in China; over 50 projects in 2011 in China life sciences and healthcare
L.E.K. Consulting is a leading global strategy firm with a strong focus on life sciences
Medical devices and diagnostics
Sample Client List -Confidential
Biopharmaceuticals
L.E.K.’s China life sciences practice supports a wide range of healthcare clients
R&D and others Consumer health Financial investors
China, already the third largest pharmaceutical market in the world, is expected to be a major value driver of the global pharma market
China
Russia
Japan
Canada
U.S.
UK Asia Pacific
Spain
Germany Italy
France 15-20%10-15%5-10%0-5%
CAGR*2010-15F Pharmaceutical market growth rate* by major market (2010-15F)
The worldwide contribution of the Chinese pharmaceutical market is expected to continue growing through 2015, eclipsing the growth contributions of the U.S., EU5,
and Japan combined
Latin America
Africa
Note: * Constant USD exchange rate
Innovation
Reach 40 new biopharmaceutical drugs with domestic intellectual property rights Establish R&D hubs
Innovate education model to create ideas and foster innovation abilities
Accelerate use of new technologies, materials, techniques and equipment to improve traditional industry
Industry restructuring and upgrade
Build large scale businesses with globally-known brands and core competitiveness Build 5 global top 100 biotech companies by 2020
Create 1-3 major national pharmaceutical distributors with over RMB100bn in
revenues
Open up to foreign investment Three key themes in healthcare initiatives in the 12th Five Year Plan
The 12 Five Year Plan (2011-15) features a number of goals and directions which both inspire and challenge the local companies
Increase coverage and quality of services
Increase insurance coverage Improve public hospital services
Improve services for family planning, women, children, elderly and disabled
Guarantee drug safety
Some Chinese pharmaceutical companies have achieved better performance than others over the past five years
01
2
3
4
1
2
3
45678
Revenue multiple vs. 2007(multiple)
Stock price multiple vs. Jan. 2007(multiple)
Tianjin Tianyao Anhui BBCA
Shanghai Shyndec
Apeloa
Jinling Pharma
Livzon Pharma
Sanjing
Baiyunshan
Hengrui
Joincare Pharma
Northeast Pharma Hisun
Guangzhou Pharma
Shuanghe
Fosun
Taiji
Harbin Pharma Better performance in both revenue and stock price
Indicative 2011 revenue
Shenzhen Pharma index growth
North China Pharma
China Resources Sanjiu
~10% CAGR (GDP growth)
Overview of leading A-Share listed Chinese pharmas*(2007-2011)
~20% CAGR
(healthcare spend growth)
The better performing companies have used deliberate and multi-
pronged strategies to succeed, and are continuing to improve their capabilities
Growth
strategy
Business upgrade
Strong R&D investment
Strong marketing
capabilities
Business upgrade
Strong R&D investment
Strong manufacturing
capabilities
Strong capital operation
capabilities
Aggressive joint ventures,
mergers and acquisitions Leading branded generic
manufacturer
China’s innovative drug
pioneer
Leading CMO for MNC
pharmas
Leading branded generic
manufacturer
Healthcare conglomerate
with diversified businesses Positioning &
business
model
Areas of
improvement
M&A and partnership
capabilities
Advanced marketing
capabilities
Capabilities to efficiently
integrate and optimize
portfolio companies
But overall, China has a generic, highly fragmented industry, which makes the 12FYP goals aspirational and difficult to accomplish without external support
Over 5,000 Chinese pharmaceutical companies
-about 3,000 companies focus on API, finished drugs and biologicals
-about 2,000 companies focus on TCM
Generics account for over 80% of prescription drugs by hospital revenue
6 of the top 10 pharmaceutical companies in China are MNC companies*
Among Chinese companies, top 10 account for ~15% of the total revenue* of all Chinese companies in 2010
Collaborations –from partnerships and licensing to joint ventures to even acquisitions –can be useful ways for Chinese pharmas to jump start the process and transition to global pharmas with innovation and brand
more easily and faster than they can do on their own
China cross-border and internal M&A activities in healthcare have been increasing active, worth over USD13.3bn in the last six years
Note: * Excludes deals that only involves PE/ VC investment 12
6
44
2
5
1015
Number of deals 11
128
10
14
809
08
4
207
200632
112
12
1
5
10
15
1009
5408Number of deals 11
43
072006Outbound* M&A:
Corporate healthcare
Inbound* M&A:
Corporate healthcare
New deals
Add’l investment to existing entities
192
227
216
207
183
1170
50100
150
200
250
Number of deals 11
100908072006In-China* M&A:
Corporate healthcare
USD2.9bn value from 2006-11
USD550.6mn value from 2006-11
USD9.9bn value from 2006-11
All deals
Note: * Based on ChinaVenture definition, including pharmaceutical, medical device, biotech, healthcare services, and health management 0
20406080100120140160Number of investment 11
101
10
156
09
85
08
9407
80
2006
47
VC
PE Angel N/A 0200
400600800
1,0001,200
1,4001,600644
1,174
10
2006
Millions of USD 11
829
07
1,469
09
614
08
922Angel VC
PE Financial investment deal numbers in China’s healthcare sector*
CAGR%(2006-11)
17
CAGR%(2006-11)
13
Financial investment value in China’s healthcare sector*
VC/PEs have also invested over US$6b since 2006 in the China
healthcare space to support the upgrading and expansion, with both deal numbers and size of deals growing
In addition to M&A, partnerships can take many forms, with a range of control options
Partnership types
Acquisition Joint venture (JV)(controlling stake)Co-promotion Licensing
Partnership considerations Regulatory requirement Market launch and access timeline Investment constraint Long-term strategy Short-term tactics Product portfolio
Number of impacted markets Steps of the value chain Risk control
… and others
Joint venture (JV)(minority stake)Distribution agreement
Co-development I n c r e a s i n g c o n t r o l
Collaborations between companies can also span across the value chain
Research
Development Manufacturing
Sales and marketing
Products co-development in early stage of clinical trials Manufacturing agreement
Partnership for the commercial success
Hisun / Pfizer
Simcere / MSD
Tasly / ICON
Hutchison MediPharma / Eli Lilly
3SBio / AMAG
Innovation
Industry upgrade
Chinese pharmas have increased their innovative activities and have been increasingly in-licensing, and even out-licensing, early stage compounds
From To Date Partnership type
/ Geo. direction
Clinical
stage
Comments
Alnylam Pharma Ascletis Pharma
(Sino-U.S. JV)
Jul-2012
Co-development /
into China
Phase II
Ascletis to receive the rights for the development and
commercialization of a liver cancer RNAi treatment in the Greater
China region
Ascepion Pharma Debiopharm
(Switzerland)
Jun-2012
Out-licensing/
from China (global
rights)
Pre-clinical
Ascepion out-licensed the worldwide rights of its kinase inhibitor
cancer treatment molecule to Debiopharm
Kinex Pharma (U.S.)Xiangxue Pharma May-2012
In-licensing /
into China
Pre-clinical
(U.S. IND
planned)
Xiangxue to acquire the Greater China rights to a cancer drug
potentially for brain tumor
Evotec AG (Germany)Conba Pharma May-2011
In-licensing /
into China
Phase I
Conba Pharma to develop and commercialize Evotec’s early stage
anti-inflammatory drug in China
Hutchison MediPharma AstraZeneca
Dec-2011
Co-development /
from China
Phase I
MediPharma to lead the development, registration, and
commercialization of Volitnib, a lung cancer drug, in China. The two
companies will share the development costs
Roche Hua Medicine Dec-2011In-licensing /
into China
(global rights)
Pre-clinical
(U.S. IND
ready)
Hua Medicine in-licensed from Roche the worldwide rights to
Roche’s diabetes compound
Bristol-Myers Squibb Simcere Pharma Dec-2011
Co-development /
into China
Phase II
A second collaboration between Simcere and BMS; in this deal, the
two companies co-developed a cardiovascular drug. Simcere has
the China rights to the drug
Shanghai
Institutes for Biological Sciences (SIBS)Sanofi-Aventis Dec-2010
In-licensing
(global rights)
Pre-clinical
In Dec, 2010 Sanofi-Aventis in-licensed global rights from SIBS for a
molecule that inhibits the slit-robo signaling path that controls tumor
vasculature and growth;In May,2012 Sanofi-Aventis announced
that it will begin Phase I trials in China in 2013 for a novel drug for
liver cancer stemming from this molecule
Recent transactions involving early stage compounds
Many innovative products developed in the Western markets can be licensed for China market commercialization
Global products available to partner for China –May 2012
Indications of sample products
Therapeutic area No.of products
available
Neurology9Pain management, epilepsy
Endocrinology5Diabetes
Gastroenterology5Ulcerative colitis,Crohn's disease
Immunology / infectious diseases3MRSA
Oncology3Colon cancer
Pulmonary / respiratory diseases3COPD
Dermatology1
Hematology1
Musculoskeletal1
Nephrology / urology1
Ophthalmology1
Total33
Hisun’s JV with Pfizer gives it the springboard to jump onto the global stage with finished products
Partnership scheme
Independent joint venture, total investment of US$295m, focused on branded generics in China and globally JV will integrate both companies’ resources in generics to achieve synergies in R&D efficiency and manufacturing cost
-Pfizer’s global R&D expertise in generics -Hisun’s strong manufacturing capabilities
-both companies’ sales networks, particularly Hisun’s network in lower level hospitals in China -Pfizer’s global footprint
Pfizer
Announced in 2011, JV memorandum agreement signed, Hisun with majority share Major partner Partnership benefits
Hisun expands its finished drug portfolio and US cGMP compliant plants and products Pfizer gains quicker access to the branded generics market in China than can if going alone, and an additional source of quality manufactured products
Simcere is using the MSD commercial JV to bootstrap its sales and marketing capabilities overall
Partnership scheme
Independent joint venture for the branded generics market in China; initial focus on cardio/cerebrovascular and metabolism JV will integrate both companies' products in these two therapeutic areas to form a strong product portfolio and will hold exclusive right to market these products in China
-MSD’s Zocor, Cozaar, Renitec and Januvia -Simcere’s Xinta and Shufutan
Both companies’ sales networks are also expected to be leveraged for a
comprehensive network for the JV, integrating MSD’s strength in tier 1 cities and Simcere’s in tiers 2&3 cities
MSD (Merck Sharp & Dohme) Announced in 2011
Major partner Partnership benefits
Simcere is using this opportunity to learn MNC sales and marketing techniques to benefit its future innovative product pipeline MSD creates new access to market segments that it is unable to reach on its own
DRAFT
In drug safety and quality, ensuring consistently high quality is a must for Chinese pharmas to gain Chinese and international patient acceptance
Quality partnerships
Example measures
‘Harder’ quality measures‘Softer’ quality measures
Potential measures of pharmaceutical
quality and drug safety
cGMP compliant facilities
Verifiable use of authentic APIs
Consumer / physician complaints
Adverse event reporting (ADR)
systems
Drug packaging tracing systems
Improvement in clinical efficacy
Safe, reliable supply
Patient trust / brand
Pharmacovigilance system
Compliant supply chain system
Relatively easy to deliver
improvement based on increasing
investment
Softer measures difficult to evaluate,
and many Chinese pharmas may
not choose to invest
Status
today
This is a necessary step for Chinese pharmas to become truly international
Innovation
Reach 40 new biopharmaceutical drugs with domestic intellectual property rights
Establish R&D hubs
Innovate education model to create ideas and foster innovation abilities
Accelerate use of new technologies, materials, techniques and equipment to improve traditional industry
Industry restructuring and upgrade Build large scale businesses with globally-known brands and core competitiveness Build 5 global top 100 biotech companies by 2020
Create 1-3 major national pharmaceutical distributors with over RMB100bn in revenues Open up to foreign investment Three key themes in healthcare initiatives in the 12th Five Year Plan
The successful Chinese pharmas are already partnering to support innovation, branding and upgrading in this complex market
Increase coverage and quality of services
Increase insurance coverage Improve public hospital services
Improve services for family planning, women, children, elderly and disabled
Guarantee drug safety
Success in the 12FYP means pharmas should focus on their core business, integrate internal and external resources along the value chain, and actively seek partnerships to maximize their capabilities to become the national champions
In the collaborations, its inevitable that the Chinese and international partners may have different needs and considerations
Technology transfer
IP protection
Access to global market Jump start in China
Contracts Principles
Consideration/needs of Chinese partners Consideration/needs of international partners
Maximize scale Maximize profit Potential conflicts
Successful partnership
Shared objective
“Chinese way”
Western-style management
Some questions to consider in collaborations between local and international pharmas in China
When is a partner needed?
Do Chinese companies need partners in China? What is the benefit?
Can international companies succeed in China without partners?
What are the expectations of Chinese parties? Of the international parties?
What are the expectations on funding –from government, the companies involved, financial partners?
For a Chinese company going outbound, how different are the international deals different from deals in China?
What can be trusted? What should be due diligenced?
How to sustain the partnership and achieve long term success?
How does one get started ?
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
最新流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓
将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析
FACAria流式细胞仪操作程序
、准备工作 1，清洗偏转板，防止盐离子影响电荷加载，电流偏转。 1）用超纯水沾湿医用棉签，擦拭偏转板所有金属物件。再用干棉签擦干。 2）5ml 注射器吸超纯水，清洗缝隙。用滤纸先吸水，再用干棉签擦干。 2，鞘液桶加液 3, 喷嘴超声，喷嘴放入超纯水中，超声2min。用滤纸吸干水分，晾干。 二、开机启动 1, 启动电脑，密码BDIS,点开软件，无密码 2，机箱侧面依次打开总机开关，蓝色、红色激光。 3, 液流启动：Cytometer --- FiuidSetup 1 ）气路（透明管）、液路（蓝色管） ,从乙醇桶上拔下,插到鞘 液桶 2）闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置,旋转至12 点方向 3）取下闭合喷嘴 4）将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。 4, 喷嘴压力切换：菜单栏中Sort---SortSetup --- 70um （选择当前使用的喷嘴大小） 5, 液流调整：
点开电脑界面中70um图标栏里的Stream，从打叉状态变为打勾。查看是否都处于正常状态：1）打开仪器机箱，查看液流是否流到废液槽。如果偏离，拧开两边的螺丝，左右推动使液流到达槽内，拧好螺丝。 2）查看电脑界面，液流图像是否稳定，如果有黑白灰图片变化，用棉签擦拭偏转板上方 3）查看电脑界面，液流是否在中央，如果不是，可以手动调整仪器摄像头，或者重新插好喷嘴。 4）机箱中查看激光束是否完好通过，用干棉签挡住通过位置，如果看到激光射出，则正常。然后关闭主机箱外盖。 调整液流：通过调整振幅来实现。 1）振幅Ampl,数值调大，使液流断滴在上1/3处，即2滴连续液流。 2）频率Freg ，一般不动。 3）Gap：当喷嘴为70um时，数值一般为7、8、9。100um时，为10, 、11 、12。 4）当Ampl和Gap都稳定时，把实际值（后面）手动输入到确定值的框内（前面）。 5）点击StreamSpot ，锁死数值，保持液流稳定。 Dropl :实际值和确定值，变化幅度保持在10以内。 Gap：实际值和确定值，变化幅度保持3以内。此视为稳定液流。 三、手动调补偿： 样品：Negative （双阴管），FITC（单阳），PE（单阳）
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
流式细胞仪操作方法
一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)
流式细胞仪使用方法
流式细胞仪的使用方法及相关资料 仪器名称：流式细胞仪 生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法： 一．开机程序 1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。 2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。 4．如果需要打印，打开打印机电源。 5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。 7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。 二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。 3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。 三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1，2，3，4获得此四个对话框。 4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周
流式细胞仪操作方法
一、样品制备 1、取样（大约1×106cells ），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl 的Rnase（GenScript 试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl 的PI染液（GenScript 试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells ， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3 满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLo）w，拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput ）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDB。Y如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell 中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDB，Y 5 分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQues，t 最大化，选散点图标，打开，Plot type 选择Acq-analysis ，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H （选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type 选择Acq-analysis ，X参数选择FL2-H 1024（此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实 验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H）
流式细胞仪操作流程
查看文章 流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 l PBS溶液（配制方法见附录）； l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去
BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_20140520
电子版本: \\NOVOPUBLIC\NovoBio\流式细胞仪\BD FACSCalibur 流式细胞仪简易操作步骤 _corr_ZYH_20140520 - 1 - BD FACSCalibur 流式细胞仪 简易操作步骤 一、开机 1） 先打开净化交流稳压电源，其次打开110V 稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。 2） 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT 位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN 位置。 二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件 1） 在屏幕下方点击CELLQuest （第四个图标） 启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。
2）从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。 3）在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。 4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024；如果是双标，Y轴选择：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)，如果是单标，Y轴选择：SSC-H。 点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。
BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册
BD FACSCalibur流式细胞仪 FACS101 Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报https://www.360docs.net/doc/3f9633920.html,/bdb/index.html。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载https://www.360docs.net/doc/3f9633920.html,/bdb/10-5-3-1.html。 如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载https://www.360docs.net/doc/3f9633920.html,/bdb/10-5-4-1.html。 一、BD FA CSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）
3. 仪器面板： 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制： LO：样品流速：12 μl /min MED：样品流速：35 μl /min HI: 样品流速：60 μl /min 功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器 恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 1.软件，选择“联机”。 Acq Connect （1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起 来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的 研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断， 对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术 是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。 （一）原理一 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 （二）操作步骤 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用 于本法） 用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5X 106?IX 107/ ml 取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb（5?50卩I） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50卩I 1 : 20（用DPBS （或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇 J 4 C 30mi n 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpmx 5mi n J] 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光 显微镜下观察，视细胞浓度加入100?500 ^1固定液） FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 （标本在试管中可保存5?7天） （三）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
流式细胞仪操作方法
流式细胞仪操作方法
一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X 参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)
流式细胞仪操作规范
流式细胞仪操作规范 Prepared on 22 November 2020
流式细胞仪的操作规范 1.CXPCytometer：仪器操控软件，可与机器连线，收取ListModeData，也可 进行简单的Data分析。 2.CXPAnalysis：离线分析软体,可进行较繁复的Data分析,包含等高线图 (ContourPlot)”、密度图(DensityPlot)、岛屿图(SurfacePlot)、透试图 (Tomogram)、叠图(OverlayPlot)的绘制,多档案分析与批次分析。 一、基本开机步骤与软体主画面说明。 1.依常规模式进入Window20000系统。 2.双点桌面上，即可启动机器并进入操作软体。此时您可见到下面的画面： 3.选取您自己的资料夹（请在Password处输入密码），并按下Next继续。接 着您能看到下面的画面： 4.此时您能在左边的视窗选取您即将使用的Protocol，然后按下Finish进入软 体，或不选取任何Protocol，直接按下Finish进入软体，您即可见到软体的工作区（workspace），如下图： 工作区分成三部份： a.工具列（CXPToolbars）: b.档案总管(ResourceExplorer): 利用滑鼠在做切换，让您能够看到您专属资料夹中的Worklists、Panels、Protocols、LMDData和HSTData等档案。若要开启档案总管中的资料时，只需利用滑鼠将这些档案直拖曳至软体的桌面上，便可打开各式档案或分析Data。
c. 工作清单编写区（AcquisitionManager）： 利用工作清单工具列您可以在此处编写您即将要收集的样本内容，包括设定本次实验的染剂名称参数名、 ListModeData存档的模式等等。 二、开关机 开机前之准备：补充PBS（约8~9分满）和Clenzsolution（约8~9分满），并倒去废液瓶中之液体。 开机：依一般程序开启您的电脑，点选桌面上的图示，即可进入软体。 关机： 1、准备一管5%bleach（μmfilter过滤）以及两管diwater。 2、选取这个protocol，并编写一个三管的工作清单。 3、依程序上机清洗（5%bleach→diwater→diwater），各管高速冲洗 300sec（最后一管所冲出之颗粒务必少于15个，若仍然大于15 个，请重复1-3的步骤，或执行Cleanse这个指令后，再重复1-3的 步骤）。 4、按下软件右上角的关闭软体。 5、点选桌面上的图示，您会听到机器关闭的声音。 6、若回到windows作业系统，按荧幕左下方“start”一下，移动滑鼠到 shutdown，再按一下，选择“shutdown”。 7、关闭萤幕电源，电脑主机电源，印表机电源。
FACAria流式细胞仪操作程序
一、准备工作 1，清洗偏转板，防止盐离子影响电荷加载，电流偏转。 1）用超纯水沾湿医用棉签，擦拭偏转板所有金属物件。再用干棉签擦干。 2）5ml注射器吸超纯水，清洗缝隙。用滤纸先吸水，再用干棉签擦干。 2，鞘液桶加液 3，喷嘴超声，喷嘴放入超纯水中，超声2min。用滤纸吸干水分，晾干。 二、开机启动 1，启动电脑，密码BDIS，点开软件，无密码 2，机箱侧面依次打开总机开关，蓝色、红色激光。 3，液流启动：Cytometer----FiuidSetup 1）气路（透明管）、液路（蓝色管），从乙醇桶上拔下，插到鞘液桶 2）闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置，旋转至12点方向 3）取下闭合喷嘴 4）将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。 4，喷嘴压力切换：菜单栏中Sort---SortSetup----70um（选择当前使用的喷嘴大小） 5，液流调整： 点开电脑界面中70um图标栏里的Stream，从打叉状态变为打勾。查看是否都处于正常状态： 1）打开仪器机箱，查看液流是否流到废液槽。如果偏离，拧开两边的螺丝，左右推动使液流到达槽内，拧好螺丝。 2）查看电脑界面，液流图像是否稳定，如果有黑白灰图片变化，用棉签擦拭偏转板上方 3）查看电脑界面，液流是否在中央，如果不是，可以手动调整仪器摄像头，或者重新插好喷嘴。 4）机箱中查看激光束是否完好通过，用干棉签挡住通过位置，如果看到激光射出，则正常。然后关闭主机箱外盖。 调整液流：通过调整振幅来实现。 1）振幅Ampl，数值调大，使液流断滴在上1/3处，即2滴连续液流。 2）频率Freg，一般不动。 3）Gap：当喷嘴为70um时，数值一般为7、8、9。100um时，为10,、11、12。 4）当Ampl和Gap都稳定时，把实际值（后面）手动输入到确定值的框内（前面）。 5）点击StreamSpot，锁死数值，保持液流稳定。 Drop1：实际值和确定值，变化幅度保持在10以内。 Gap：实际值和确定值，变化幅度保持3以内。此视为稳定液流。 三、手动调补偿： 样品：Negative（双阴管），FITC（单阳），PE（单阳），Sample（FITC,PE双阳）1，Browser中：建立文件夹（单击folder图标）-----建立文件（单击experiments图标），出现CST新窗口，选择keepcurrentcytomotersetting-----建立样本，单击注射器图标，出现spcimen----点开下面的+号，出现Tube，点成绿色。 以上文件最好都改名，分别右击英文，raname。 2，Inspect对话框中看参数，Cytometer中调参数。
流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项
流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项 (一)原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二)操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) (三)试剂和器材 1.各种特异性单克隆抗体。 2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四)注意事项 1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液) NaCl 80g KCl 2g 蒸馏水加至1000ml Na２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释 KH２PO４2g 2.洗涤液 DPBS900ml FCS 50ml (终浓度5％) 4％NaNO３终浓度0.2％) 3.固定液 DPBS1000ml 葡萄糖20g (终浓度2％) 甲醛10ml NaNO３0.2g (终浓度0.02％) 流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的 结果。 (一)原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二)操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) (三)试剂和器材 1.各种特异性单克隆抗体。 2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
流式细胞仪操作流程(单标)
流式细胞仪操作流程(单标) 一、开机(务必按照此顺序开机) 1、打开下面的小门，推上电源 2、打开插线板电源开关 3、开电脑 4、打开流式细胞仪开关 二、软件准备 1、打开软件 2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和 shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen—— new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。 3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方 图。以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。 4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。 三、上机操作 1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data， 此时流式细胞仪开始工作。 2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和 SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。 3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中 出现P1，并且其中的细胞变成红色。 4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图 2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。 5、在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FITC，使其细胞散点图在图2中 处于103以内，直方图的峰值在0－103之间。选择右侧显示屏中的Interval Gate 选项，在图3中点击并选定103数值右侧区域，图中显示P2。调节FITC电压，使P2的百分比值尽量在0.5%以下，并尽量使图3中的图象呈正态分布图。 6、在Acquisition Dashboard中选择stopping gate内的P1，点击record data,机器自动记录数 值。 7、记录完成后，点击remove tube，并将试管取下。 8、放置需要检测的试管，并点击acquire data，机器自动记录数值并在右侧显示屏中显示， 单击record data，记录结果；每一次取下试管前均需点击remove tube，并在出现的进程框未消失前将试管取下。 四、关机 1、实验完成后，点击菜单栏Cytometer内的shutdown选项，在出现的对话框内选择确定， 待系统清洗完毕后在出现的对话框内点击确定。注：每次实验开始时均需要startup,实