雉科鸟类性别鉴定--苏浩宇

题目：一种快速鉴定雉科鸟类的性别

的方法

作者苏浩宇

完成日期2012年10月

指导老师：彭确昆

摘要：

在参观成都市观鸟月的活动中，我发现动物园中很多雉科鸟类的颜色十分鲜艳且很相近，很难用肉眼进行辨别它们的性别，比如雉鹑、鹌鹑等。尤其是这些鸟类在野外要对他们进行性别辨别将是一件很困难的事情。通过文献查阅，我清楚地了解到雉科鸟类中有很大一部分的动物，它们的雌雄个体的体态相似，羽毛颜色很接近，它们并不像我们在公园里见到的孔雀和家鸡一样很容易通过颜色和体态就可以进行性别区分，这一类鸟叫单形态鸟。这一个问题引起了我极大的兴趣，如果不能很好的区分这些鸟的性别对于我们的保护人员来说就不能很好的开展繁育保护工作。因此这一问题值得我们去探究。

高中教科书中介绍了关于鸟类性别的很多知识。我们知道鸟类的性别决定系统为ZW型(其中雄性为ZZ, 雌性为ZW),。在鸟类性别鉴定的历史中，曾经也出现过很多的技术，但是由于这些基因或者方法不够稳定，因此逐渐被人们舍弃。后来，人们就将目光转移到决定鸟类性别的ZW染色体上，并找到了这样一个可以很好区分雌雄个体的基因-CHD基因。CHD基因在鸟类中有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，雄雄鸟中只有CHD-Z，而雌性鸟类中同时具有CHD-W和CHD-Z，且CHD-Z基因的长度要小于CHD-W。因此，利用一对CHD基因引物同时去扩增鸟类的CHD基因，那么在雄性鸟类中只会得到一个大小长度的基因片段，而在雌鸟中由于具有两个不同长度的拷贝，再通过电泳将不同长度的CHD 基因区分开，这样就可以直观的观察到二者的差异。

本实验我们根据已有的CHD基因序列重新设计了一对CHD基因内含子的引物对，这一对引物序列更短，扩增效果更好。我们利用该引物对来自成都市动物园的四组(8个)雉科个体的CHD基因进行了扩增，电泳检测结果显示雄性

CHD基因的长度和雌性存在差异，雌雄具有两条带大小不一的带型，而雄性只有一条带。这一方法能准确无误地区分雉科鸟类的性别，同时也说明CHD基因作为雉科鸟类性别鉴定的分子标记是可靠的。这一实验虽然简单，但是可以帮我们的鸟类保护者很好对这些濒危的鸟类进行繁育和保护，有着非常重要的意义。关键词：雉科，CHD基因，性别鉴定，PCR

1引言

去年夏天，我参加了学校组织的观鸟爱鸟月活动，和来自成都高校的几位老师和同学一起进行了为期一个月的成都市鸟类观察活动。整个活动内容非常丰富，不仅让我对鸟类有更多更新的认识，还激励了我将来积极投身于鸟类的保护行动中去。在参观成都市动物园的过程中，我看到了很多非常美丽的鸟类，它们长着美丽的长羽毛，飞行能力不是很好，常常成双成对结伴觅食，最后我询问一道参观的老师，才得知这些美丽的鸟儿都是属于雉科的鸟类。对于一个高中生来说，“雉科”这个陌生的名字让我对它们的身世产生了浓厚的兴趣，此外，这些走起路来器宇轩昂的鸟儿似乎在向我们宣示“双鸟傍地走，安能便是我雌雄？”这些长相酷似的鸟儿到底谁是雄性谁是雌性呢？带着这些疑问，我决定去借助电子图书馆一查究竟。随后，我登录到四川大学电子图书馆利用这里丰富的电子资源查到了很多关于雉科鸟儿的知识，并着手找到一种能快速准确鉴定这些鸟儿性别的方法。

通过查阅文献，我得知生物学家按照亲缘关系的远近，将生物分为界、门、纲、目、科、属、种这些不同的类，雉科其实是鸟类下面的一级分类单元。雉科在生物分类学上是鸟纲中的鸡形目中的一个科，多达26属166个物种。我国是世界上雉科鸟类最多的国家，拥有90%的雉科鸟类物种。在中国，特别是中国的西南地区种类非常丰富，拥有世界上雉科近1/3的种类，其中又有大约1/3是我国的特产种，有“雉类的王国”之称。中国的雉科中有超过一半的种类是国家重点保护野生动物。雉科又有分为雉类和鹑类，雉类通常颜色较为鲜艳，且雌雄个体的颜色差异很大，通常是雄性的颜色较为鲜艳，而雌雄的颜色则较为暗淡。雉类中的鸟最为常见的有家鸡，孔雀等，它们雌雄个体的颜色通常可以通过肉眼就

可以辨别。而鹑类中的很多鸟儿，比如鹌鹑、鹧鸪（图1-1）等，它们雌雄个体羽毛的颜色都较为暗淡，差异很小，很难通过肉眼的方法鉴别它们的性别。此外，有一些雉科鸟类的成鸟的性别很容易判定, 比如可以通过羽毛的颜色或个体大小来区分。但是对于幼鸟, 作为性别标记的成年鸟类羽色特征还未出现, 因此如果保育员或者研究者们要对它们进行标记进行人工性别选择等就会带来很大困难[1]。同样, 性别问题也给从事鸟类研究的科研人员带来了麻烦, 在对鸟类性别划分理论以及鸟类进化理论等的研究中,由于雌雄个体在行为和生理上是有差别的, 性别不能准确判定, 就会得出错误的研究结论。无论是为了人工繁育、保存物种还是科研,尤其是随着一些野生珍稀鸟类的不断灭绝, 鸟类的性别鉴定技术的研究和建立都迫在眉睫。因此，为方便动物园的工作人员以后在雉科鸟类育种的时候进行有效的鉴定和筛选，为我们的雉科鸟类繁育和保护贡献自己的一点微薄之力，我决定借助于现在生物学的知识找到一种快速有效的鉴定方法。

在四川大学的电子图书馆，我下载了很多关于雉科鸟类的文章，我发现其实关于鸟类性别鉴定的方法在上个世界90年代才陆续出现，这些方法鉴定地主要对象是平胸目鸟类，比如鸵鸟、白鹳等这些动物，而专门针对雉科鸟类性别坚定

地方法并没有。在鸟类性别鉴定的分子手段出现之前，外科手术，染色体等常作为单形态鸟类的性别鉴定的手段。但是这些手段常常由于对观察对象要求高以及耗时耗力等因素，已经逐渐被淘汰。比如，鸟类生殖器官通常位于体内，要想区别它们性器官必须要捕获它们才能进行细致的鉴别，因此很多时候一些鸟类，尤其是野生鸟类常会受到惊吓，从而影响它们的生活习性，甚至繁育，对鸟儿来说是一种伤害性的手段。此外，比如我们知道雌雄鸟类的性染色体的形态也有差别，我们可以将鸟儿的细胞染色体进行区分，找到性染色体的差异也可以鉴定性别，但是这种方法需要我们从鸟的身上采集细胞，然后培养制作染色体标本，并在显微镜下进行观察。很显然，这种方法耗时耗力，且会给鸟的身体造成伤害，不能最活体鸟类进行。

中学生物教科书中有专门介绍鸟类的性别的内容。鸟类的性别决定型和哺乳动物人是不一样的，鸟类的性别决定是ZW型, 性染色体有Z和W两种，雄性为ZZ, 雌性为ZW。因此，鸟类的性别差异就存在于性染色体上，性染色体上的基因就是我们去区分性别的出发点。在上个世纪，一些科学家在鸟类的性染色体上发现了一个在雌雄鸟类中有差异的基因，那就是CHD基因。CHD基因实际上是一个在染色质转变成染色体过程中起作用的一个蛋白质编码基因，它可以帮助细胞在分裂末期将染色质包装成染色体。CHD基因在鸟类中有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，雄雄鸟中只有CHD-Z，而雌性鸟类中同时具有CHD-W和CHD-Z，且CHD-Z基因的长度要小于CHD-W。因此，利用一对CHD基因引物同时去扩增鸟类的CHD基因，那么在雄性鸟类中只会得到一个大小长度的基因片段，而在雌鸟中由于具有两个不同长度的拷贝，再通过电泳将不同长度的CHD 基因区分开，这样就可以直观的观察到二者的差异。Griffiths等人在1996[3]设

计了一对P2( 5‘-TCT GCA TCG CTA AAT CCT TT-3’) 和P3 ( 5‘-AGA TAT TCC GGA TCT GAT AGT GA-3’) 引物对扩增了CHD-W和CHD-Z的部分片段, 结果显示扩增产物大小是相同的,但他们发现CHD-W扩增片断有一个Hae酶切位点,而CHD-Z却没有, 于是, 在PCR之后先用Hae处理，这样雄性仍为一条带，而雌性为45bp和65bp两条带，而且成功地对珍稀鸟类金刚鹦鹉[4]进行了性别鉴定。四川大学的周鑫等[5]曾报导过利用CHD基因对四川雉鹑的性别鉴定，他们利用通用引物2550F/2718R扩增四川雉鹑基因组CHD基因，其中雄性个体扩增出约500bp的条带，而雌性个体扩增出500bp和750bp两条条带，从而可以鉴别出四川雉鹑的性别。然而，该研究仅探索了有限数量种群——四川雉鹑的性别鉴定方法，且扩增出的片段较长，带型不够稳定，尤其是雌性的两条带通产不能很好的同时显示，不适合于DNA样品质量较差时的情况，如通过非损伤性取样所获得的DNA。

本研究我在之前的研究基础上，我从NCBI基因库中找到了CHD基因的序列，并通过软件参考前人设计的引物在CHD基因的中设计了一对扩增片段更为短的引物，这一对引物横跨了雌雄雉科鸟类CHD基因变异区的位置，不用经过酶切直接通过电泳就可以区分开片段的大小。且片段的长度只有390bp左右，片段的扩增效果更好，结果稳定。在10个小时之内可以快速准确的鉴定出雉科鸟类的性别。这一方法也为动物园以及野外雉科鸟类保护工作者们提供了很好的便利，方便它们对雉科鸟类繁育和保护工作的开展。

2材料和方法

2.1 材料

本实验所用的8个雉科鸟的血液样本取自成都市动物园，并加入了ACD抗

凝剂。剩余新鲜血液保存于液氮中。4种雉科鸟分别是白冠长尾雉（1♂，1♀），红腹锦鸡（1♂，1♀），勺鸡（1♂，1♀）和白马鸡（1♂，1♀）。

2.2 方法

2.2.1 血液基因组DNA的提取

(1)取约30μl鸡血液样品，放入1.5ml的离心管中；

(2) 加入500μL裂解缓冲液(10mmol/L Tris-Cl；0.1mol/L EDTA；0.5% SDS；pH 8.0)，加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml，混合均匀；

(3)55 o C水浴过夜，同时慢速振荡，直到消化液变清亮为止；

(4)加入与消化液等体积的饱和酚，缓慢颠倒10min直至两相混合成乳浊液，室温13,200rpm离心10min，用小枪头缓慢将黏滞的上清液移至另一离心管；

(5)加上清等体积的苯酚/氯仿异戊醇(25:24:1)，缓慢颠倒10min直至两相混合成乳浊液，室温13,200rpm离心10min，转移上清；

(7)加上清等体积的氯仿，上下颠倒数分钟，13,200rpm 离心15min，转移上清；

(8)加上清体积2倍的冰乙醇，1/5体积醋酸铵，上下颠倒数分钟，然后-20o C放置30min；

(9)12000rpm 5min，用75%的乙醇洗涤沉淀2次，风干，加适量的MiniQ溶解沉淀。

2.2.2 CHD基因引物的设计

我们比对了已知的雉科鸟类的两种Z特异及W特异的同源片段，根据两端的保守序列设计出一对新的通用性强的引物对—CHD-L (5’-CGYCAGTTTCCYTTYCAG-3’ Y=C/T)/CHD-R (5’- CCTTTTATT GATCCATC AAGTC-3’)。如图2-1所示，CHD-L引物位于2550F引物的下游95 bp处，CHD-R 引物位于2718R引物的上游35 bp处。CHD-L/CHD-R的扩增产物长度分别为约

465 bp 和约319 bp。

图2-1 引物设计模式图

2.2.3 PCR扩增CHD基因

反应体系为20 μL，其中 2 μL10 X buffer，0.2 Mm dNTPs,1 U Tag 酶，10 ng 基因组DNA，引物各0.01 mM。反应条件为94℃，4 min；34个循环包括94℃，30 s；54℃，45 s；72℃，45 s；最终72℃，延伸5 min。PCR 反应在Thermal PCR 上进行。PCR扩增的产物直接用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并根据产物的情况判定样品的性别。

3 结果

3.1 基因组DNA的提取

图3-1 基因组DNA检测结果

1-8号基因组DNA以依次为白冠长尾雉（1♂，1♀），红腹锦鸡（1♂，1♀），勺鸡（1♂，1♀）和白马鸡（1♂，1♀）。DNA质量较好，无降解，为下一步CHD 基因扩增做好了准备。

3.2 PCR产物电泳鉴定性别结果

图3-2 CHD基因部分片段扩增结果

1-8号DNA样本代表8个雉科鸟类个体，依次分别是白冠长尾雉♂，白冠长尾雉♀；红腹锦鸡♂，红腹锦鸡♀；勺鸡♂，勺鸡♀；和白马鸡♂，白马鸡♀。不难看出，该引物能够有效地鉴定所有样品的性别，扩增的产物大小分别为465bp 和319bp，在电泳图中表现为雄性只有一条465bp大小的条带，如图3-2中1,3,5,7四个个体。而雌性则有两条长度分别为~465bp和~319bp的条带，如图3-2中的2，4，6，8四个个体，故根据琼脂糖凝胶电泳可以方便地分辨出样品所属个体的性别。所以的结果我们在同样的条件下重复了三次，且结果都非常的稳定和准确。

4 讨论

4.1 雉科鸟类性别鉴定的必要性

雉科鸟类在世界上所有的鸟类中占有重要的一席之地，它们数量庞大，且与人类的关系极为密切。很多雉科鸟类已经跟人们的日常生活密切联系在一起。但是雉科比如原产于马来西亚的红原鸡经过人类长期的驯养已经演化成了家鸡，他

们的肉质和蛋为嫣然已经成为人们生活的必需品。此外，还有鹌鹑等一些鹑类的鸟，它们也已经逐步的被人类所驯化，所产的蛋可以为人们的生活提供蛋白质。在我国四川省和西藏自治区的一些地方，有一种神圣的鸟儿叫做“四川雉鹑”，数千年来它们和我们藏族人们生活在一起繁衍生息，与藏族同胞的生活已经密不可分。由此可见，雉科鸟类的动物已经成为了人类的朋友，保护雉科这些珍贵的鸟儿就是保护我们自己。但是我们发现上面提到的两种雉科鸟，鹌鹑和雉鹑，它们的雌雄成体的羽毛颜色非常接近，体太也很相似，因此很难仅从外表对它们进行辨别。尤其是在动物园或者保护区，当我们对一些雉科鸟儿进行保护性繁育时，我们会有选择性的增加雌性的个体，因此对雏鸟进行有效的性别鉴定是由必要的。因此，如何准确地进行性别鉴定和筛选无论对于我们人工饲养的还是野外保护的雉科鸟类来说都是有着重要的意义。

4.2 PCR鉴定方法在雉科鸟类性别鉴定中的重要作用

雉科鸟类的物种非常丰富，很多鸟为单形态鸟，即成体的雄性和雌性的外观形态几乎完全一样，加之他们的颜色异常的艳丽，因此很难用肉眼从外观直接分辨雌雄，这给野外观察以及人工配种鉴别带来了一定的困难。尤其是人工饲养场所如动物园、饲养场等在进行人工配种或者繁殖的时候，往往要筛选一定的优势雄性个体或者雌性个体作为种鸟，但是仅仅依靠肉眼的鉴别是不可靠的，因此其他的性别鉴定方法如外科手术，染色体，PCR等方法就具有更高的准确性。但是，外科手术以及染色体鉴定方法[6]多坏死非常耗时耗力的工作，而且这两种检测方法会对鸟儿身体造成伤害，比如染色体鉴定，通常会抽取鸟儿的血液，而外科手术更是会对鸟而的身体造成极大的创伤，对于活体的标本来说是一种极不合理的方法，往往会是鸟儿致残、致伤甚至失去生育能力。因此，这些方法已经逐

步被淘汰，取而代之的是一些更为简便有效的方法。PCR技术可以说是20世纪分子生物学最伟大的发明，它使得人类在体外进行DNA的复制成为了可能。到目前为止，这一项技术已经相当成熟，且全世界广泛使用。PCR鉴定动物的性别在上个世纪90年代已经实现，后来逐步发展到了鸟类的性别鉴定中来。这种具有以下突出的优点：第一，实验操作简便，耗时很短。PCR的操作通常在普通分子实验中就可以进行，所用的试剂在生物公司都可以买到，且价格非常低，每一个样本PCR的成本只有2-3元，所有的加样和结果检测工作只需要3-4个小时就可以顺利完；第二，灵敏度高，重复性好。PCR的灵敏度非常高，只需痕量的DNA就可以在体外完成复制，且PCR条件非常成熟，所选基因在长期的进化过程中比较保守，扩增比较稳定，在体外可以任意重复；第三，对样本的需求极少，可以减少损伤性取样。PCR所使用的DNA模板通常只有几十个纳克，甚至是非常痕量的DNA都可以作为扩展扩增的模板，比如说羽毛中的DNA 以及粪便中的DNA等，因此我们通常不需要对鸟儿进行抽血或者去组织，就可以完成性别的鉴定，这对于鸟儿的身体来说将伤害降到了最低。因此，借助PCR技术可以大大简化雉科鸟类的性别鉴定。

4.3 CHD基因在雉科鸟类性别鉴定中的优势

在鸟类性别鉴定的历史中，曾经也出现过很多的技术，比如RFLP（限制性酶切多态性）、ATP5A1基因等等[7]。但是由于这些基因或者方法不够稳定，因此在进行扩增的时候不能很好的区分雌雄个体，因此逐渐被人们舍弃。后来，人们就将目光转移到决定鸟类性别的ZW染色体上，并找到了这样一个可以很好区分雌雄个体的基因。Ellegren [8]首次从鸟类的W染色体上克隆到了CHD基因，它叫做染色体螺旋蛋白基因，它的功能是负责染色体的转录活动。CHD基因在

鸟类中有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，雄雄鸟中只有CHD-Z，而雌性鸟类中同时具有CHD-W和CHD-Z，且CHD-Z基因的长度要小于CHD-W。因此，利用一对CHD基因引物同时去扩增鸟类的CHD基因，那么在雄性鸟类中只会得到一个大小长度的基因片段，而在雌鸟中由于具有两个不同长度的拷贝，再通过电泳将不同长度的CHD基因区分开，这样就可以直观的观察到二者的差异。

在鸟类CHD基因发现至今短暂的十年里, CHD基因性别鉴定已经十分广泛的应用于在各种鸟类, 并且已经涉足于多项研究领域。从最初的对不同个体或不同种类的鸟类进行性别鉴定, 已经向着更加深入、更加细微的方向发展。由于鸟类后代(雏鸟)的性比是此种鸟的性比最重要的决定因素, 因此近些年, 通过CHD基因对鸟类后代的性比进行研究已经炙手可热, 许多学者围绕着各种可能影响鸟类后代的性比及分化因素进行了大量研究。当然, 目前CHD基因性别鉴定体系还不够完善, 有很多方面有待于进一步发展, 如还需另外开发一些目标片段、设计一些新的引物以适用于一些特殊物种等。

本实验我们利用已知的通用引物扩增了一种鸟类的CHD基因部分序列并测序，根据此序列我们自行设计了一个更短的引物对，扩增长度为465bp，较之前的通用引物，该引物对具有以下的特点：第一，该引物对扩增的PCR产物更短，只有465bp。在PCR扩增过程中，产物越小，扩增效率越高，这样就极大的提高了产物的浓度，同时也提高了鉴定的准确性。其次，该引物的退火温度较高，扩增的特异性较高。相比起之前的通用引物对而言，此引物对的退火温度更高。在之前的通用引物检测中，我们发现利用之前的通用引物对在扩增雉科鸟类的CHD基因时，出现了太多的非特异性条带，且很难通过提高温度去除，这给我们的电泳检测带来了一定的干扰。而新设计的引物对特异性高，在测试的十几个

个体中都没有出现非特异性的条带，DNA样本检测条带非常单一，清晰可辨。此外，CHD-W和CHD-Z这两条带的亮度都较之前的扩增有所提高，很容易区分。这些都充分说明我们新设计的引物对具有更好的特异性和更高的扩增效率。

本实验所鉴定的雉科鸟类的个体全部来自成都市动物园，且我们所鉴定的个体都是单形态鸟，雌雄个体的外观形态几乎一模一样，很难从外观来鉴定它们的性别。此前已有专业的饲养员通过其他途径对这些鸟进行了性别的鉴定，即在已知的情况下，我们利用自身设计的新引物对它们进行了分子水平的二次鉴定，其鉴定的结果完全和之前的鉴定结果一致。这也充分说明，我们的实验方案(引物)完全可以用作动物园鸟类性别鉴定的手段之一，其结果真实可靠。同时，我们也希望其他研究者也可以试图将这一方法推广到其他鸟类的鉴定之中，为其他鸟类的性别鉴定带来便捷。

4.4 雉科鸟类性别鉴定的意义

雉科鸟类是人类的朋友。它们是一类非常美丽和重要的鸟类，它们已经和人们的生活密不可分了，正是因为它们的存在我们的生活才会如此的丰富多彩！如果没有它们，我们生活中就没有提如此鲜美的肉质和蛋；如果没有它们，公园里和保护区里就没有了它们的美丽身影；如果没有了它们，我们的生态系统就会遭到其他害虫或者动物的破坏，我们的家园就不会如此安宁。有了性别鉴定的方法，我们的保育员们利用该技术可以进行有效的雉科鸟类繁殖，增加它们的数量，改善它们的品种，对于一些濒危的物种可以及时有效的进行保护，让它们又重新进入人们的视野。所以我们研究工作虽然很简单，但是对于雉科鸟类的保护有着重要的意义。

5 本实验创新点：

1. 雉科鸟类的观察通常采用肉眼进行，但是雉科鸟类颜色颜色非常鲜艳，且雌雄很难区分，我们在较远的距离之外，要很好的区分它们的性别是一件很困难的事情。因此，我们采用分子生物学的方法可以很快速准确判断鸟类的性别，比肉眼的观察要准确。

2. 我们鉴定来自动物园雉科鸟类性别，可以为动物园或者保护区保育员提供可靠的关于雉科鸟类配种、繁育方面的技术支持。成本较低，一般实验室都可以进行操作！

3. 我们在前人研究基础之上重新设计了用于扩增雉科鸟类CHD基因的引物，这一对引物比之前的要短，且更稳定，易于扩增和检测，且比之前其他的鉴定方法，比如RAPD等要更为准确和简单，省时省力！

参考文献：

[1] 刘铸，白素英，田秀华，2006，CHD基因与非胸鸟类性别鉴定，生物技术通

报，2006增刊，147-150

[2] Griffiths R, KornR. Gallusdomesticus. Gene, 1997, 197: 225-229.

[3] GriffithsR, TiwariB. Nature, 1995, 375: 454

[4] GriffithsR, DoubleMC, OrrK, et al MolecularEcology, 1998, 7: 1071-1075.

[5] Zhou X, Yang N, Yue B, Ran J, Li J. 2008. sex identification in Buff-throated

Partridge using PCR method. Sichuan Journal of Zoology 27(4): 645-647.

[6] 李刚，杨水云，周航，任建设，马清义，王万云，2003，鸟类性别鉴定技术研究进展，动物学杂志，38(5)：106-108.

[7] 包文斌，胡飞，徐琪，陈国宏.鸟类性别鉴定的分子生物学方法.中国畜牧兽医，34（10）：33-36。

[8] Ellegren H. First Gene on the Avian W Chromosome (CHD) Provides a Tag for Universal Sexing of Non-Ratite Birds. 1996 263(1377):1635-1641.

实验历程：