Western Blot PPT

ImageJ对WesternBlot进行灰度分析

Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件：Windows 版本 第一步：软件安装 1.下载地址：https://www.360docs.net/doc/426427116.html,/ij/download.html 2.下载windows 32位带Java版本，双击软件安装。 第二步：界面介绍 1.软件界面 第三步：图片分析 1.下图为样板图片 2.导入图片：File> Open> Sample1.jpg 图片导入后，Sample1.jpg在新的窗口中打开

3.图片类型设置：Image> Type> 8 bit 4.去除图片背景：Process> Subtract Background> …

4.1Subtract Background 窗口：Rolling ball radius 设为50 pixels， 勾选light background，可选preview，点击“OK”确定 5.工具栏:选择“矩形选框”

6.最大化“Sample1.jpg”窗口，便于矩形选择，矩形选择第一个泳道 7.标记“矩形选框”为1：矩形选择后，调整矩形至合适大小，按下数字键 “1”，或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。 8.选择“泳道2”：拖动“1”的矩形框，会出现两个矩形选框，拖动矩形框 至泳道2，调整位置，并按下数字键“2”，Image J 会自动调整大小使“矩形框2”与“矩形框1”保持同一水平。 9.继续拖动，会出项新的“矩形选框”，调增至泳道3，并按下数字键“2” （注意：是按下数字键“2”），重复9至6个泳道全部选择。 10.所有泳道选择后，按下数字键“3”，出现分析图谱。

显色指数评判

LED的光色组合照明系统推动了照明理念的变革，LED光源的显色性问题引起国际上广泛争议，CRI不能表示白光LED的显色范围。美国提出的CQS、GAI等评价方法也只是对CRI 的修修补补。人眼的视觉认知特性与非视觉感知决定了对照明质与量的要求，应根据LED 高色饱和度产生的视觉效果对照明、物体色和固有色有更加深刻的理解，探索采用高色饱和度LED组合照明系统，满足人们对科学、安全、健康、舒适性照明的需求。 前言 LED产业技术发展迅速，发光效率160lm/w的产品已面市，高质量的白光——显色指数CRI在90以上，色温3000K，100lm/w以上的光源已大批量生产，LED进入功能性照明的时代已来临。 LED高色饱和度的特性，可实现数字化、智能化、网络化的多光谱组合调控，能够满足不同视觉作业和功能性照明的需求。而基于传统普朗克黑体辐射理论形成的色温、显色指数、色差修正等照明国际标准，与使用高色饱度LED组合光源的视觉认知与非视觉感知效果相差较大。实践表明，这引起物理光度学、物理色度学与目视光度学、目视色度学的差距拉大。也使得光度学、色度学、测量学、色彩工程学等受到严重的挑战，引发照明理论的创新。以下是我们提出高色饱和度LED色光组合照明引起国际争议的问题，探讨高色饱和度LED 组合照明将成为照明的新亮点、新热点。 一、对照明本质的理解 人工照明是光源系统、被照物体和观察者三者之间联动作用的综合效应。LED光源可发出色饱和度高的单色光，多种色光的组合使被照物体更加鲜艳夺目，对人的生理、心理产生非同寻常的影响。我们认为照明是多种学科技术交叉的系统工程。理对物的解释是科学，情对物的表达是艺术，情与理的结合是心理，照明的本质是物、理、情的结合，如图1所示。 目前所有照明理论和标准大都局限和定位于视看要求，对于生物学和心理学的效应和要求还顾及不多。丰富多彩的LED照明系统使“光与健康”的命题空前活跃，国际上已开过多次高水平的研讨会，包括医学家、建筑师、照明专家共同从正面研讨发挥LED照明系统的潜能。 图1. 照明的本质是物、理、情的结合

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理 简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤 （一）蛋白样品制备 培养的细胞（定性） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞（定量） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 4.12000g离心，4℃，2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 （二）SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样 （3）电泳 （三）转膜 （四）免疫反应 （五）化学发光，显影，定影 （六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

、蛋白质的显色反应

实验二蛋白质的显色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应 1、双缩脲反应 （1）原理： 尿素加热至180o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。可用于蛋白质的定性或定量测定。 反应式如下： 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个 -CS-NH 2, -CH 2 -NH 2 , -CHR-NH 2 , -CH 2 -NH 2 -CH-NH 2 -CH 2 -OH或-CHOHCH 2 NH 2 等基团的物 质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。NH 3也干扰此反应，因为NH 3 与Cu2+可生成 暗蓝色的络离子Cu（NH 3） 4 2+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反 应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 （2）试剂 ①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9） （3）操作

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1mL，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色） 向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）约1mL和10%氢氧化钠溶液约2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 2、茚三酮反应 (1) 原理 蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有 -氨基酸均能发生该反应，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。氨、β-丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应的不一定都是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步， 第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱羧成醛，放出CO 2、NH 3 ，水合茚三 酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质。 反应机理如下： 该反应非常灵敏，1：150万浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。但在定性、定量测定中，一方面要严防干扰物存在，另 蓝紫色

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 Western blot基本原理： 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot应用： 目的蛋白的表达特性分析； 目的蛋白与其他蛋白的互作； 目的蛋白的组织定位； 目的蛋白的表达量分析； 蛋白样品的制备： 1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般； 2 有机溶剂提取法； 3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强； 4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Western blot注意事项和常见问题：

1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

生化实验实验三-蛋白质颜色反应及沉淀反应

实验三蛋白质颜色反应及沉淀反应 一、目的 1、掌握鉴定蛋白质的原理及方法。 2、熟悉蛋白质的沉淀反应。 3、进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸种类不同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定性被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。 三、实验器材 1、鸡蛋白 2、试管 3、吸管 4、滴管 5、水浴锅等 四、实验试剂 1、卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，2-3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。 3、10%氢氧化钠溶液：10g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至100ml。 4、浓硝酸：比重1.42。 5、1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。 6、饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。 7、95%乙醇。 8、结晶氯化钠。 9、1%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。 10、饱和苦味酸溶液。 11、1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。 五、操作 1、颜色反应： A、双缩脲反应：蛋白质分子中含有肽键，与两分子尿素经过加热形成的双缩脲的结构相似，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物。 取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 B、黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物。

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

蛋白质的显色反应

蛋白质的显色反应

实验二蛋白质的显色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应 1、双缩脲反应 （1）原理： 尿素加热至180o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。可用于蛋白质的定性或定量测定。 反应式如下：

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1mL ，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色） 向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）约1mL 和10%氢氧化钠溶液约2mL ，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 2、茚三酮反应 (1) 原理 蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有 -氨基酸均能发生该反应 ，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。氨、β-丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应的不一定都是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步，C C C OH OH +H 2N C H COOH R O O

WesternBlot结果条带分析

W e s t e r n B l o t结果条带 分析 Revised final draft November 26, 2020

W e s t e r n B l o t结果条带全面分析 1.空白 原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。 解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。 2.高背景 原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。 解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。 3.非特异性条带 原因：一抗非特异性与蛋白结合 解决办法：更换一抗 4.条带中出现边缘规则的白圈 原因：电转中膜和胶之间存在气泡。 解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡 5.出现黑点和黑斑 原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合 解决办法：封闭结束之后要洗。 6.条带拖尾 原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长 解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。 7.出现非均一性背景 原因：膜可能曾经干过 解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。 8.某个条带变形 原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒 解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。 9.条带呈哑铃状 原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一 解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用 10.最边缘条带弯曲 原因：电泳电流不均一 解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔 其他问题 （1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。 （2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。 （3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。 （4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。 （5）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好 （6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。 （7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒 （8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

光源的显色性与色温

光源的显色性与色温 光源对物体的显色能力称为显色性，是通过与同色温的参考或基准光源（白炽灯或太阳光）下物体外观颜色的比较。光所发射的光谱内容决定光源的光色，但同样光色可由许多，少数甚至仅仅两个单色的光波纵使而成，对各个颜色的显色性亦大不相同。相同光色的光源会有相异的光谱组成，光谱组成较广的光源较有可能提供较佳的显色品质。 当光源光谱中很少或缺乏物体在基准光源下所反射的主波时，会使颜色产生明显的色差(color shift)。色差程度愈大，光源对该色的显色性愈差。演色指数系数(Kaufman)仍为目前定义光源显色性评价的普遍方法 显色分两种 忠实显色：能正确表现物质本来的颜色需使用显色指数(Ra)高的光源，其数值接近100，显色性最好。 效果显色：要鲜明地强调特定色彩，表现美的生活可以利用加色的方法来加强显色效果。采用低色温光源照射，能使红色更加鲜艳；采用中等色温光源照射，使蓝色具有清凉感；采用高色温光源照射，使物体有冷的感觉。 显色指数与显色性的关系 当光源光谱中很少或缺乏物体在基准光源下所反射的主波时，会使颜色产生明显的color shift.色差程度越大，光源对该色的显色性越差。演色指数系数（Kau fman）仍为目前定义光源显色性评价的普遍方法。 白炽灯的显色指数定义为100，视为理想的基准光源。此系统以8种彩度中等的标准色样来检验，比较在测试光源下与在同色温的基准下此8色的偏离（Deviation）程度，以测量该光源的显色指数，取平均偏差值Ra20-100，以100为最高，平均色差越大，Rr值越低。低于20的光源通常不适于一般用途。 指数（Ra）等级显色性一般应用90-100 1A 优良需要色彩精确对比的场所 80-89 1B 需要色彩正确判断的场所 60-79 2 普通需要中等显色性的场所 40-59 3 对显色性的要求较低，色差较小的场所 20-39 4 较差对显色性无具体要求的场所 色温（CT-color temperature） 当光源所发出的光的颜色与黑体在某一温度下辐射的颜色相同时，黑体的温度就称为该光源的色温，用绝对温度K （kelvim）表示.黑体辐射理论是建立在热辐射基础上的，所以白炽灯一类的热辐射光源的光谱功率分布与黑体在可见区的光谱功率分布比较接近，都是连续光谱，用色温的概念完全可以描述这类光源的颜色特性。 相关色温（CCT-correlated color temperature） 当光源所发出的光的颜色与黑体在某一温度下辐射的颜色接近时，黑体的温度就称为该光源的相关色温，单位为K。由于气体放电光源一般为非连续光谱，与黑体辐射的连续光谱不能完全吻合，所以都采用相关色温来近似描述其颜色特性。色温（或相关色温）在3300K以下的光源，颜色偏红，给人一种温暖的感觉。色温超过5300K时，颜色偏兰，给人一种清冷的感觉。通常气温较高的地区，人们多采用色温高于4000K的光源，而气温较低的地区则多用4000K以下的光源。 色指数（Ra-color rendering index） 太阳光和白炽灯均辐射连续光谱，在可见光的波长（380nm-760nm）范围内，包含着红、橙、黄、绿、青、兰、紫等各种色光。物体在太阳光和白炽灯的照射下，显示出它的真实颜色，但当物体在非连续光谱的气体放电灯的照射下，颜色就会有不同程度的失真。我们把光源对物体真实颜色的呈现程度称为光源的显色性。为了对光源的显色性进行定量的评价，引入显色指数的概念。以标准光源为准，将其显色指数定为100，其余光源的显色指数均低于100。显色指数用Ra表示，Ra值越大，光源的显色性越好

WesternBlot原理和操作方法(全)讲解

Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

显色指数

1.什么是显色指数？ 显色指数（Color Rendering Index），简称CRI。指物体用该光源照明和用标准光源（一般用正午时候的太阳光做标准光源）照明时，其颜色符合程度的量度，也就是颜色逼真的程度。显色指数用Ra表示，最好和最大的数值为100。具体灯具的Ra值可见如下： 白炽灯97，日光色荧光灯80-94，白色荧光灯80-90，卤钨灯80-90，高压汞灯22-51，高压钠灯20-30，金属卤化物灯60-65，LED可以达到97。 Lamp 白炽灯日光色荧光灯白色荧光灯卤钨灯高压汞灯高压钠灯金属卤化物灯LED Ra 97 80-94 80-90 80-90 22-51 20-30 60-65 97 显色指数有15种颜色，取前面八种常见颜色R1-R8的平均值，记做Ra。 2. LED的显色指数-strength LED灯具最大的优势就是节能环保，在商业照明和家居照明中能广泛取代现有的节能灯和卤素灯，光效的增加可以减少瓦数的使用，从而达到节能的目的。 目前在中国的厂家，基本标配是使用Ra>70的灯珠光源，而我们公司所用至少是Ra>80，如果客户要求也可提供Ra>90甚至Ra=97，目前市面上显指最高的可达到97，是西铁城的2W-20W。

虽然现今的LED显色指数已经能达到97，但也只有极少数的品牌可以做到，并且价格相对于卤素灯昂贵很多。并且各大厂家水准不一，为了降低成本甚至会使用60显指左右的灯珠，甚至是二次回收的灯珠。 4.LED的显色指数-Opportunity 各国鼓吹绿色经济，省电节能的LED自然受到政府的支持。一些国家的政府，比如美国和新西兰等，企业提供购买环保照明产品的津贴。LED是会逐步取代传统灯具，各大光源品牌例如西铁城、日亚等也每年增加研发资金，提高光色和光效。LED也有一些传统灯不能匹敌的功能，就是在细分市场上，如肉类照明、家居照明等，显色指数和光谱的配合能够使物体的颜色锦上添花，提高消费者的购买欲望，这是连自然光也做不到的。 5.LED的显色指数-Threats 人们普遍认为，传统灯显指能够达到100，最能体现物体的真实颜色。今天2015香港秋季展，钨丝灯有复辟的苗头，其造型精美，确实更加适合气氛温暖的场景，如餐厅，酒店，家居装饰。市面上的LED产品参差不齐，以次充好，不专业的知识误导客户，声称5500K的色温能够达到95显指。作为批发商、零售商、工程商对显色指数的知识甚少，这也难怪终端客户买不到好产品。 6.LED的显色指数-Questions 既然显色指数越高越好，那么显色指数又会受到什么影响呢？跟色温有关系吗？R1-R8的平均值是Ra，那R9-R15的数据对显色指数和光色又有什么影响呢？我们下节再说。 See you next week

最详细的WesternBlot过程步骤详解

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

色纯度、显色指数

色纯度 色纯度(Purity) 其为以主波长描述颜色时之辅助表示，以百分比计，定义为待测件色度坐标与E光源之色度坐标直线距离与E光源至该待测件主波长之光谱轨迹(SpectralLocus)色度坐标距离的百分比，纯度愈高，代表待测件的色度坐标愈接近其该主波长的光谱色，是以纯度愈高的待测件，愈适合以主波长描述其颜色特性，LED即是一例。 显色指数 光源对物体的显色能力称为显色性，是通过与同色温的参考或基准光源（白炽灯或画光）下物体外观颜色的比较。光所发射的光谱内容决定光源的光色，但同样光色可由许多，少数甚至仅仅两个单色的光波纵使而成，对各个颜色的显色性亦大不相同。相同光色的光源会有相异的光谱组成，光谱组成较广的光源较有可能提供较佳的显色品质。当光源光谱中很少或缺乏物体在基准光源下所反射的主波时，会使颜色产生明显的色差(color shift)。色差程度愈大，光源对该色的显色性愈差。演色指数系数(Kaufman)仍为目前定义光源显色性评价的普遍方法。 目录 编辑本段 忠实显色： 能正确表现物质本来的颜色需使用显色指数(Ra)高的光源，其数值接近100，显色性最好。

效果显色： 要鲜明地强调特定色彩，表现美的生活可以利用加色的方法来加强显色效果。采用低色温光源照射，能使红色更加鲜艳；采用中等色温光源照射，使蓝色具有清凉感；采用高色温光源照射，使物体有冷的感觉。 编辑本段 显色指数与显色性的关系 当光源光谱中很少或缺乏物体在基准光源下所反射的主波时，会使颜色产生明显的color shift.色差程度越大，光源对该色的显色性越差。演色指数系数（Kau fman）仍为目前定义光源显色性评价的普遍方法。 白炽灯的显色指数定义为100，视为理想的基准光源。此系统以8种彩度中等的标准色样来检验，比较在测试光源下与在同色温的基准下此8色的偏离（Deviation）程度，以测量该光源的显色指数，取平均偏差值Ra20-100，以100为最高，平均色差越大，Ra值越低。低于20的光源通常不适于一般用途。 指数（Ra）等级显色性一般应用 90-100 1A 优良需要色彩精确对比的场所 80-89 1B 需要色彩正确判断的场所 60-79 2 普通需要中等显色性的场所 40-59 3 对显色性的要求较低，色差较小的场所 20-39 4 较差对显色性无具体要求的场所 白炽灯的理论显色指数为100，但实际生活中的白炽灯种类繁多，应用也不同，所以其Ra值不是完全一致的。只能说是接近100，是显色性最好的灯具。具体灯具的Ra值可见下表所举。 光源显色指数Ra 白炽灯97 日光色荧光灯80-94 白色荧光灯75-85 暖白色荧光灯80-90 卤钨灯95-99 高压汞灯22-51 高压钠灯20-30 金属卤化物灯60-65 钠铊铟灯60-65 镝灯85以上