拟南芥SSCD1基因启动子与GUS重组载体的构 建与转化
Botanical Research 植物学研究, 2018, 7(3), 287-293
Published Online May 2018 in Hans. https://www.360docs.net/doc/3212981949.html,/journal/br
https://https://www.360docs.net/doc/3212981949.html,/10.12677/br.2018.73037
Construction and Transformation
of Recombinant Plasmid of Gene
SSCD1 Promoter and GUS Gene
in Arabidopsis thaliana
Peilin Liu1, Tiantian Zhi1, Chunmei Ren1,2*
1College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha Hunan
2Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha Hunan
Received: Apr. 22nd, 2018; accepted: May 16th, 2018; published: May 23rd, 2018
Abstract
The tyrosine degradation pathway is an important metabolic pathway in animals, but in plants, less is known about this pathway. Our previous study found that: in Arabidopsis thaliana, the SSCD1 gene encodes the final enzyme of the tyrosine degradation pathway, fumarate lace to ace-tate hydrolase (FAH), and mutation of this gene results in cell death in Arabidopsis under short day. To investigate the tissue expression characteristics of the SSCD1gene, a fusion expression vector of Arabidopsis thaliana SSCD1 gene promoter and GUS gene was constructed and trans-formed into Arabidopsis thaliana, and the transgenic plant was obtained and identified by GUS histochemical staining. The GUS histochemical staining showed that the GUS gene driven by the SSCD1 gene promoter was strongly expressed in the hypocotyls, but weakly in the cotyledons and roots. However, the expression was almost absent in the true leaves. The results of this study in-dicate that the SSCD1 gene plays a more important role in hypocotyls, which is very important for deeply exploring tyrosine degradation pathway in plants.
Keywords
Arabidopsis, SSCD1 Mutant, Tyrosine Degradation Pathway, GUS
拟南芥SSCD1基因启动子与GUS重组载体的构建与转化
刘佩琳1，支添添1，任春梅1,2*
*通讯作者。
刘佩琳 等
1湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 2
作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙
收稿日期：2018年4月22日；录用日期：2018年5月16日；发布日期：2018年5月23日
摘 要
酪氨酸降解途径是动物中一条重要的代谢途径，而在植物中对该途径了解较少。我们前期研究发现：在模式植物拟南芥中，SSCD 1基因编码酪氨酸降解途径最后一个酶——延胡索酰乙酰乙酸酶(fumaryl acetoacetate hydrolase)，该基因突变后导致拟南芥在短日照下出现细胞死亡。为了探讨SSCD 1基因的组织表达特征，本研究构建了拟南芥SSCD 1基因启动子与GUS 的融合表达载体并转入拟南芥，得到其转基因植株，经GUS 组织化学染色，发现SSCD 1基因启动子驱动的GUS 基因在下胚轴中表达较强，子叶和根中表达较弱，而在真叶中几乎没有表达。该研究结果表明SSCD 1基因在下胚轴中发挥着更重要的作用，对深入探讨植物中酪氨酸降解途径具有重要的作用。
关键词
拟南芥，SSCD 1突变体，酪氨酸降解途径，GUS
Copyright ? 2018 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/3212981949.html,/licenses/by/4.0/
1. 引言
酪氨酸降解途径在动物体内发挥着重要作用，在人类和动物中若被阻断将会造成很严重的损伤，甚至死亡[1]。延胡索酰乙酰乙酸酶(FAH)参与酪氨酸降解的最终途径，其主要作用是将延胡索酰乙酰乙酸水解成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解[2]。在动物中，FAH 合成中断会导致动物患上酪氨酸血症并引起死亡[3]。而在植物体内，编码FAH 酶的SSCD 1基因突变会导致拟南芥在短日照条件下发生细胞死亡，而长日照下表型正常[4]，因此利用基因工程技术来研究SSCD 1基因的表达模式有助于了解酪氨酸降解途径在植物体内的作用机制。
启动子处于基因转录起始位点的上游，其作为重要顺式元件参与了一系列基因的表达和调控，并能被RNA 聚合酶识别与结合[5]。将启动子与GUS 基因融合，通过转基因实验验证基因的表达活性和组织特异性表达是研究基因表达模式的一种常用方法[6] [7]。
本试验以拟南芥为研究材料，通过构建SSCD 1基因启动子以及GUS 的融合表达载体，随后将其导入拟南芥植株内，通过抗性筛选得到稳定可遗传的转基因植株，进一步采用GUS 组织化学染色，检测SSCD 1基因的启动子是否成功转入和正常激活GUS 基因。本实验的完成为后续该基因的研究提供一定借鉴与帮助。
2. 试验材料与方法
2.1. 试验材料
2.1.1. 植物材料及培养条件
拟南芥(Arabidopsis thaliana )野生型Col-0由湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室植物信号
Open Access
刘佩琳等
传导课题组提供。
使用消毒液(20% bleach + 0.1% Triton100)将拟南芥种子浸泡10 min，用无菌水于超净工作台上清洗3~4次，适当密度接种在MS固体培养基上。4℃黑暗春化3 d后，转入人工气候箱生长，培养温度为(22 ± 2)℃，光周期为长日照(16 h光照/8 h黑暗) [8]。
2.1.2. 表达载体
本试验采用的载体为pCAMBIA1301，该载体的启动子为35S启动子，标记基因为GUS 基因，抗性基因为卡那霉素抗性基因，植物筛选标记基因为潮霉素抗性基因。
2.1.
3. 菌株
本试验所用到大肠杆菌E. coli DH5α和根癌农杆菌GV3101均由湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室植物信号传导课题组提供。
2.1.4. 试剂
DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，PCR所用的反应体系以及卡那霉素和氨苄青霉素均购自于北京TaKaRa公司，质粒提取试剂盒和切胶回收试剂盒购自于AXYGEN公司，酶切连接用到的试剂以及PstI酶和NcoI酶均购自北京宝生物工程有限公司，其他试剂购自于国药集团化学试剂有限公司。
2.1.5. 培养基
LB培养基配方为胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉15 g/L (固体培养基需要加)，调pH = 7.0；YEB培养基配方为胰蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉15 g/L (固体培养基需要加)，调pH = 7.0。
2.2. 试验方法
2.2.1. 拟南芥总DNA的提取
根据DNA提取试剂盒中的说明书进行提取。
2.2.2. PCR引物的设计及SSCD1基因启动子的扩增
通过TAIR网站获取拟南芥SSCD1的基因启动子序列，经软件plantcare分析后选取ATG前2000 bp 序列(启动子区域)，利用Primer Premier 5软件设计其特异性引物SSCD1-F/SSCD1-R，在5’端分别加上PstI和NcoI酶切位点，引物序列为:
SSCD1-F,5’-AACTGCAGCTCTCCAACGACAACT-3’(下划线处为酶切位点PstI)
SSCD1-R,5’- CATGCCATGGTGACGATACAGATAC-3’(下划线处为酶切位点NcoI)
使用高保真酶对试剂盒提取的拟南芥野生型Col-0基因组DNA进行PCR扩增。退火温度根据引物合成时的预测温度生成(退火温度为60℃)。将扩增得到的PCR产物经琼脂糖(1.0%)凝胶电泳检测，然后回收目的条带并纯化。
2.2.
3. SSCD1启动子基因与GUS融合载体重组
将pCAMBIA1301质粒载体(参照质粒提取试剂盒说明书获得载体)和扩增得到的SSCD1启动子片段用PstI和NcoI限制性内切酶在37℃下双酶切过夜，得到的线性载体与启动子片段分别回收后在T4连接酶作用下连接至预期位点，载体构建如图1。体系为10 × T4 Buffer 2 μL，线性化载体6 μL，插入片段扩增产物1 μL，T4 ligase 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。将配置好的体系16℃过夜。从?80℃冰箱里取出大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化，加入20 μL连接产物混匀，在冰上放置30 min；42℃热击90 s，然后迅速转至冰浴，放置1~2 min，加入700 μL LB液体培养基，37℃摇床下振荡培养45 min，6000 g室温下离
刘佩琳等
Figure 1. Construction of vector p SSCD1::pC1301
图1. p SSCD1::pC1301载体构建
心2 min，去部分上清(剩100 μL)，然后混匀浓缩菌液，取50 μL菌液均匀涂布于含50 mg/L Kan的LB 固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置，培养过夜[9] [10]。挑取阳性克隆并进行测序，将测序后验证正确的重组质粒通过电击转化至根癌农杆菌GV3101中[11] [12]，选取阳性克隆进行菌落PCR鉴定。
2.2.4. 重组质粒转化农杆菌与筛选
挑选单菌落溶于10 μL无菌水中，取1 μL进行菌落PCR，检测阳性克隆后，接种于含Kan (50 mg/L)、GEN (50 mg/L)、Rif (25 mg/L)的YEB液体培养基，黑暗条件下，28℃培养至菌液OD600值为0.5~0.6时取出，6000 g离心2 min后弃上清，加入适量悬浮液(5%蔗糖+ 1/2 MS + 0.02% Silwet-L77 + 0.01%6-BA)，控制悬浮液中农杆菌浓度(OD600)于0.6~1.0，浸染拟南芥幼嫩花蕾(花序浸染法) [13]。收取T0代转基因种子，春化后，铺种于添加25 mg/L的Hyg抗性的MS培养基上，筛选出阳性转基因植株。
2.2.5. GUS组织化学检测
将转基因抗性植株浸到GUS染液中，置于37℃保温箱中避光过夜。用50%，70%，100%的浓度梯度乙醇依次漂洗样品，每次浸泡5 min，加入100%乙醇浸泡直至完全脱色，最后在体视显微镜下拍照记录。GUS染色液配制：将X-gluc溶于磷酸钠缓冲液中(含100 mmol/L pH 7.0的磷酸钠缓冲液，10 mmol/L EDTA，5 mmol/L铁氰化钾，5 mmol/L亚铁氰化钾)，终浓度为1 mmol/L。
3. 结果与分析
3.1. SSCD1基因启动子的克隆
将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示扩增产物符合预期大小(PCR产物预期大小为2000 bp)，且没有非特异性扩增条带(图2)，克隆所得目的片段可用于下一步实验。
3.2. p SSCD1::GUS重组载体的构建
对目的片段和pCAMBIA1301载体双酶切，回收的目的片段和目的载体，并进行连接转化。随机挑选阳性单菌落进行菌落PCR检测(图3)，挑选阳性单菌落进行扩大培养，提取质粒进行双酶切检测。结
刘佩琳 等
果发现(图4)选取与预期结果相符的目的片段(泳道1、2、3、5)进行测序，经比对分析发现目的基因与GUS 之间的结合位点与预期一致，表明p SSCD 1::GUS 融合表达载体成功构建。(4号泳道由于菌污染导致出现三条带，所以舍弃。)
3.3. p SSCD 1::GUS 重组载体的遗传转化
将p SSCD 1::GUS 重组表达载体转入根癌农杆菌GV3101中，并进行PCR 检测，结果如图5所示，在转入质粒的农杆菌样本中成功检测到大小为2000 bp 左右与目的片段大小相似的条带，证明重组质粒成功转入到农杆菌中。挑选转入成功的农杆菌进行扩大培养，通过浸花法转入拟南芥Col-0野生型植株中，进行融合基因的稳定表达实验。潮霉素对融合表达载体拟南芥幼苗生长无抑制作用，将浸染的当代
注：M 为Marker (2 K)，Line 1-4为SSCD 1基因启动子片段
Figure 2. PCR result of SSCD 1 promoter 图2. SSCD 1基因启动子PCR 扩增结果
注：M 为Marker (2 K)，Line 1-12为菌落PCR
Figure 3. PCR result of recombinant colonies 图3. 菌落PCR 检测
M 为Marker (10 K)，Line 1-5为重组载体双酶切片段
Figure 4. SSCD 1::GUS recombinant vector PstI and NcoI double digestion 图4. SSCD 1::GUS 重组载体PstI 与NcoI 双酶切
M 1 2 3 4
2000bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2000bp
M
1 2 3 4 5
10000bp 3000bp 1500bp
刘佩琳 等
注：M 为Marker (2K)，Line 1-8为农杆菌阳性克隆
Figure 5. PCR of Agrobacterium colony 图5. 农杆菌菌落PCR
注：A.阳性对照植株；B.阴性对照植株；C.转基因植株
Figure 6. Stain identification of GUS 图6. GUS 染色检测结果
种子铺种在含有潮霉素(25 mg/L)的MS 培养基上低温春化，在长日照下培养14 d 发现具有融合表达载体的幼苗能正常生长即获得转基因植物，转化失败的拟南芥幼苗无法正常生长；而未进行浸染的拟南芥Col-0幼苗在潮霉素培养基上同样无法正常生长。这说明能正常生长的幼苗基因组中成功转入了融合表达载体。
3.4. GUS 报告基因定性检测
将转基因植株种子铺种在含潮霉素的MS 培养基上，长日照(16 h 光照/8 h 黑暗)条件下生长7 d 。挑选抗性幼苗进行GUS 组织化学染色，利用体式显微镜观察染色结果。结果表明：转入含35 S 启动子pCAMBIA1301质粒的阳性植株(图6A )中GUS 基因在各个部位都高度表达，而未在阴性对照植株中表达(图6B )，说明GUS 染色方法可行。在同样方法染色的转入SSCD 1基因启动子与GUS 融合表达载体的转基因植株(图6C )中，GUS 基因在下胚轴中表达较强，子叶和根中有表达，但表达比阳性对照弱，而在真叶中几乎没有表达。
4. 结论与讨论
随着基因工程技术飞速发展，基因克隆技术在遗传育种和形状改良等方面体现了十分重要的价值[14]，而启动子则是基因表达载体构建中必不可少的原件[15]。基因表达的特异性主要取决于该基因的特异性启动子，而启动子本身不具有基因特异性，可启动下游任何基因表达，因此启动子表达的部位可以推测该基因的表达部位。目前转基因工程的主要任务是寻找阻止基因沉默的有效途径和发展可诱导的启动子[16]。
M 1 2 3 4
5 6 7 8
2000bp
A
B C
刘佩琳等
本研究成功构建了拟南芥SSCD1基因启动子与GUS的表达载体，通过凝胶电泳图像与测序结果，证明该重组载体即为目的载体。将该重组载体顺利转入拟南芥中并对转化后代用潮霉素进行筛选，获得具有抗性的植株，进一步通过GUS染色法检测，结果表明，SSCD1基因启动子驱动的GUS基因在下胚轴中表达较强，子叶和根中表达较弱，而在真叶中几乎没有表达。该研究结果表明SSCD1基因在拟南芥的不同组织部位有着其特异性的表达，该基因可能在下胚轴中发挥着更重要的作用，但其特异性表达和在下胚轴中的功能有待进一步研究。
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农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥
GUS酶活检测方法
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性 试剂准备： 1.GUS提取缓冲液： 50mmol 磷酸钠(PH7.0) 10mmol EDTA O.1% Triton X-100 0.1% Sarcosyl 10mmol/l β-巯基乙醇 2.1mmol/1 4-MU(4-甲基伞形酮)： 称取19．82mg4-MU钠盐，用1ml乙醇溶解，dH2O定容至100ml。4℃暗处可以贮存一个月。贮存中有可能发生结晶。 3.反应缓冲液： GUS提取缓冲液中加入1mmol/l MUG（100ml 加入35.23mg），4℃可以保存2周。 4.考马新亮旒G250溶液： lOOmg考马斯亮蓝G250溶于50m1 95％乙醇中，加lOOml磷酸，dH2O定容至1L过滤后于4℃贮存。 操作步骤： 新鲜的植物组织6US蛋白的提取： 1．取0.1g叶片样品，用液氮研磨成粉。 2．加入3倍体积的提取缓冲液，研成匀浆。
3．4000rpm离心lOmin，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。GUS蛋白提取液蛋白含量测定： 1.制作标准曲线： BSA母液（ml）H2O（ml）BSA浓度（ug/ml） 0.25 4.75 1.25 0.5 4.5 2.5 1.0 4.0 5.0 1.5 3.5 7.5 2.0 3.0 10.0 2.5 2.5 12.5 5.0 0.0 25.0 配制25ug／ml BSA母液：称取2.5mgBSA，加入0.5ml提取缓冲液，用H2O定容至lOOml。按上表制作BSA梯度液。从中取4ml加入lml考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm 的吸收值。吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。取植物材料GUS蛋白提取液20ul，加H2O至4ml，加入lml考马斯亮蓝，混匀，室温下放置2min。测定595nm光吸收值根据标准曲线计算蛋白质含量。GUS酶活反应： 1. 将反应缓冲液于37℃预热。 2．取6支1.5ml离心管，各加入900ul反应终止液，编号。 3．取1支1.5ml离心管，加入1ml预热的反应缓冲液，再加入200ul的提取缓冲液(具体用量根据材料而定)，混匀，立即取出lOOul
拟南芥的图位克隆技术
拟南芥基因的图位克隆技术 浙江大学生命科学学院徐冰 浙江杭州310029 1 国内外研究现状 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。 从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。 图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002） 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。 目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中
镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测_高玲
自噬现象的观测 高玲1,2*，张卫娜2,4*，陈文利2,3 1.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109； 2.华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室，广州510631； 3.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州510631； 4.广东省农业科学院，广州510640 收稿日期：2011-03-23；接受日期：2011-04-29 基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0829)，广东省科技攻关项目(2007A020300008-6)， 华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室开放课题基金项目 通讯作者：陈文利，电话：(020)85211436-8512，E-mail ：chenwl@https://www.360docs.net/doc/3212981949.html, *并列第一作者 摘要：镉离子(Cd 2+)具有强植物毒性，可抑制植物生长，甚至导致植物死亡。为了研究重金属镉 对拟南芥的毒害作用，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定量RT-PCR 技术，检测光合参数的变化、活性氧(reactive oxygen species ，ROS)的累积、自噬的发生，以及 病原相关蛋白（pathogenesis-related protein ，PR ）基因表达的变化。实验结果显示，随着 50μmol/L CdCl 2处理时间的延长，ROS 和Cd 2+在细胞中大量积累。而在镉胁迫的初期，会观察 到自噬的发生及PR 基因表达的变化。说明植物受到外界Cd 2+作用的初期，会通过自噬及增强 PR 基因表达来抵抗外界胁迫。但随着处理时间的延长，植物细胞内累积了大量的ROS 和Cd 2+， 当植物不足以通过自噬途径抵抗胁迫时，就会导致生长受阻，最终对光合系统造成损伤。 关键词：镉；活性氧；自噬；叶绿素荧光；流式细胞技术 中图分类号：Q945，Q947 DOI ：10.3724/SP.J.1260.2011.00676 引言 近年来，工业、矿业生产中产生的大量重金属被释放到环境中，镉(Cd )即是其中之 一。大量研究表明，镉是环境中的主要重金属污染源，是对植物毒性最强的元素之一。镉 毒害同其它逆境一样，主要伤害机制之一是影响植物体内活性氧(reactive oxygen species ， ROS )和自由基的代谢平衡，引起ROS 和自由基的积累，产生膜脂过氧化作用，导致植物 的中毒甚至死亡[1]。植物体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD )和过氧化氧 酶(catalase ，CAT )等保护酶对ROS 及自由基的清除能力，是决定其逆境抗性的重要因素 之一[2]。镉胁迫成为各种生物面临的一种新挑战。植物和藻类细胞虽然可以耐受一定量的镉 胁迫[3]，但过量的镉会直接或间接地抑制植物体的生理过程，如呼吸作用、光合作用和氮代 生物物理学报2011年8月第27卷第8期:ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27No.8Aug.2011:676-686 676-686 676
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测 一、实验目的 1、掌握基因GUS的表达的检测方法 2、了解GUS基因的应用 二、实验原理 GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。 三、实验材料、试剂 拟南芥AK12-pro、GUS工作液 四、实验步骤 1、取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液； 2、用镊子夹取转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中； 3、37℃浸泡过夜。 4、倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；肉眼下观察染色情况； 拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。 五、实验结果
GUS染色液
南京森贝伽生物科技有限公司 网址：https://www.360docs.net/doc/3212981949.html,/ 第1页 仅供科研 版本号：181126 GUS 染色液 【产品组成】 【保存条件】 -20℃,避光;4℃,避光,12个月 【产品概述】 GUS(β-Galactosidase)基因是存在于E.coli 等一些细菌基因组内的编码β-葡萄糖苷酸酶的一种水解酶，该基因常作为融合标记用于植物转基因分析和调控研究中。GUS 受体基因系统有表达E.coliGUS 酶的稳定性和在植物内的低活性，绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。5-Bromo-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide ， cyclohexylammonium salt(简称为X-Gluc 或X-GlcA)分子量为521.8，CAS 号为18656-96-7，是检测大肠杆菌中GUS 基因的底物，可快速检测植物中GUS 基因融合标记。 β-葡萄糖苷酶基因染色试剂盒(β-Galactosidase Reporter Gene Staining Kit)简称为GUS 染色液，其染色原理是适宜的反应条件下β-葡萄糖苷酶(GUS)可将X-Gluc 水解成蓝色物质，该物质不溶解于转基因的细胞核组织中的靛蓝物质，具有GUS 活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到，GUS 染色液可用于生物化学活性分析、免疫分析以及组织和细胞的组织化学染色，多用于转基因植物的GUS 基因表达分析。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 【使用方法】 1、配制X-GlcA Solution ：取X-GlcA Solvent 229μl 加入至80mg X-GlcA 中或取适量上述2种物质溶解，使其浓度达到350mg/ml ，轻轻Vortex 混匀，即为Solution ，分装后，-20℃避光保存。 2、按下列比例配制GUS 染色液：
拟南芥原生质体制备转化方法整理
溶液配制 1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
3、W5 溶液 4、MM G溶液
5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
基因图位克隆的策略与途径拟南芥
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
GUS染色
转基因植物中报告基因实验七 实验七、转基因植物中报告基因实验七、 GUS组织化学定位检测
原理 GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 葡萄糖苷酸酶是个水解酶以 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶 来由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶 的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调 控的研究中。根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度 可以选择种检测方法组织化学法分光光度 法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）， 其中最为常用的是组织化学法。 其中最为常用的是组织化学法
?组织化学法检测：以5--4--3--- 织化学法检测以溴氯吲哚β葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸若织细胞被转了基底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS 因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧水解成产物是其初始产物氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点现蓝色用肉眼或在显微镜下可看到部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱 克隆拟南芥中的AK12基因的启动子插入到 PBI101载体GUS 基因的上游的克隆位点（具体 图示如下） 农杆菌转化 转化拟南芥 AK12-pro RB LB NPT ПGUS NOS-ter NOS-ter 35S-pro pBI101
模式植物拟南芥遗传应用综述
模式植物拟南芥遗传应用综述 摘要：拟南芥作为一种比较经典的“模式植物”，在研究相关的其他生物的生命活动规律中，因其结构简单，相似性高，而表现出其他生物无法比拟的优越性，成为了科学家们最理想的研究对象。本文分别从问题的提出、历史的发展、现状的分析和前景的预测四个方面对拟南芥在科学界的地位及作用进行了综合性的总结和叙述。 关键词：拟南芥；模式植物；遗传；应用 一、前言 纵观过去和现在，科学界对拟南芥的重视程度以及拟南芥在生物遗传学的地位有着巨大的差异。尤其是近几年来，科学界对拟南芥的热衷程度日渐加深，完全不同于90年代以前的冷淡。而且现在的科学家们对于拟南芥的研究方向是各种各样的，越来越广泛。本文就是对拟南芥在不同研究课题下所起的作用、在遗传应用上所表现的优越性进行一个总结性的综述，探讨产生此种现象的原因，从而得出此种作物在生物学上的大致研究方向，并作出相应的前景预测，让我们对它的研究潜力进行进一步的挖掘，让它的贡献更大化。此外，也希望通过本文，让大家对拟南芥在过去和现在的发展有一个更加清楚的了解，把握住大致的脉络，并对今后的研究提供相应的指导和帮助。 二、历史的发展： 虽然孟德尔以豌豆为实验材料开创了现代遗传学, 后来麦克林托克又研究了玉米, 发现了惊人的“跳跃基因”, 但总的来说, 这些植物都不是研究分子遗传学的良好材料。高等植物通常需要较大的种植面积, 特殊的条件, 而且繁殖周期长。更糟的是, 植物的基因组通常都很大（例如, 玉米的基因组比果蝇的大两个数量级）, 使人们难以分离到特定的基因[1]。因此, 虽然K’Roberts早就认为植物是研究发育的良好系统,但迄今为止, 在研究植物的细胞分化和形态发生等方面一直进展迟缓。长期以来, 分子生物学家们一直希望能在植物中找到象动物中的黑腹果蝇(Drosophila me-lanogaster)那样繁殖快, 易于在实验室中培养,并能用分子生物学和遗传学技术进行广泛研究的实验材料,以便从根本上改变植物遗传学研究的长期落后状况。1985年4月13-19日在美国科罗拉多州召开的植物遗传学UCLA上, 科学家们宣布, 他们终于确定了植物王国中的“果蝇”—拟南芥，而这也奠定了拟南芥在将来时期的地位。 2.1拟南芥的研究进度以及介绍 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 是一种极普通的草本植物，常用俗名鼠耳芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的“模式”植物。近年来，植物科学中许多有价值的发现几乎都是以拟南芥为实验材料取得的，因此它被誉为植物界的“果蝇”。拟南芥具有以下主要特点:(1)形态个体小，高度只有30 cm左右;(2)生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右;(3)种子多，每株每代可产生数千粒种子;(4)形态特征简单;(5)基因组小，只有5对染色体。早在1907年，Strasburger就利用拟南芥研究了染色体的连续性。他的学生Laibach于同年发现拟南芥间期核中的异染色质体的数目与其中期染色体数相同，这种现象在植物界中是比较少见的。拟南芥的染色体数目为2n=10，其
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化 (1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于 20ml双蒸水中）；共需叶片约90片； (2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时； (3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃， 60g，离心15min； (4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min； (5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min； (6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬； 以下操作均在23℃下进行： (7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪 去前端）轻柔混匀； (8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min； (9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5； (10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀； (11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。 (1)酶解液： cellulose R10 15% Macerozyme R10 0.3% Mannitol 1.09g KCl 0.3M MES 0.3M 调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液 CaCl20.15M β-巯基乙醇0.75mM (2)PEG溶液（40%，v/v） PEG4000 1g 0.8M Mannitol 0.625ml 1M CaCl2 0.25m (3)W5溶液
拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
拟南芥转化 浸花法
拟南芥转化—浸花法 实验步骤： 关键记录： a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。 b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。 c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。
d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。 e.干燥成熟的果夹用小袋套住。 f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。
说明： 如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。 如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。去掉用于转化植株上的果夹。 具体步骤： 1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。 2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。 注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。 3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。 浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。混匀，转移至50ml离心管。 注意：表面活性剂浓度过高有毒害。为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。在双转化试验中我们至少要用48株植株。间隔7天进行第二次浸染植株。 小心：戴手套及口罩防止表面活性剂的毒害。 4.浸染时将农杆菌悬浮液倒满50mL离心管的小盖子，将拟南芥横放使花序浸入小盖子中的悬浮液10s，轻微晃动小盖，20ml农杆菌悬浮液至少有效用于转化30株拟南芥， 150个花序以上，这一步骤要保证能在植株上看到菌液。 注意：确定所有花盆都已浸染，有时很有必要浸染整个植株确保浸染更短更多的花芽。将过多的农杆菌液移除也很重要。否则长时间
拟南芥基因组
拟南芥基因组测序工作圆满完成 在“人类基因组计划”(HGP)进行得如火如荼的同时，在植物科学领域也进行着－场类似的革命，并且取得了大的成功。2000年12月4日出版的《自然》杂志(Nature)报道了拟南芥完整基因组测序工作完成并首次发表了其完整基因组序列。这成为植物科学史上的一个重要里程碑。已经绘制出拟南芥的基本基因图谱，其中包含11600万个碱基对，编码大约26000个基因。通过向这张基本网谱上添加细节，人们可以对其基因结构进行更为详尽的研究，同时也可以增加对于其他遗传上更为复杂的植物的认识和理解，其中包括许多重要的农作物。这项工作的重要性在某种意义上甚至要超过人类基因组计划，因为即使是生活极其贫困的人们也将从中受益。目前的实验工作仅涉及整个基因组中不到10％的基因，仍有大量新的基因有待继续研究。通过这些工作，人类能够更详尽的了解植物独特的代谢过程，它们与环境的相互作用以及它们的抗病和抗虫能力。另外，拟南芥基因与众多其他有机体的基因密切相关，在不同植物之间，植物与动物之间，许多生理生化过程是十分保守的。通过基因及基因功能比较，使跨种甚至跨界的揭示生命活动的基本规律成为可能。这种保守性为我们提供了将不同有机体的研究联系到一起的基础，从而大大拓展了我们的生物学视野。对拟南芥基因组的分析有助于理解DNA的复制和染色体的分离过程，并为基因工程设计提供新的途径，同时也揭示了生物基因组进化的重要机制。拟南芥基因序列研究工作不仅对于基础科学研究具有重要的贡献，而且有着突出的实际利用价值。拟南芥基因组中的基因通常也存在于其他作物中，而且相同基因在不同作物中也表达出相似的功能。人们可以从拟南芥基因组中选调控制优良性状的基因，利用基因修饰技术(GM)将其转入作物中，当然，也可以利用拟南芥基图谱来确定其它植物的有价值基因，调出后通过标记辅助育种技术转入作物。基于拟南芥基因组和其他植物基因组的同源性，通过对拟南芥基因组的深入研究和分析，有助于人们对整个植物界的认识，改善农作物的品质，提高农作物的抗逆性以及降低农业生产对环境的影响。(赵镝徐春晖)
拟南芥的一般生物学特性
一、拟南芥的一般生物学特性 1. 形态学描述 拟南芥（Arabidopsis thaliana）为十字花科拟南芥属。一年生细弱草本植物（图21-1 A）。 株高15至30厘米，随生长环境或培养条件变化。基生叶多数，长圆形或椭圆形，呈莲座状排列。茎生叶具短柄或无柄。总状花序顶生，花瓣白色；雄蕊6枚，花药黄色；雌蕊圆柱状。长角果线形，长约10至16毫米，成熟时开裂。种子呈卵形，长约1毫米，成熟时红褐色。有关拟南芥的各种形态特征、形态发生及个体发育的过程等在许多文献中已有很详尽的描述，为研究人员利用拟南芥为实验材料提供了很好的基础和方便。 2. 个体小、易于栽培管理 与其它大多数高等植物相比，拟南芥的个体较小。成熟个体株高在15至30厘米之间。 由于个体小，很容易在面积有限的温室或人工气候室内大批量地种植。特别是对于一些有特殊要求的研究工作，甚至可以在培养器皿中完成生活史（如有时需要在无菌条件下进行培养等）。而且，拟南芥对生长条件的要求并不十分严格，这一特点使得在实验工作中很容易实现拟南芥的栽培管理。 3. 生长周期较短 在一般的温室或人工气候室条件下，从拟南芥种子的春化至第一批角果成熟大约需8周左右时间。当然，也可以通过改变生长条件以达到使拟南芥提前或推后开花结实的目的。如延长每天的光照时间，可使拟南芥明显地提前开花结实，利用每天接近24小时的光照条件培养，甚至在6周左右即可收获第一批成熟角果。拟南芥的这一特性使实验工作周期大大缩短，特别是对于许多遗传分析工作，比利用一般的高等植物材料（如麦类、豆类作物）可以成倍地节约时间。 二、拟南芥的普通遗传学特性 1. 既可自交、又可人工杂交 在自然条件下，拟南芥是典型的自交繁殖植物，这使得拟南芥在种植繁种过程中得以保持其遗传上的稳定性。同时在实验过程中，根据研究目的又可方便地实施人工杂交，使得遗传分析工作很容易完成。 2. 种子结实量大 虽然拟南芥植物个体较小，但其种子结实量非常之大。一个角果可结实数十至上百粒种子；在生长良好的情况下，单株结实量可达上万粒之多！这使得很容易进行后代的遗传分析工作，也很容易扩增所需突变体的种子库。 3. 容易被诱变产生所需突变体 拟南芥在正常条件下通过自交产生后代，在遗传上表现出较高的稳定性。但拟南芥在特殊条件处理后较易发生突变，如利用物理的（如辐射处理）、化学的（如EMS处理）、及遗传转化（如T-DNA插入）等方法进行人工诱变处理，可获得具有各种不同表型性状的突变体。利用这些人工诱变方法产生的突变是随机的，可进一步通过对突变体库的有目的筛选而获得所需的突变体。 4. 染色体结构 通过对细胞周期的中期（metaphase）染色体观察，可以清晰地辨认单倍体拟南芥有5条染色单体（2倍体为10条染色体）。对拟南芥遗传图谱的连锁关系分析，也证实了单倍体拟南芥包含5个遗传连锁群。除去着丝粒、端粒等区域及一些重复序列，目前已经完成测序的第一条至第五条染色体的DNA序列长度依次为29.1 Mb、19.6 Mb、23.2 Mb、 17.5 Mb、26.0 Mb（总长为115.4 Mb），而包括所有序列在内的拟南芥单倍体基因组总 长约为125 Mb（注：此数据为2000年12月14日《自然》杂志公布的数据，随着拟南
gus基因检测
gus 基因PCR 反应程序： 94℃预变性5 min 94℃变性 1 min 58℃退火1 min 30个循环 72℃延伸2min 72℃延伸7 min gus 基因引物序列为：5’GCTATACGCCTTTGAAGCC 3’和5’TTGACTGCCTCTTCGCTGTA 3’ GUS 染色母液:X-Gluc 由DMSO 溶解，贮存浓度为l0mg/mL,于-20°C 保存。 GUS 染液:500mg/L X-Gluc, 0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.lmol/L K4Fe(CN)6，0.0lmol/L ，
的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml ●
这是1ml的配方体系： 终浓度药品分子量体积 0.5M Na2EDTA 20ul TritonX-100 1ul 1M 磷酸钠缓冲液（PH7.0） 100ul 0.1M K3Fe(CN)6 5ul 0.1M K4Fe(CN)6 5ul 10mg/ml X-Gulc 200ul 去离子水或无菌水669ul 染液配方0.05M磷酸缓冲液 4.48ml 5mM铁氰化钾0.05ml, 5mM亚铁氰化钾0.05ml，Triton-100 0.01ml，水4.64ml，X-Gluc先溶于0.05ml DMF中，终浓度为0.5mg/ml 37度染色过夜 1.2染色步骤 1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS 染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。 2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。 3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。 4)记录：在体视显微镜下拍照记录。 2．GUS报导基因的定量检测 GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷， 4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456，其
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程 主要试剂 1. 纤维素酶解液： 试剂 15ml酶液体系 1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉 2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉 3．0.4M mannitol1.09g干粉 4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液 5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6．加入10ml 水 7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2 9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存） 11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。 2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量） PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g 0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml 1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml 约1.2ml 3. W5 溶液（1000ml） 154mM NaCl, NaCl9g 125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g 5mM KCl, KCl0.37g 2mM MES（PH 5.7），MES0.39g pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 4. MMG溶液 MaMg溶液（500ml） 15mM MgCl2，MgCl0.71g 4 mM MES(PH5.7)MES0.39g 0.4 M mannitol，Mannitol36.5g 用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 5. WI溶液 WI(200ml) 0.5M mannitol，mannitol18.217g 4mM MES,pH5.7，MES0.156g
PEG介导法制备拟南芥原生质体及瞬时表达方法
采用PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达法。具体方法如下： 1）在MS培养基上用无菌牙签点种拟南芥种子，萌发后待根长至1-3厘米（2周左右），移栽到营养土:蛭石为1:1的培养土中，置于培养箱，温度22℃，光照16h，湿度70%，培养2-3周； 2）配制酶解液，选10ml酶解体系，置于90mm培养皿中； 3）在长势良好且未抽薹的拟南芥植株上选取鲜嫩叶片10-15片，用洁净的手术刀在培养皿的盖子上将叶片切成1mm宽的细条； 4）将切好的细条均匀铺在含酶解液的培养皿中，可以一边切一边从植株上取； 5）将酶解液和细叶条真空抽滤30 min； 6）将培养皿取出，静置在黑暗中，23℃，酶解3小时； 7）酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于2.0 ml离心管中，常温，100 g离心1 min； 8）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，4℃，100 g，离心1min； 9）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，冰上放置30min； 10）23℃，100 g，离心1min，弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬（本步骤及以下操作均在23℃）； 11）取约10-20ug质粒于2.0 ml EP管中，加100ul 制备好的原生质体，用剪去前端的200ul 枪头轻柔混匀； 12）加入110ul PEG/Ca溶液，轻柔混匀，23℃静置5-30min； 13）加入800 ul W5 溶液，轻柔的颠倒混匀，23℃，100 g，离心1min； 14）弃上清，加100ul W5，混匀，再次再加100ul W5，混匀； 15）上述混合液体置于恒温加热器中，23℃，避光，孵育6-18小时。 16）荧光观察，观察之前轻柔混匀，吸取观察物所用的枪头必须剪去前端。