BCA蛋白测定

BCA蛋白测定
BCA蛋白测定

BCA蛋白浓度测定试剂盒

产品编号产品名称包装

P0012S BCA蛋白浓度测定试剂盒 200次

产品简介:

?BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成,实现了蛋白浓度测定的简单,高稳定性,高灵敏度和高兼容性。

?灵敏度高,检测浓度下限达到25μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5μg,待测样品体积为1-20μl。

?在50-2000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。

?BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响,需确保EDTA低于10mM,无EGTA,二硫苏糖醇低于1mM,β-巯基乙醇低于0.01%。不适用BCA法时建议试用碧云天生产的Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)。

?BCA蛋白浓度测定试剂盒对样品中各种物质的详细的兼容性,请参见碧云天如下网页:

https://www.360docs.net/doc/3a17326721.html,/Compatibility Chart For BCA Kit.pdf

?每个试剂盒可以检测200个样品。

包装清单:

产品编号产品名称包装

P0012S-1 BCA试剂 A 40ml

P0012S-2 BCA试剂 B 1.2ml

P0012S-3 蛋白标准(BSA) 20mg

P0012S-4 蛋白标准配制液1ml

—说明书1份

保存条件:

室温保存。蛋白标准配制成溶液后-20℃冻存。

注意事项:

?需酶标仪一台,测定波长为540-595nm之间,562nm最佳。需96孔板。如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但测定时,需根据比色皿的最小检测体积,适当加大BCA工作液的用量使不小于最小检测体积,样品和标准品的用量可相应按比例放大也可不变。使用分光光度计测定蛋白浓度时,每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。

?如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景,请试用碧云天生产的Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)。

?为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热,但是切勿过热。

?EDTA浓度必需小于10mM,不兼容EGTA。不适用BCA法时,请试用碧云天生产的Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)。?为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:

1.取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中,充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即

使用,也可以-20℃长期保存。

2.取适量25mg/ml蛋白标准,稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白标准,加入980μl稀释液即可配制成

0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见,也可以用0.9%NaCl或PBS

稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。

3.根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。例如5ml BCA试剂A加

100μlBCA试剂B,混匀,配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室温24小时内稳定。

4.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中,加标准品稀释液补足到20μl。

5.加适当体积样品到96孔板的样品孔中,加标准品稀释液到20μl。

6.各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置30分钟。

注: 也可以室温放置2小时,或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低,适合在较高温度孵育,或适当延长孵育时间。

7.测定A562,540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

常见问题:

1. 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化。

可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质,详细的BCA法的兼容性列表请参考碧云天如下网页: https://www.360docs.net/doc/3a17326721.html,/Compatibility Chart For BCA Kit.pdf

2.是否每次测定时都需要做标准曲线?

建议每次测定时都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深,并且显色反应的速度和温度有关,所以除非精确控制显色反应的时间和温度,否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。

使用本产品的文献:

1. Liu MJ, Wang Z, Li HX, Wu RC, Liu YZ, Wu QY.

Mitochondrial dysfunction as an early event in the process of apoptosis induced by woodfordin I in human leukemia K562 cells.

Toxicol Appl Pharmacol. 2004 Jan 15;194(2):141-55.

2. Wu RC, Chen DF, Liu MJ, Wang Z.

Dual effects of cycloheximide on U937 apoptosis induced by its combination with VP-16.

Biol Pharm Bull. 2004 Jul;27(7):1075-80.

3. Zheng CH, Gao JQ, Zhang YP, Liang WQ.

A protein delivery system: biodegradable alginate-chitosan-poly(lactic-co-glycolic acid) composite microspheres.

Biochem Biophys Res Commun. 2004 Oct 29;323(4):1321-7.

4. R.-C. Wu, Z. Wang, M.-J. Liu, D.-F. Chen and X.-S. Yue.

β2-integrins mediate a novel form ofchemoresistance in cycloheximide-induced U937 apoptosis.

Cell. Mol. Life Sci. 2004,61(16):2071–2082.

5. 刘军丁劲薛采芳李英辉宫卫东赵亚黄豫晓。

带有蛋白转导域的靶向核糖核酸酶对乙型肝炎病毒复制的影响。

中华肝脏病杂志2004年第6期第377页。

6. Zhong-shu Liang , Kan Yang and Ben-mei Chen.

Cholesterol in U937 foam cells assayed in liquid chromatographic-mass spectrometry.

Chin J Mod Med; 2004, 14(20): 51-56.

7. Liu MJ, Yue PY, Wang Z, Wong RN.

Methyl protodioscin induces G2/M arrest and apoptosis in K562 cells with the hyperpolarization of mitochondria.

Cancer Lett. 2005, 224:229–241.

8. Liu MJ, Wang Z, Ju Y, Wong RN, Wu QY.

Diosgenin induces cell cycle arrest and apoptosis in human leukemia K562 cells with the disruption of Ca2+ homeostasis.

Cancer Chemother Pharmacol. 2005 Jan;55(1):79-90.

9. Jin Ding, Jun Liu, Cai-Fang Xue, Ying-Hui Li, Ya Zhao, Jun Chen, Yu-Xiao Huang, Zhong-Xiang Liu.

TatPTD can introduce HBV targeted ribonuclease into hepatocytes.

World Chin J Digestol. 2005 april 15;13(8):958-962.

10.Zhao Y, Guan H, Liu SF, Wu RC, Wang Z.

Overexpression of QM induces cell differentiation and mineralization in MC3T3-E1.

Biol Pharm Bull. 2005 Aug;28(8):1371-6.

11.Le-Feng Zhang, Shuang-Qing Peng, Sheng Wang.

Influence of lead (Pb2+) on the reactions of in vitro cultured rat aorta to 5-hydroxytryptamine.

Toxicology Letters 159 (2005) 71–82.

12.Jin Ding, Jun Liu, Cai-Fang Xue, Ying-Hui Li, Ya Zhao, Jun Chen, Yu-Xiao Huang, Zhong-Xiang Liu

TatPTD can introduce HBV targeted ribonuclease into hepatocytes.

Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(8):958-962

13.Gao Jianmei, Wan Yanzhen, Han Jun, Wang Xiaofan, Chen Lan, Nie Kai, Zhou Wei, Dong Xiaoping.

Influence of the Numbers of Octapeptide Repeats within N2terminus of Recombinant Human PrP Proteins on the Protease Resistance af ter Interacting with Metal Ions and the Binding Abil ity with Tau Protein.

Chinese Journal of Virology. 21(5):376-83.

14.Wang Yichao, Zou Quanming, Ren Jianmin, Liu Jian,Wang Xiaoqin.

Preparation and character of microspheres of Helicobacter pylori whole cell protein encapsulated by chitosan - alginate.

West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 2005,20(5):375-7.

15.Wu ZQ, Li M, Chen J, Chi ZQ, Liu JG.

Involvement of cAMP/cAMP-dependent protein kinase signaling pathway in regulation of Na+,K+-ATPase upon activation of opioid receptors by morphine. Mol Pharmacol. 2006 Mar;69(3):866-76.

16.Yi ZC, Liu YZ, Li HX, Yin Y, Zhuang FY, Fan YB, Wang Z.

Tellimagrandin I enhances gap junctional communication and attenuates the tumor phenotype of human cervical carcinoma HeLa cells in vitro.

Cancer Lett. 2006 Oct 8;242(1):77-87.

17.Ma JF, Guo JK, Peng LW, Chen CY, Zhang LX.

Decrease of photosystem II photochemistry in Arabidopsis ppt1 mutant is dependent on leaf age.

J Integr Plant Biol. 2006; 48(12), 1409-1414.

18.Huang YY, Deng JY, Gu J, Zhang ZP, Maxwell A, Bi LJ, Chen YY, Zhou YF, Yu ZN, Zhang XE.

The key DNA-binding residues in the C-terminal domain of Mycobacterium tuberculosis DNA gyrase A subunit (GyrA).

Nucleic Acids Res. 2006;34(19):5650-9.

19.Ma JF, Guo JK, Peng LW, Chen CY, Zhang LX.

Decrease of Photosystem II Photochemistry in Arabidopsis ppt1 Mutant Is Dependent on Leaf Age.

Journal of Integrative Plant Biology. 2006,48(12):1409-1414.

20.Ji G, Wang M, Long AH, Liu CH.

Regulative Effects of"Qinggan Huoxue Recipe" and Its Separated Recipes on Kupffer Cells Mediated by LPS.

Shanghai Chinese Medicine magazine.2007 Jan;V ol.41 No.1.

21.Li JL, Yan ZP, Chen XH, Wang YJ, Sun M, Shi YX, Wang CB.

Inh ib ition of Polypeptide from Chlamys fa rreri on UV A2Induced Apoptosis of HaCaT Cells Depending on p38MAPK Pa thway and Ca spase23.

Chin Pharm J.2007 January, V ol.42 No.2.

22.Wu ZQ, Chen J, Chi ZQ, Liu JG.

Involvement of dopamine system in regulation of Na+,K+-ATPase in the striatum upon activation of opioid receptors by morphine.

Mol Pharmacol. 2007 Feb;71(2):519-30.

23.Zong-Chun Yi, Hong Wang, Guang-Yao Zhang, Bing Xia.

Downregulation of connexin 43 in nasopharyngeal carcinoma cells is related to promoter methylation.

Oral Oncol. 2007 Feb 14;

24.Gao J, Zhao YN, Jiang QW.

Investigation of Asymptomatic Infection of Echovirus 30 in Population of Shanghai.

Journal of the virus.2007 March;V ol.23 No.2.

25.Deng XQ, Chen LL, Li NX.

The expression of SIRT1 in nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in rats.

Liver Int. 2007 Jun;27(5):708-15.

26.Gao MQ, Guo SB, Chen XH, Du W, Wang CB.

Molecular mechanisms of polypeptide from Chlamys farreri protecting HaCaT cells from apoptosis induced by UV A plus UVB.

Acta Pharmacol Sin. 2007 Jul;28(7):1007-14.

27.Dong S, Li C, Wu P, Tsien JZ, Hu Y.

Environment enrichment rescues the neurodegenerative phenotypes in presenilins-deficient mice.

Eur J Neurosci. 2007 Jul;26(1):101-12.

28.Wang Q, Liang C, Song J, Chen X.

HA2 from the Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus: a WASP-related protein that activates Arp2/3-induced actin filament formation.

Virus Res. 2007 Jul;127(1):81-7.

29.Wang YC, Zou QM, Ren JM, Guo G, Xie QH, Liu j.

Study of the microspheres technology of Helicobacter pylori whole cell protein encapsulated by chitosan2alginate.

Chongqing Medical.2007 July;V ol.36 No.13.

30.Li JL, Liu N, Chen XH, Sun M, Wang CB.

Inhibition of UV A-induced apoptotic signaling pathway by polypeptide from Chlamys farreri in human HaCaT keratinocytes.

Radiat Environ Biophys. 2007 Aug;46(3):263-8.

31.Yuan QL, Yang CX, Xu P, Gao XQ, Deng L, Chen P, Sun ZL, Chen QY.

Neuroprotective effects of ginsenoside Rb1 on transient cerebral ischemia in rats.

Brain Res. 2007 Sep 5;1167:1-12.

32.Chen YR, Nie SD, Shan W, Jiang DJ, Shi RZ, Zhou Z, Guo R, Zhang Z, Li YJ.

Decrease in endogenous CGRP release in nitroglycerin tolerance: role of ALDH-2.

Eur J Pharmacol. 2007 Sep 24;571(1):44-50.

33.Yi ZC, Wang H, Zhang GY, Xia B.

Downregulation of connexin 43 in nasopharyngeal carcinoma cells is related to promoter methylation.

Oral Oncol. 2007 Oct;43(9):898-904.

34.Wang ZL, Li JL, Wang CB.

The role of tumor necrosis factor rela ted apoptosis induc ing ligand and Polypeptide from Chlam ys fa rreri in UV A2induced apoptosis in HaCaT cells. Chinese Pharm acological B ulletin.2007 Oct;23(10):1375~9.

35.Zhang Y, Zhen DX, Ren TL, Wang DP.

The Character istics Effects of Ga tifloxac in on L iverM icrosome Cytochrome P450 in Rats.

Pharm J Chin PLA.2007 Dec;V ol.23NO.6.

36.Pan YQ, Ding D, Li DX, Chen SQ.

Expression and bioactivity analysis of Staphylococcal enterotoxin M and N.

Protein Expr Purif. 2007 Dec;56(2):286-92.

37.Jun Hong, Dongmei Xua, Peijun Gong, Hanwen Suna, Li Dong, Side Yao.

Covalent binding of -chymotrypsin on the magnetic nanogels covered by amino groups.

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 45 (2007) 84–90.

38.Wang YL, Wang CY, Zhang BJ, Zhang ZZ.

Shenfu injection suppresses apoptosis by regulation of Bcl-2 and caspase-3 during hypoxia/reoxygenation in neonatal rat cardiomyocytes in vitro.

Mol Biol Rep. 2007 Nov 30.

39.Huang JW, Tian LX, Du ZY, Yang HJ, Liu YJ.

Effects of dietary thiamin on the physiological status of the grouper Epinephelus coioides.

Fish Physiol Biochem. (2007) 33:167–172.

40.Cheng BQ, Jiang B, Bao J.

Construction and expression of ga lectin2 3 shRNA recombinant vector and its effect on prolifera tion ra te of colorecta l cancer lovo cells.

J Fourth MilMedUniv.2007,28(11)。

41.Wang YC, Zou QM, Mao XH, Guo G, Xie QH.

A prelim inary non2clin ica l study of Helicobacter pylori m icrospheres vacc ine.

Chinese Journal of New Drugs.2007,V ol.16 No.7.

42.Wang M, Long AH, Liu CH, Ji G.

Effect of Qinggan Huoxue recipe and its separated recipe on ERK signal ing pathway in Kupffer cell mediated by LPS.

Integrative Medicine in the Journal of liver disease.2007;V ol.17 No.5.

43.Nie H, Li Z, Lukas RJ, Shen Y, Song L, Wang X, Yin M.

Construction of SH-EP1-alpha4beta2-hAPP695 Cell Line and Effects of Nicotinic Agonists on beta-amyloid in the Cells.

Cell Mol Neurobiol. 2008 Jan;28(1):103-12.

44.Zhang DW, Cheng Y, Wang NL, Zhang JC, Yang MS, Yao XS.

Effects of total flavonoids and flavonol glycosides from Epimedium koreanum Nakai on the proliferation and differentiation of primary osteoblasts.

Phytomedicine. 2008 Jan;15(1-2):55-61.

45.Zhang H, Deng JY, Bi LJ, Zhou YF, Zhang ZP, Zhang CG, Zhang Y, Zhang XE.

Characterization of Mycobacterium tuberculosis nicotinamidase/pyrazinamidase.

FEBS J. 2008 Feb;275(4):753-62.

46.Zhang GG, Bai YP, Chen MF, Shi RZ, Jiang DJ, Fu QM, Tan GS, Li YJ.

Asymmetric dimethylarginine induces TNF-alpha production via ROS/NF-kappaB dependent pathway in human monocytic cells and the inhibitory effect of reinioside C.

Vascul Pharmacol. 2008 Feb-Mar;48(2-3):115-21.

47.Yu S, Geng J, Zhou P, Wang J, Feng A, Chen X, Tong H, Hu J.

Application of a new hybrid organic-inorganic monolithic column for efficient deoxyribonucleic acid purification.

Anal Chim Acta. 2008 Mar 24;611(2):173-81.

48.Zhang GG, Shi RZ, Jiang DJ, Chen YR, Jia-Chen , Tang ZY, Bai YP, Xiao HB, Li YJ.

Involvement of the endothelial DDAH/ADMA pathway in nitroglycerin tolerance: the role of ALDH-2.

Life Sci. 2008 Mar 26;82(13-14):699-707.

49.Li J, Liu W, Ding S, Xu W, Guan Y, Zhang JH, Sun X.

Hyperbaric oxygen preconditioning induces tolerance against brain ischemia-reperfusion injury by upregulation of antioxidant enzymes in rats.

Brain Res. 2008 May 19;1210:223-9.

50.Fu Y, Zhang Z, Zhang G, Liu Y, Cao Y, Yu J, Hu J, Yin X.

Adenovirus-mediated gene transfer of tissue factor pathway inhibitor induces apoptosis in vascular smooth muscle cells.

Apoptosis. 2008 May;13(5):634-40.

51.Tian B, Wang Z, Zhao Y, Wang D, Li Y, Ma L, Li X, Li J, Xiao N, Tian J, Rodriguez R.

Effects of curcumin on bladder cancer cells and development of urothelial tumors in a rat bladder carcinogenesis model.

Cancer Lett. 2008 Jun 18;264(2):299-308.

52.Yuan Q, Li PD, Li BH, Yang XZ, Xu SB, Liu XH, Zhou FX, Zhang WJ.

Differential IL-4/Stat6 activities correlate with differential expression of regulatory genes SOCS-1, SHP-1, and PP2A in colon cancer cells.

J Cancer Res Clin Oncol. 2008 Jun 7.

53.Wan F, You J, Sun Y, Zhang XG, Cui FD, Du YZ, Yuan H, Hu FQ.

Studies on PEG-modified SLNs loading vinorelbine bitartrate (I): preparation and evaluation in vitro.

Int J Pharm. 2008 Jul 9;359(1-2):104-10.

54.Tian SL, Wang XY, Ding GH.

Repeated electro-acupuncture attenuates chronic visceral hypersensitivity and spinal cord NMDA receptor phosphorylation in a rat irritable bowel syndrome model.

Life Sci. 2008 Jul 22.

55.Chen M, Li Y, Yang T, Wang Y, Bai Y, Xie X.

ADMA induces monocyte adhesion via activation of chemokine receptors in cultured THP-1 cells.

Cytokine. 2008 Aug;43(2):149-59.

56.Wei Y, Weng D, Li F, Zou X, Young DO, Ji J, Shen P.

Involvement of JNK regulation in oxidative stress-mediated murine liver injury by microcystin-LR.

Apoptosis. 2008 Aug;13(8):1031-42.

(整理)6种方法测定蛋白质含量.

6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05NaOH配制。 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6?4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 2.器材: 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分

几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 (一)蛋白质测定方法的比较(原理、优缺点)蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010) 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高,适用于0.2~ I.Omg氮,误差为土2%;操作复杂费时,整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。,测得结果为总氮含量,包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广,几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法

6种方法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-12-25| 字体: [大 中 小] 一、微量凯氏(kjeldahl )定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入cuso4作催化剂,k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(biuret 法) (一)实验原理 双缩脲(nh3conhconh3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与cuso4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法(一) 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

蛋白质含量测定方法汇总

实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有染料法,双缩脲(Biuret)法,酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1.掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2.了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合,此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色,吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势,因为它操作简单,反应时间短,染料-蛋白质颜色稳定,抗干扰性强。本法的缺点是:对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质,有一定误差,因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管;试管;721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液:配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液:称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml,再加入85%的浓磷酸100ml,用水稀释至1000ml,混匀备用。

[操作步骤] 1.标准曲线的绘制: 按上表分别向各支试管内加入各种试剂,充分混匀,5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2.样品测定: 取1ml样品溶液(约含25~250微克蛋白质),加入染料溶液5ml混匀,5min后测定其595nm吸光度值,对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2),或与此相似的基团[如—CH2-NH2,—CS-NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】:蛋白质含量测定方法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford),Folin —酚试剂法(Lowry)杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以在本公司订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替,杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃),通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,每种方法都有其优缺点,在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间 【关键词】:凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL;硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min;与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品,节省时间,提高了工作效率,适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的测定方法 蛋白质含量的测定是我们判断每一种食物是否含有高蛋白,所以我们建议大家应该要对于蛋白质的检测方法有一定的认识。一般我们在生活中检查蛋白质含量的方法是通过硫酸铜的方法,也可以通过酚试剂的方法,所以大家觉得哪种方法比较方便,我们建议大家可以尝试一下文章介绍的方法。 双缩脲法(Biuret法)灵敏度低1~20mg中速20~30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似。 紫外吸收法较为灵敏50~100mg快速5~10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶; Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高~5mg慢速40~60分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和phe还原硫酸铵;Tris 缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化。 考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1~5mg快速5~15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液; SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化。 硫酸铜法:称取0.2g硫酸铜,6g硫酸钾,把0.5g粉碎好的大豆(不用测量水分的)用滤纸包好放入定氮瓶中中,加20ml硫酸,

(瓶口上放一个小漏斗,防止蛋白跑掉)小火在电炉子上消化,等没有碳化颗粒,并处于澄清状态时,拿下来凉一会。再加过氧化氢直到把瓶颈上的蛋白冲洗干净为止,再消化30分钟。拿下来,等凉。 通过这篇文章对于蛋白质含量测定方法的介绍,我们应该都知道如何在生活检查蛋白质的含量,所以我们建议大家应该要对于蛋白质的测定方法进行分析。一般我们在生活中检测蛋白质的方法是比较多的,希望你们可以采纳文章介绍的方法。

蛋白质含量测定方法比较

. 蛋白质含量测定主要有五种方法,分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点,优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点:重现性好,是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点:操作比较繁复,费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸,生物碱,含氮类脂,卟啉,含氮色素等非蛋白质含氮化合物。 双缩脲定氮法 双缩脲(NHCONHCONH)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个33分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO形成紫色络合物,称4为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点:较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的

缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋1 / 5 . 白质测定。 缺点:不太灵敏;不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点:对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。 缺点:准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。此外,进行紫外吸收

蛋白质含量测定(凯氏定氮法)

食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法) 一、目的与要求 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术,包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。 三、仪器与试剂 硫酸铜(CuSO4·5H20)硫酸钾硫酸(密度为1.8419g/L)硼酸溶液(20g/L) 氢氧化钠溶液(400g/L)0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。 混合指示试剂:0.1%甲基红乙溶液液1份,与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。 微量定氮蒸馏装置:如图3-所示。 图3-微量凯氏定氮装置 1、电炉; 2、水蒸气发生器(2L平底烧瓶); 3、螺旋夹a; 4、小漏斗及棒状玻璃塞(样品入口处); 5、反应室; 6、反应室外层; 7、橡皮管及螺旋夹b;8、冷凝管;9、蒸馏液接收瓶。 四、实验步骤 1、样品消化 称取样品约2.00g(±0.001g),移入干燥的100mL凯氏烧瓶中,加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾,稍摇匀后瓶口放一小漏斗,加入20mL浓硫酸,将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上,使用万用电炉,在通风橱中加热消化,开始时用低温加热,待内容物全部炭化,泡沫停止后,再升高温度保持微沸,消化至液体呈蓝绿色澄清透明后,继续加热0.5h,取下放冷,小心加20mL水,放冷后,无损地转移到100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀备用,即为消化液。 试剂空白实验:取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸,按以上同样方法进行消化,冷却,加水定容至100mL,得试剂空白消化液。

蛋白质浓度的测定(精华)

蛋白质浓度的测定 一.紫外吸收法 1. 近紫外吸收光谱法(280 nm) 原理:蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基,这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质,它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。某些蛋白质含有二硫键,也会在280 nm附近吸收紫外光。近紫外吸收法就是根据这个性质,对蛋白质进行定量。因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异,所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。比如,当蛋白质浓度为1 mg/ml时,吸光度A280可为0-4之间的任何值。但是,大部分的蛋白质的吸光度A 时0.5-1.5之间的某个值。 280 该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。这种方法操作简单,测定完成后,样品可以被回收,对buffer没有特殊要求,这是该方法的优点。该方法的缺点是:其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定,比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强,少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。同时,不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。 蛋白质浓度的计算: 朗伯比尔定律:A (absorbance) = ε c l,因此:c(mg/ml)= A/ε l (cm)。消光系数:当蛋白质浓度为1 mg/ml,光径为1 cm时,所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。 蛋白质的消光系数计算公式:A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。其中M为蛋白质分子质量,5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数,n是该氨基酸残基的数目。 2. 远紫外吸收光谱法 在190-210 nm围,蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。此波长围,肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍,而且在190 nm,氧气对紫外光的吸收非常强,因此,通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。对于1 mg/ml的蛋白质溶液,它们的消光系数通常在30-35之间。对于不同的蛋白质,

可溶性蛋白质含量的测定

可溶性蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G—250染色法 一.原理 考马斯亮蓝G—250染色法是利用蛋白质与染料结合的原理,定量地测量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色,最大光吸收由465nm变成595nm,通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1h之后,蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高(比Lowry法灵敏4倍)易于操作,干扰物质少,是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 二.实验材料、试剂与仪器设备 1.实验材料 水稻不同萌发时期的种子 2.试剂 (1)标准蛋白质溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)。称取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40Ml,用蒸馏水稀释至100mL即可。 (2)考马斯亮蓝试剂。称取100mg考马斯亮蓝G—250,溶于50mL90%乙醇中,加入100mL85%的磷酸,再用蒸馏水定容到1000mL,贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。3.仪器和设备 分光光度计,离心机,研钵,烧杯,量瓶,移液管,试管等。 三.实验步骤 1.标准曲线的绘制 取6支试管,按下表加入试剂,摇匀,向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂,摇匀,并放置5min左右,以0号试管为空白对照,在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2.样品测定 (1)样品提取。称取鲜样0.25—0.5g,用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,3000r/min 离心10min,上清液备用。 (2)吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释),放入试管中(每个样品重复2次),加入5mL考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置2min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查的蛋白质的含量。 四.结果计算 样品蛋白质的含量=C V/1000VW(mg/g) 式中:C—查标准曲线值,ug; VT—提取液总体积,mL; WF—样品鲜重,g; VS—测定时加样量,mL

蛋白含量测定及western步骤

蛋白的提取和定量 肺组织用预冷1×TBS洗净后,加入含PMSF的RIPAbuffer(冰上操作,310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积),50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管,冰上孵育1h,10000转4℃离心10min,转上清至新管。裂解液分装后保存于-70℃ 蛋白质定量:BCA蛋白测定法 ①根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 ②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中,BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。 ③将标准品按0,2,5,10,15,20,25ul标准品孔中,加蒸馏水稀释标准品的 ④加样品2uL加到96孔板的样品孔中,加蒸馏水23微升。 ⑤各孔加入200微升BCA工作液,37o C放置30分钟。同时打开酶标仪预热。 注:也可以室温放置2小时,或60o C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低,适量在较高温度孵育,或延长孵育时间。 ⑥测定A570的波长,根据标准曲线计算出蛋白浓度。 ⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积(调所有样品浓度至3-5ug/ul): 总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3(ul) RSB=1/5*总体积(ul) TBS=总体积-RSB-蛋白体积(ul) 先加RSB(对蛋白有保护作用),后加TBS。最后放于-70℃保存。 WesternBlot SDS-PAGE 1.玻璃板:注意对齐、夹紧,防止漏出,短板朝前。

至距绿线1cm左右,用dd水封顶,放置30-40min。状况好时往往能观察到水与胶的界限。 4.分离胶凝固后,配制浓缩胶。将水倒掉,灌好浓缩胶,立刻插入梳子,等待40min。在此期间,打开水浴锅(100℃) 注:此步后可停止,将胶连同梳子放入4℃保存一夜,若保存时间较长,为防止水分流失,可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。 5.电泳前准备好:待测蛋白、Marker、1*runningbuffer。蛋白在沸水中煮3-5min。(第二次后不用煮沸) 6.拔梳子,立即用1*runningbuffer冲洗孔道(用塑料吸管)。 7.将玻璃板取出,固定于电泳槽(短面冲里-相对),也要牢固,可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。 注:标记号1、2板及左右。 8.固定好后,加样。 跑道号码加入物质及体积 13.5ulMarker(thermo#26616) 2-1010ulSample 9.玻璃电泳槽倒满1*runningbuffer,电泳液没过电泳槽中的钢丝即可,注意标记好带的顺序。 10.电极 黑对黑红对红,电压100V电泳1-1.5h,等蓝色条带跑出后再等待10-15min。蓝带对应8KD蛋白,根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间,确保不让目标蛋白抛出凝胶。一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。 Western-ECL 一、转膜 1.玻璃板取出,用跷胶片打开,标记好切胶位置,将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。切胶时不要划,要切。注意,在右上角切口标记,量胶的长、宽。 2.将切好的胶(粘在一片玻璃板上)浸入Transbuffer,晃动使胶脱离下来,放上摇床,中速30min。 3.根据胶的长宽剪滤纸和PVDF膜(不能折,不能用手碰),PVDF膜的右上角与胶一样切口。滤纸不能太大,膜可以大一点。PVDF膜甲醇激活,transbuffer 摇床10min。将滤纸浸入Transbuffer。(Transbuffer不倒掉) 4.转膜装置: ①滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁,四层叠在一起使用 ②三明治由低层向高层为:四层滤纸――膜――胶――四层滤纸,大小要一致 ③滤纸、膜、胶都需要用TRANSBUFFER浸透,上面滴加TRANSBUFFER ④100伏转印60分钟。

蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法

实验九蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法 目的要求 学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式,最大光吸收由465nm变成595nm,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1h,之后,蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,在测定溶液中含蛋白质5μL/ml时就有0.275光吸收值的变化,比Lowry 法灵敏4倍,测定范围为10-100μg蛋白质,微量测定法测定范围是1-10μg蛋白质。此反应重复性好,精确度高,线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲,这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠,试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低,但直线弯曲程度很轻,不影响测定。 此方法干扰物少,研究表明:NaCl,KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰,这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris,乙酸,2―巯基乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污剂如Triton X―100,SDS,玻璃去污剂有少量颜色干扰,用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是,大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中,加入100ml85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250,4.7%(W/V)乙醇。 二、标准和待测蛋白质溶液 1.标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml,0.1mg/ml蛋白溶液。 2.未知蛋白质溶液。 三、器材 试管及试管架,移液管(0.1ml及5ml),UV-2000型分光光度计。

0731 蛋白质含量测定法 - 国家药典委员会

0731
蛋白质含量测定法
1
组成蛋白质的基本单位是氨基酸, 氨基酸通过脱水缩合形成肽链, 蛋白质是一条或多条 多肽链组成的生物大分子。 不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方 法学验证,同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。2 第一法 凯氏定氮法3
本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物, 当与硫酸和硫酸铜、 硫酸钾一同加热消化时使 蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收后以 硫酸滴定液滴定,根据酸的消耗量算出含氮量,再将含氮量乘以换算系数,即为蛋白质的含 量。 本法灵敏度较低,适用于 0.2~2.0mg 氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中 所含氨基酸的结构差异会稍有区别。 供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备,生物制品按如下方法操作。
精密量取供试品(如供试品为冻干制剂或固体粉末时,应复溶后量取)适量,用 0.9%氯 化钠溶液稀释并定量制成每 1ml 中含氮量约 1mg 的溶液,精密量取 1ml,作为总氮供试品 溶液进行测定。非蛋白氮供试品溶液的制备,除另有规定外,照附注项下钨酸沉淀法操作, 即得。 测定法 除另有规定外,按测定法(1)操作,生物制品按测定法(2)操作。
(1) 本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各 品种项下规定的供试品溶液适量,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(通则 0704 第二法)测定供 试品溶液的含氮量,除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为 6.25。
1
中国药典 2010 年版一部无蛋白质测定的附录;二部附录Ⅶ M 中收载的蛋白质含量测定法,包括凯式定 氮法、福林酚法(Lowry 法) 、双缩脲法、2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸法(BCA 法) 、考马斯亮蓝法、紫外 -可见分光光度法共六种方法;三部附录Ⅵ B 中收载的蛋白质测定法,包括凯氏定氮法、Lowry 法和双缩 脲法三种方法。上海所通过对已有的蛋白质测定法的系统性、规范化研究,将中国药典 2010 年版二、三部 各附录的所有测定方法进行梳理规范,拟整合成统一的附录。 2 关于各法测定所用蛋白对照品,为正确规范使用对照品和标准品,拟统一改为“蛋白测定用对照品” 。但 是,由于二部品种与三部品种中蛋白测定用对照品的来源、适用范围等均不同,二部采用中检院对照:血 清白蛋白(牛) ;三部亦采用中检院对照:蛋白含量测定国家标准品;两者未统一。故拟订标准中暂未统称 为“蛋白测定用对照品” ,而是将其分别标示为“血清白蛋白(牛)对照品”和“蛋白含量测定国家标准品” , 从而供不同品种分别采用,以免混淆。建议中检院统一对照品后再作修订。 3 本法中国药典 2010 年版二部、三部均有收载,且与欧洲药典 8.0 版、英国药典 2013 年版与美国药典 36 版附录中收载的方法基本一致。不同点在于:(1)二部附录对供试品溶液并未做具体规定,三部附录给出了 供试品溶液的制备方法;(2)二部附录给出非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的测定,三部 附录采用钨酸沉淀法用于非氮的测定,采用三氯醋酸沉淀法直接测定供试品中蛋白氮的含量。二部、三部 所用这两种蛋白沉淀方法原理、操作、试液浓度均基本一致。经试验验证,整合为现有内容。

蛋白质含量测定方法比较

蛋白质含量测定主要有五种方法,分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点,优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点:重现性好,是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点:操作比较繁复,费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸,生物碱,含氮类脂,卟啉,含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点:较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋

白质测定。 缺点:不太灵敏;不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点:对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。 缺点:准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。此外,进行紫外

相关文档
最新文档