突变型低氧诱导因子1_加速骨缺损部位新血管生成的实验观察

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突变型低氧诱导因子1_加速骨缺损部位新血管生成的实验观察

第36卷第4期2 0 1 5年7月

西安交通大学学报(医学版)

Journal of Xi an Jiaotong University(Medical Sciences)

Vol.36 No.4

Jul.2015http://www.jdyxb.cn;http://yxxb.xjtu.edu.cn

◇基础研究◇

突变型低氧诱导因子1α加速骨缺损部位

新血管生成的实验观察

王 皓1,李 谌2,郜玉忠1

(辽宁医学院附属第一医院:1.骨关节二病区;2.生物样本库,辽宁锦州 121001)

摘要:目的 通过突变低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1,HIF1α)基因的3个氨基酸位点研究该基因在常氧条件下骨缺损区域对血管新生效应的影响。方法 定点突变HIF1α编码区(coding sequence,CDS)402、564和803位3个氨基酸后将基因重组入腺病毒pAdEasy-1系统并测定滴度,同理包装未突变组和空病毒组;以3种病毒液连同空白组共分4组进行后续实验(A组:含突变HIF1α基因病毒液,B组:含未突变HIF1α基因病毒液,C组:空病毒液,D组:空白组);将病毒液转染入兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)内,通过示踪因子人源化绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)观察病毒转染效率,检测各组转染细胞中HIF1α基因mRNA和蛋白表达情况;制作兔桡骨缺损动物模型,将含目的基因的病毒液按上述分组转染MSCs后作为种子细胞移植到多孔纳米磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷(apatite-wollastonite magnetic bioactive glass-ceramic,A-WMGC)载体中搭建人工组织工程骨架载体并植入体内,于术后8周处死各组动物,取植入区域组织做新血管生成检测。结果 CDS区第402、564和803位氨基酸均定点突变为丙氨酸;3种腺病毒重组体构建成功并鉴定完毕;A、B两组HIF1αmRNA表达量明显高于C、D两组,差异具有统计学意义(P<0.05),而A、B两组之间及C、D两组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);A组HIF1α蛋白表达量明显高于其他3组,差异具有统计学意义(P<0.05),而B、C、D 3组之间比较差异无统计学意义(P>0.05);A组转染到动物体内后可见明显成血管效果,其他3组未见缺损区域有血管新生。结论 ①3点突变后HIF1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达;②3点突变后HIF1α基因能够在体内局部形成有效的血管网络。

关键词:低氧诱导因子1α;基因突变;重组腺病毒载体;骨髓间充质干细胞;血管生成;骨缺损

中图分类号:R683.4 文献标志码:A

DOI:10.7652/jdyxb201504006

Mutants of hypoxia-inducible factor-1αaccelerate in vivo

angiogenesis in bone defect region

WANG Hao1,LI Chen2,GAO Yu-zhong1

(1.the Second Ward of Bone and Joint;2.Biobank,the First Affiliated

Hospital of Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,China)

ABSTRACT:Objective To investigate the functions of triple point-mutants of hypoxia-inducible factor 1α(HIF1α)in angiogenesis in bone defect region under normoxic conditions.Methods Triple point-mutations(the402,564 and 803 amino acids)in HIF1αcoding sequence(CDS)were induced.The triple mutant of HIF1α(402/564/803)was inserted into the adenovirus pAdEasy-1 system to complete viral packaging and titer measurements.The wild-type HIF1αgene and the empty adenovirus vector were packaged in the same way.For the in vitroexperiment,the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)were divided into four experimental groups:A,MSCs infected with viral solution containing mutant HIF1α;B,MSCs infected with viral solution containingwild-type HIF1α;C,MSCs infected with viral solution without any HIF1α;and D,MSCs without viral infection.The efficiency of infection was observed by the expression of human renilla reniformis green fluorescent protein(hrGFP).The expression levels of HIF1αmRNA and protein in infected cells in each experimental group weremeasured.For the in vivo experiment,the MSCs were divided into the same four groups and infected with the virussolutions from each group and cultured under normoxic conditions.At 72h after the infection,the MSCs were used

收稿日期:2014-10-23 修回日期:2015-02-03

基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(No.2014022010)

Supported by the Natural Science Foundation of Liaoning Science and Technology Committee(No.2014022010)

通讯作者:郜玉忠.E-mail:gaoyuzhong2014jz@126.com

优先出版:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150515.0957.007.html(2015-05-15)

 

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tu.edu.cnas seed cells and transplanted into Apatite-wollastonite magnetic bioactive glass-ceramic(AW MGC)vector toconstruct artificial tissue-engineering scaffolds,and then the scaffolds were implanted into the in vivo rabbit radialbone defect model.The animals from each group were sacrificed 8 weeks after the surgery 

and the tissues from theimplantation region were harvested for evaluation of angiog

enesis.Results The 402,564 and 803 amino acids inCDS area were point mutated into alanine;three types of recombinant adenovirus were successfully constructed,packaged and characterized.The expression levels of HIF1αmRNA were significantly 

higher in Group A and GroupB than in Group C and Group D(P<0.05).There was no significant difference between Group A and Group Bgroup or between Group C and Group D(P>0.05).The HIF1αprotein expression in Group 

A was significantlyhigher than that in the other three groups(P<0.05);however,there was no significant difference among 

groupsB,C and D(P>0.05).There was prominent angiogenesis in bone defect region in Group 

A,but not in the otherthree groups.Conclusion ①Triple point-mutants of HIF1αefficiently 

expressed functional proteins under normoxicconditions.②Triple point-mutants of HIF1αeffectively 

promoted in vivo angiogenesis in bone defect region.KEY WORDS:hypoxia-inducible factor 1α;mutagenesis;recombinant adenovirus vector;bone marrow mesenchy

-mal stem cell;angiogenesis;bone defect reg

ion 充足的血供是骨缺损再生的必要条件[1-4

],

只有尽早地在骨缺损局部构建有效的血管网络,才能为成

骨分化活动提供营养支持和代谢保证。血管新生过

程受一系列生长因子调节[

5-

7],这些生长因子相互协调及补充。人们在探索多基因治疗的同时,正在寻求能调控多基因表达的因子,以诱导生理功能完整的血管新生。低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor1α

,HIF1α)在促血管新生中的作用日益显著,被认为是最具有临床应用前景的基因[

8-

12]。HIF1作为促进血管内皮生长因子(vascular 

en-dothelial g

rowth factor,VEGF)等刺激血管形成的上游基因,可以促进VEGF等基因及其受体的表达,在维持成骨微环境方面有更广泛的生理作用。但HIF1α仅能在低氧条件下表达并积累,其CDS区中氧依赖性降解结构域(oxygen dependent degradationdomain,ODDD)

中的第402、564位脯氨酸不能被羟化是HIF1α很快被降解(

数分钟内)[13-

16]的主要原因。同时LANDO等[17]

报道HIF1α的转录活性由

于其CDS区第803位天冬酰胺的作用而减低。这提

示第402、564位脯氨酸和第803位天冬酰胺都是HIF1α的重要位点。为了能够发挥HIF1α在常氧条件下的最强转录活性,本研究将同时突变第402、564和第803位氨基酸,并检测该基因mRNA、蛋白表达情况及在骨缺损区域促血管新生情况。1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 纯种新西兰大白兔3

3只,月龄3~4个月,体质量2.0~2.8kg,雌雄不限,辽宁医学院实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(辽)2003-0007,实验动物操作过程遵循实验动物福利要求并获辽宁医学院实验动物伦理委员会批

准。含人HIF1α基因供体质粒(

美国Clontech公司),腺病毒pAdEasy-1系统、病毒滴度检测试剂盒(美国Stratagene公司),DNA连接试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、pMD19-T Simple Vector、Marker、RT-PCR试剂盒、限制性内切酶(

日本T

aKaRa公司),PmeⅠ、PacⅠ(美国NEB公司),超纯质粒提取试剂盒(德国QIAGEN公司),Lipo-fectamine 2000、OPTI-MEM、Trizol(美国Invitrog

en公司),兔抗人HIF1α单克隆抗体、山羊抗兔二抗、β-actin(美国Santa Cruz公司),DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司),HEK293A细胞,DH5α感受态细胞,

A-W MGC生物载体及其他常规试剂(辽宁医学院附属第一医院中心实验室提供)。1.2 引物序列 引物设计、

合成,基因测序(日本TaKaRa公司):HIF1α基因定点突变区引物6条;RT-PCR反应引物4条(

表1)。表1 PCR引物序列

Tab.1 PCR primers sequence名称序列(5′~3

′)402-F

1GTGAACCCATTCCTCACCCATC402-R1TCTCCAGCGGCTGCGGCCAGCAAAG564-F2CTGGCCGCAGCCGCTGGAGACAC564-R2GGATATAGGCAGCTAACATCTCC803-F3GATGTTAGCTGCCTATATCCCAATG803-R

3TTCACCCTGCAGTAGGTTTCTGCTGCCT-

TGTATAGGAGCAGCAACTTCACAATC

HIF1α-F GAAACCACCTATGACCTGCHIF1α

-R GTCGTGCTGAATAATACCACTCβ

-actin-F GGGACCTGACTGACTACCTCβ

-actin-R TCATACTCCTGCTTGCTGAT1.3 HIF1α基因定点突变、

腺病毒载体构建及转染 ①基因定点突变。利用突变引物以含人H

IF1α基因供体质粒为模板进行第1次PCR扩增(

反应条件:654

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tu.edu.cn98℃10s,55℃10s,72℃30s,30个循环;7

2℃10min,1个循环)。回收PCR产物作为模板进行第2次PCR扩增(反应条件:98℃10s,55℃10s,72℃1min,共30个循环;72℃10min,1个循环)。回收约1 800bp产物片段后利用SalⅠ/PstⅠ进行双酶切,经乙醇沉淀纯化后与pMD19-T Simple Vector连接,连接产物转化DH5α后在LB固体培养基上划平板进行细菌培养16h,筛选阳性克隆进行HIF1α突变基因测序鉴定,完成突变体克隆(突变后HIF1α基

因写作HIF1αmu

。②腺病毒载体的构建及包装。以突变克隆体和pAdEasy

-1中pShuttle载体为底物建立两个双酶切反应体系,回收2.5kb的HIF1αmu

片段和8.9kb的pShuttle载体片段,连接重组后筛选阳性克隆进行测序鉴定,构建成腺病毒穿梭重组体

(p

Shuttle-HIF1αmu

-IRES-hrGFP-1);上述产物经PmeⅠ酶切后与pAdEasy

-1中BJ5183感受态细胞混合于电穿孔仪中以200Ω、2.5kV、25μF为条件电

击1次,构建成pAd-HIF1αmu-

IRES-hrGFP-1重组体;超纯提取该重组体后经PacⅠ酶切提纯大片段,通过Lipofectamine 2000转染HEK293A细胞7d进行病毒包装,利用示踪因子hrGFP观察转染效果,

反复冻融3次获得Ad-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1病毒液,检测病毒滴度后-80℃保存备用。同理分别包

装Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1和Ad-IRES-hrGFP-1。③重组腺病毒转染MS

Cs。取新西兰大白兔1只,麻醉后常规抽取右侧胫骨平台骨髓液,分离纯化培养兔MS

Cs并传至第3代,将上述3种病毒液分别以最佳感染复数(multiplicity 

of infection,MOI)=100转染,72h后在倒置荧光显微镜下观察转染效果。1.4 制作骨缺损实验动物模型 ①生物骨架载体术前

处理。将长1.5cm,直径0.5cm的A-W MGC生物活性载体消毒及表面处理后干燥备用。将病毒液转染MSCs

后72h制成2×107/mL悬液,按5×10

6/侧将细胞移植入A-W MGC内以37℃、50mL/L CO2浓度旋转培养

8h,使得细胞在载体内部空隙内充分贴壁均匀。②骨缺损动物模型制作。将新西兰大白兔麻醉后取右侧前臂桡骨中段咬除约1.5cm形成缺损,植入前期处理后的A-W MGC载体,

断端吻合,术后肌注抗生素7d,观察动物日常活动及伤口愈合情况,8周后取材。1.5 实验分组 ①细胞内实验分组。A组:转染突变HIF1α病毒液;B组:转染未突变HIF1α病毒液;C组:转染空病毒液;D组:

不转染任何病毒(空白组)。4组MSCs细胞均常规培养72h。②体内实验分组。将32只新西兰大白兔随机分为4组,每组8只;分别将上述ABCD 

4组细胞移植入A-W MGC生物活性载体后制作4组骨缺损动物模型。

1.6 检测指标 ①RT-PCR检测各组细胞中HIF1α

基因mRNA的表达情况。利用Trizol分别提取4组细胞的总RNA,紫外分光光度计检测A260/A280,其比值均在1.8~2.0之间。配制反应液后进行RT-PCR反应(反应条件:5

0℃30min,94℃2min,1个循环;94℃30s,60℃30s,72℃1min,30个循环)。反应结束后取反应液5μL直接进行10g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统分析各条带吸光度值(A),重复实验3次,分别计算相对A值。②Western blot检测各组细胞中HIF1α基因蛋白的表达情况。通过

细胞蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白,利用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度;配制50g/L浓缩胶与80g/L分离胶,60V×30min,150V×1h进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后取下分离胶洗涤3次放入转膜仪,以100mA×30min进行转膜,转膜后孵育一抗(1∶1 

500),4℃摇摆过夜,洗膜后继续孵育二抗及显影液,室温避光孵育30min,洗脱液洗涤3次终止显色反应,凝胶成像系统分析膜上目的条带与内参照A值。重复实验3次,计算相对A值。③墨汁灌注透

明切片血管形态学观察手术区血管新生情况。术后8周结扎近端肱动脉及静脉,

离断肱静脉,向远端肱动脉插管,用肝素生理盐水冲洗血管床残余血液后再用浓度为40g/L的甲醛、50g/L墨汁灌入肱动脉追踪血管分布情况,直至从肱静脉端流出大量的浓黑墨汁为止。将标本低温放置2h后取移植骨及缺损区两端正常的骨组织制作切片,观察血管分布情况。选载体中心部位及距离其上下0.5cm处横切片做血管面积定量分析,用图像剖析仪将整个视野划分为1 

024个统计场面积(单位U),计算出视野中被灌注血管所占的统计场面积。

1.7 统计学分析 采用SPSS 18.0for 

Windows软件包对所得结果进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(珔x±s)

表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组之间比较采用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。2 结 果

2.1 HIF1α基因测序及腺病毒载体的鉴定结果 通过基因测序显示,HIF1α基因CDS区第402位脯氨酸由CCA突变成GCA(丙氨酸),第564位脯氨酸由C

CC突变成GCC(丙氨酸),第803位天冬酰胺由ATT突变成AGC丙氨酸(说明:第803位天冬酰胺测序的是反义链,所以天冬酰胺正义链应为AAT,而丙氨酸正义链应为GCT)(图1)。凝胶电泳成像显示,Ad-

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tu.edu.cnHIF1αmu-IRES-hrGFP-1及Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1经PacⅠ酶切后均出现30kb和3kb两个条带,

提示腺病毒载体构建成功(图2

。图1 HIF1α基因C

DS区第402、564、803位氨基酸突变前后测序图Fig.1The DNA seq

uence before and after mutation of the 402,564,and 803amino acids in CDS area of HIF1αgeneA:第402位脯氨酸突变前(CCA);B:第402位脯氨酸突变为丙氨酸(GCA);C:第564位脯氨酸突变前(CCC);D:第564位脯氨酸突变为丙氨酸(G

CC);E:第803位天冬酰胺突变前(ATT);F:第803位天冬酰胺突变为丙氨酸(AGC)

。图2 HIF1α腺病毒载体酶切电泳鉴定图

Fig.2Electrophoretic map 

of adenovirus vectors digested byP

acⅠ1:Marker;2:突变后HIF1α腺病毒载体(Ad-HIF1αmu-IRES-hrGFP-

1)经PacⅠ酶切后电泳条带;3:未突变HIF1α腺病毒载体(Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-

1)经PacⅠ酶切后电泳条带。2.2 腺病毒包装结果 经3种病毒重组体转染的HE

K293A细胞在荧光显微镜下均观察到有大量绿色荧光蛋白表达(图3),同时均出现相似的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE):细胞触角回收、肿胀变圆,一部分细胞脱落,悬浮于视野中(图4

);病毒滴度检测结果依次为1.6×108pfu/mL、1.3×108

pfu/mL和2.1×108

fu/mL。2.3 病毒转染MSCs的表达结果 3种包装成功的病毒液在荧光显微镜下均观察到较强绿色荧光蛋白表达并且表达绿色荧光蛋白的MSCs细胞也较多,

转染效率较高;而未转染任何病毒液的MSCs在荧光显微镜下并未显现出任何荧光效应(图5

)。2.4 RT-PCR结果显示 A、B、C、D 

4组细胞内HIF1αmRNA表达相对A值分别为0.91±0.12、0.98±0.10、0.05±0.02、0.04±0.01;其中,A、B两

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tu.edu.cn组之间差异无统计学意义(P>0.05);C、D两组之间

差异也无统计学意义(P>0.05);而A、B 2组细胞内HIF1αmRNA表达量均明显高于C、D 

2组,存在统计学差异(P<0.05,

图6)

。图3 腺病毒载体转染HEK293A细胞后绿色荧光分布图

Fig.3The green fluorescence exp

ression of adenovirus vector-transfected HEK293Acells(×40)A:HIF1α突变后病毒转染HEK293A细胞后绿色荧光;B:未突变病毒载体转染HEK293A细胞后绿色荧光;C:空病毒载体转染HEK293A细胞后绿色荧光

图4 腺病毒载体转染HEK293A细胞后病毒包装图

Fig.4Virus packaging 

in adenovirus vector-transfected HEK293Acells(×40)A:HIF1α突变后腺病毒载体转染HEK293A细胞进行包装时出现CPE现象;B:未突变病毒载体转染HEK293A细胞进行包装时出现CPE现象;C:

空病毒载体转染HEK293A细胞进行包装时出现的CPE现象

。图5 转染病毒液的MSCs绿色荧光分布图

Fig.5The expression of g

reen fluorescence in infected MSCs(×200)A:HIF1α突变后病毒液转染MSCs;B:未突变病毒液转染MSCs;C:空病毒液转染MSCs;D:未转染任何病毒液的MSCs在荧光显微镜下未观察到任何荧光表达。

2.5 Western blot结果 A、B、C、D 

4组细胞内HIF1α蛋白表达相对A值分别为0.86±0.11、0.07±0.02、0.05±0.02、0.06±0.03;其中B、C、D 3组之间差异无统计学意义(P>0.05);A组蛋白表达相对A值明显高于其他3组,存在统计学差异(P<0.05,图7)。2.6 墨汁灌注透明切片血管形态学观察血管新生情况 术后8周行墨汁灌注透明切片血管形态学观察4组动物缺损区域新血管生成情况,

可见A组不仅有新生血管形成,而且血管管径良好,内径完整,相互间

桥接效果明显,构建成有效血管网络,均匀分布于体内骨缺损区域;而B、C、D 3组在骨折区域未见血管正常结构,无明显的血管网络生成(图8);血管面积定量分析得出A、B、C、D 4组被灌注血管所占统计场面积依次为297±27.61、2.26±0.11、1.94±0.06、3.09±0.14;B、C、D 3组之间无显著性差异(P>0.05);A组新生血管面积明显高于其他3组,具有统计学差异(P<0.05

)。9

 

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tu.edu.c

n图6 各组细胞HIF1α基因mRNA表达的检测情况Fig.6The expression of HIF1αmRNA in each group

A:HIF1α突变后病毒液转染MSCs;B:未突变病毒液转染MSCs;C:空病毒液转染MSCs;D:

未转染任何病毒液的MSCs

。图7 各组细胞HIF1α基因蛋白表达的检测情况Fig.7HIF1αprotein expression in each group

A:HIF1α突变后病毒液转染MSCs;B:未突变病毒液转染MSCs;C:空病毒液转染MSCs;D:

未转染任何病毒液的MSCs

。图8 HIF1α基因体内成血管检测墨汁灌注图

Fig.8The in vivo angiog

enesis effects of HIF1αgenesA:HIF1α突变后病毒液转染MSCs移植入体内骨缺损区后,8周经墨汁灌注透明切片血管形态学观察到成血管情况;B:未突变病毒液转染MSCs移植入体内骨缺损区后,8周经墨汁灌注透明切片血管形态学未观察到成血管情况;C:空白病毒液转染MSCs移植入体内骨缺损区后,8周经墨汁灌注透明切片血管形态学未观察到成血管情况;D:未转染任何病毒液的MSCs移植入体内骨缺损区后,8周经墨汁灌注透明切片血管形态学未观察到成血管情况。

3 讨 论

3.1 HIF1α基因3点突变的意义 研究发现,HIF1α对于细胞和组织抗低氧,提高其在缺血环境下的生存能力及促进血管再生,微血管系统的形成方面有及其

重要的意义[1

8]。本实验在不改变HIF1α其他氨基酸

结构的基础上仅将ODDD中的3个关键氨基酸位点进

行定点突变为丙氨酸,最大程度的保留了组成HIF1α

基因的氨基酸的功能,不仅使得HIF1α在常氧条件下能够不被降解而稳定表达,又增强了其转录活性,提高了单位剂量内HIF1α蛋白的表达量。

有报道表明[19]

,不含ODDD的HIF1α基因转染

细胞后在任何氧浓度下均可表达HIF1α活性蛋白;

而在体实验表明能诱导新的成熟血管床生成,并且该重组HIF1α诱导的新生血管床稳定,转基因鼠的皮肤不出现水肿、炎症和血管渗漏且没有曲折和囊性血管形成,并在长达18个月观察期中未发现溃疡、血管瘤或皮肤原发肿瘤发生。但是,在通常情况下,大片

段的基因缺失(如ODDD的缺失)可能引起蛋白某些还没被发现的功能丧失,显然发生定点突变的HIF1α所表达的蛋白从结构上和正常HIF1α蛋白要

接近得多,在改变蛋白的某些特性,如易降解和易失活的同时,更有利于保留蛋白的生理功能。另有报道

称[1

5],ODDD中的第402或564位脯氨酸单一突变

也可以在任何氧浓度条件下表达该蛋白的活性。但是,一个降解羟基化位点的保留或多或少会对该基因的常氧表达起到一个抑制的作用,不如两者同时突变效果更加完善。因此,本研究中的3点突变法可能是该基因重组的较好选择。

3.2 常氧条件下HIF1αmRNA及蛋白表达结果的意义 通过对细胞内HIF1α基因mRNA和蛋白的检测发现,尽管B组细胞中HIF1α基因mRNA表达明显增加,但是蛋白检测并无任何发现,这提示了B组尽管可能引起HIF1α蛋白表达的增加,但是增加的蛋白由于其正常结构中第402和564位脯氨酸的存在,仍然被降解而不能在细胞内发生蓄积,可以推

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tu.edu.cn测出野生型HIF1α蛋白在常氧条件下是完全降解

的,因而不能发挥它的任何功能。而C、D 2组由于未转染HIF1α基因,

所以并未检测出mRNA与蛋白的表达。与B组不同的是,A组在用Western blot方法检测时能在常氧条件下检测到细胞内含有高水平的HIF1α蛋白,说明这种突变的表达载体在常氧条件下在MSCs内能够高效表达并且蛋白能在细胞内蓄积,提示降解对HIF1α表达的影响主要发生在转录后的翻译水平,即蛋白水平;而突变后HIF1α在常氧条件下较之野生型更加稳定、表达量大而不被降解。3.3 在体实验血管新生的意义 在体实验结果表明,HIF1α基因3点突变后在体内更加复杂的生物环境下仍然能够大量聚集且表达高效蛋白,在骨缺损区域能够建立起有效的血管网络,并且新生成的血管管径完好,内径完整,能够给成骨以营养支持,促进骨折区的成骨进程;而未经突变的HIF1α在体内复杂的条件下并未形成有效的血管网络,也不能使之稳定存在,对于成骨并无任何良好效果。通过在体实验证实HIF1α3点突变后不光在体外的单一细胞环境下能够高效表达,而且将其移植入生理环境比细胞复杂百倍的动物体内后仍然可以继续高效表达并形成了新的血管网络,并且尚未发现受到体内环境中任何不可预知因素的影响,可以认为突变体在移植骨内的成血管效应是显著的。结果提示HIF1α基因3点突变体很可能为骨缺损疾病的血管新生治疗提供一种新的方向。

体内的血管新生过程中是一个极其复杂的生理过程,3点突变HIF1α基因的导入对于正常组织来说是一种非正常途径,虽然促进了新血管网络的生成,但对于参与血管新生过程中的其他因子本身的影响是未知的,并且突变后基因对于HIF1α本身其他功能的影响以及3种突变后的丙氨酸分别对HIF1α基因促血管新生功能的具体体现,都需要我们进一步进行实验研究。同时,由于我们的实验条件有限,并没有对HIF1α-VEGF促血管新生信号转导途径做进一步的实时监测与探索,对于其在体内具体的发生机制我们并不是十分的了解,仅仅通过最后得到的数据推测是局限的,还需要我们在后期的工作中继续完成。

参考文献:

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2532.(编辑 韩维栋)

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肿瘤血管生成与血管生成抑制因子的研究进展

肿瘤血管生成与血管生成抑制因子的研究进展 摘要:肿瘤血管生成在肿瘤的生长和转移中起着重要的作用,是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的先决条件。肿瘤的血管生成是一个复杂的生物学过程,包括血管内皮细胞的增殖、出芽和迁移等。这一过程中有众多肿瘤血管生成因子和抑制因子参与调节和激活血管生成的开关。因此, 研究肿瘤血管生成相关分子在肿瘤血管生成中的作用机制, 及其对肿瘤血管生成的调控,形成一种抗血管生成疗法,来达到控制肿瘤血管生长和转移的目的, 对肿瘤的治疗具有重要意义。 关键词:肿瘤血管生成;血管生成因子;血管生成抑制因子;血管生成开关恶性肿瘤的生长和转移依赖于血管生成。当肿瘤体积超过2-3mm3后局部缺血缺氧[ 1] , 需要产生新的毛细血管以维持肿瘤的生长, 丰富的血管可向肿瘤提供足够的营养物质, 清除各种降解产物, 肿瘤细胞亦经血管进入血液循环发生血行转移, 否则肿瘤将发生退行性坏死[ 2].新血管的形成发展取决于血管生成生长因子和血管生成抑制因子之间的动态平衡,当血管生长因子与血管抑制因子达到平衡时,血管生成不被启动; 当此平衡趋向于血管生成时,血管开关被开启,新生血管开始生成。在正常组织中, 由于缺少血管生成生长因子或生长因子被高水平的血管生成抑制因子严格控制,血管生成的开关处于关闭状态;但在肿瘤组织中, 生长因子过度表达, 抑制因子表达过低, 改变了这个平衡, 开启了肿瘤血管生成的表型, 导致新血管的生长。因此,有学者认为肿瘤血管形成的始动因素是血管生长因子和血管抑制因子失衡,并且这种失衡会持续出现在肿瘤生长过程中,并提出了通过抑制血管生长因子信号通路,来抑制肿瘤生长和转移。[3]1.肿瘤血管生成开关机制 实验和临床数据表明,大多数人类肿瘤生成早期不诱导血管生成和并存在于原位,在无血供数月至数年后,肿瘤中的一些细胞向血管生成的表型转变,这种现象称为血管生成开关。这一机制的分子基础可能是血管生成抑制剂的减少以及血管生成因子产量增加所致[4]。因此,血管生成表型的开关是由血管生成因子与血管生成抑制因子的动态变化来调节。

肿瘤细胞诱导血管生成模型具体步骤及详细说明

肿瘤细胞诱导血管生成模型具体步骤及详细说明 肿瘤血管生成是指肿瘤微环境诱导的在原有血管基础上生成以毛细血管为主的血管系统,并在肿瘤组织内建立血液循环的过程。肿瘤血管生成与肿瘤微环境密切相关,受多种促血管生成因子和(或)血管生成抑制因子的调节。 1、鸡胚准备和接种组织:选择北京白鸡种蛋,洗净,用l:1000苯扎溴铵(新洁尔灭)液浸泡3分钟,置37.8土0.5℃培养箱中孵育。鸡胚发育第7天,蛋壳消毒后,标记制作2cmX3cm左右观察窗。接种组织视研究目的而定,一定要在接种当日取材,充分清洗除去血污和粘液,再剪成1——2mm 组织小块。 2、组织接种:在制备鸡胚观察窗的次日,即鸡胚发育第8天进行组织接种。每个鸡胚可接种5—7个组织小块于接种部位CAM表面,再用透明胶纸封好,继续孵育。 3、接种组织的收获与观察:组织接种后每12小时观察一次,到组织接种第11天(鸡胚发育第18天)收获接种组织,取出鸡胚,置接种组织连同周围的CAM于解剖显微镜下观察,并用10%甲醛固定保存,部分组织可作石蜡切片,用作血管生成研究的免疫组化染色等。 4、CAM的血管生成表现:组织接种24小时后,CAM血管开始向接种组织生长,随培养时间的延长,血管数目及直径均明显增加;第2天,新细小血管直接趋向组织;第3天,新生血管形成以接种组织为中心,10——20条放射状

血管网;尔后,CAM血管继续明显增加。非接种部位与接种部位比较,CAM 血管数目少,大血管与小血管呈脉样均匀分布;而接种部位的CAM血管在接种组织周围弥散样增加,以组织为中心向周围呈放射状分布,在首先与组织发生联系的区域CAM血管更多。第4天,可见新生细小CAM血管生长形成中、粗血管,并在中、粗血管继续分支出细小血管,形成新的血管网。CAM血管管腔结构清晰,可区别动、静脉。 注意事项 该类体外实验研究,有很多人为因素影响,不能代表体内生理反应,因为内皮细胞在生长因子存在的条件下培养了很长一段时间,已被激活。因此,有必要建立一类与体内生理反应有关的血管生成实验方法,尤其是与人类血管生成有关的血管生成实验。 CAM血管生成模型用于血管生成的研究,可取得两方面结果: ①检测评价接种物刺激CAM血管增生的血管生成作用,用于分析研究血管生成促进因子、抑制因子的活性和作用的检测,如肿瘤血管生成的研究等; ②对接种物,如肿瘤组织、自身的血管生成进行研究,用于分析不同组织的血管生成活性和作用,如肿瘤组织有引发新生血管生成的作用。

肺癌血管生成以及抗血管生成治疗(一)

肺癌血管生成以及抗血管生成治疗(一) 【摘要】肺癌与其它实体瘤一样,其发生、发展和转移均依赖于血管生成,当肿瘤直径达到一定大小时,就会启动“血管生成开关”,促进新的血管生成,以保证肿瘤生长的血供需要。肺癌血管生成是一个极其复杂的过程,受多种正性和负性血管生成因子的调控。因此,抑制血管生成过程中关键步骤阻断肿瘤血管生成,从而切断肿瘤的营养来源和迁移通道,已成为近年来癌症治疗的新策略。本文就近年来此领域的最新研究进展做一综述。 【关键词】肺癌血管生成抗血管生成 肺癌(Lungcancer)是最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的生命和健康,它已经成为全世界癌症死亡的最主要原因之一。1971年,Folkman等提出了肿瘤生长依赖于血管生成的假说,他认为一些来源于肿瘤细胞的化学信号可以通过打开“血管生成开关”而使肿瘤从静止期转换到快速生长期。静止期的肿瘤没有血管生成,肿瘤直径被限制在大约0.2mm-2mm,如果超过这一时期,肿瘤细胞就可以作用于周围的血管,引起血管扩张、扭曲、通透性增加,从而引起血管的发芽。许多研究都表明血管生成对肺癌的发生起着非常关键的作用,而且癌前病变或者肺癌早期也存在微血管密度的增加1],后者是非小细胞肺癌术后预后非常重要的一个指标,因此针对血管生成治疗肺癌很可能成为一种非常有效的方法。 一肺癌血管生成调控 1.VEGF血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)家族是一个以二硫键或非共价键连接的同源二聚体的糖蛋白,目前所知的VEGF家族成员包括:VEGF-A(VEGF),VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E和胎盘生长因子(PIGF)。其中VEGF被证明是内皮细胞特有的一种生长因子,在血管生成中起到非常重要的作用2]。VEGF为低氧诱导的生长因子,分子质量为34~46Ku,由于其mRNA拼接不同,其有五种形式:VEGF121,VEGF145,VEGF165,VEGF183,VEGF189,VEGF206,其中以VEGF165较为常见,而且生物学活性最强。VEGF和其两个高亲和力受体VEGFR-1或者Flt-1(Fms-liketyrosinekinase),及VEGFR-2或者Flk-1(Fetalliverkinase)/KDR(kinaseinsertdomain-containingreceptor)结合,结合以后其受体通过自身二聚化、磷酸化激活而介导信号转导。VEGF可以使血管床的通透性增加,促进内皮细胞分裂、增殖、迁移和运动,刺激新生毛细血管生成,协助肿瘤细胞进入脉管系统,促进肿瘤侵袭转移。 2.EGFR表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是ErbB家族成员之一,分子量为170kDa,是一种跨膜糖蛋白,由细胞外区、跨膜区和细胞内区构成。EGFR通过细胞外区结合特异性的配体诸如EGF、TGF-α等而被激活,配体与EGFR结合导致细胞内区的自动磷酸化,以及细胞内酪氨酸激酶活性的激活。酪氨酸激酶磷酸化常伴随下游信号传导蛋白分子的激活,介导下游不同信号通路,比如ras–raf–MAPK,STAT,PI3K–Akt等通路的激活,从而引起肿瘤细胞的增殖、扩散转移及凋亡的抑制。 3.蛋白水解酶与血管生成和肿瘤生物学行为有关的蛋白水解酶主要有基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)、纤维蛋白溶酶原激活物(plasminogenactivator,PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetypeplasminogenactivator,uPA)和组织金属蛋白酶抑制物(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP)等。MMP家族成员众多,但以间质胶原酶(MMP1)、明胶酶A(MMP2)、基质分解素–1(MMP3)和明胶酶B(MMP9)最为常见。MMP参与细胞外基质的降解,促使内皮细胞的迁移,血管生成,并在肿瘤的侵袭性生长和转移方面,发挥了至关重要的作用3]。纤维蛋白溶酶原激活物除与MMP的作用基本一致外,尚有促进VEGF、bFGF和TGFβ的血管生成调节作用。TIMP能促进细胞增殖,但对血管内皮细胞的迁移和新生血管的生成有抑制作用。 4.COX-2环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素和血栓戊烷的关键酶,它包括两种异构体COX-1和COX-2。COX-1在所有的细胞内几乎都持续表达,并且在许

血管内皮因子综述

血管内皮生长因子与肿瘤治疗的研究进展 【摘要】肿瘤生长和转移依赖于血管生成,肿瘤血管生成是受多种细胞因子、生长因子及其受体调控,其中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)被认为是最关键的调控因子, 以VEGF及其受体作用途径中的任一环节为靶点,阻断VEGF对肿瘤血管的作用,都可以达到遏制肿瘤生长和转移的目的。VEGF靶向抗肿瘤血管生成成为抗肿瘤的新策略。 【关键词】VEGF 肿瘤靶向治疗 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),也叫做血管通透因子(vascular permeability factor,VPF),在正常胚胎发育时有广泛的表达,但正常成年者的组织中呈低水平表达,在肿瘤等病理情况下其表达异常升高。VEGF是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂因子,通过与其特异性受体(VEGFR)结合,引起一系列的信号转导,释放多种细胞因子与生长因子,刺激血管内皮细胞增殖和迁移,促进新生血管生成,在肿瘤的生长和转移中起重要作用。 1.VEGF生物学功能 VEGF的功能包括:①诱导内皮细胞钙浓度短暂升高、形态改变、分裂及运动,影响内皮细胞基因表达,加快基底膜降解,从而发挥促血管生成功能。②增加血管通透性,使血浆蛋白外渗,形成血管化纤维蛋白基质,为内皮细胞迁移形成网架。血管内物质外漏也为肿瘤转移提供基质,这对于肿瘤发展和转移可能比促内皮细胞增生更重要。另外,肿瘤细胞分泌的VEGF弥散作用于肿瘤周围组织的毛细血管,使其通透性增加造成瘤周水肿。③改变内皮细胞基因表达,诱导其合成大量蛋白水解酶,加速血管构建。④抑制宿主抗原呈递细胞成熟,使肿瘤细胞得以逃避免疫监视。⑤诱导血管内皮细胞bcl-2基因表达,提高诸如放射损伤细胞、血管内皮细胞抗凋亡的能力。 2.VEGF促进肿瘤生长、侵袭、转移的机制 肿瘤的侵袭、转移涉及到多个步骤:包括在局部生长到一定大小后瘤细胞从原发灶脱落,细胞外基质和基底膜的降解,瘤细胞进入血循环后逃脱宿主的免疫监控而存活下来, 瘤细胞达远处组织器官后粘附, 继而新生血管形成, 最后继发成瘤。VEGF几乎参与了此过程中的各个步骤,而不仅仅只作为促血管生成因子和血管通透性因子。 2.1 VEGF通过对内皮细胞的增殖、迁移、粘附的调节而促进新生血管的形成。 2.2 肿瘤细胞分泌的VEGF通过自分泌机制与瘤细胞上的VEGFR-2(KDR)结合,调控下游基因的表达而促进瘤细胞的生长、侵袭、转移。 2.3 VEGF通过抑制树突细胞的分化、成熟,减少树突细胞的生成从而降低宿主免疫功能。3.VEGF肿瘤治疗中的应用 3.1 基因治疗 3.1.1 反义寡核苷酸 反义寡核苷酸可抑制VEGF基因水平的分泌,也可特异性降低细胞中VEGFR mRNA水平。高渝等利用超声微泡介导VEGF反义寡核苷酸转染作用于人膀胱癌裸鼠移植瘤模型,

血管生成(Angiogenesis)信号通路图

本实验技术来源于SciMall科学在线 血管生成(Angiogenesis)信号通路图 血管生成是通过人体中存在的诸多互补和复杂的信号途径调节的.血管内皮生长因子(VEGF)-血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管生成素(Ang)-Tie2轴和Dll4-Notch这3个复杂的、相辅相成的信号传导通路可在调节血管生成中发挥重要作用. VEGF与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合后,直接刺激血管内皮细胞增殖,并诱导其迁移和形成官腔样结构;同时还可增加微血管通透性,引起血浆蛋白(主要是纤维蛋白原)外渗,并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用,是关键的血管形成刺激因子。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。TNF-α是一类具有血管活性的细胞因子,可诱导异位子宫内膜炎性细胞因子MCP-1,IL-6和IL-8等的释放,促进异位内膜及基质细胞增殖及炎性细胞浸润,新生血管形成,组织粘连,从而形成异位病灶。 (来源:Scimall科学在线) 本信号转导涉及的信号分子主要包括: HIF1α,PHDs,HIF1β,PI3K,Akt,mTOR,S6K,4E-BP1,eIF4E1,elF4E1,Ras,MEK1,MEK2,Erk1,Erk2,MNK,CBP,P300,TCEB1,TCEB2,Rbx1,Cul2,VHL,MMP,Cox2,PAI-1,VEGF,PDGFR-β,VEGFR2,Tie2,FGFR,IGFR,TGFα-R,SLIT,ROBO,Src,FAK,p38,MAPK,Smad2,Smad3,PLCγ,NOS等。 点击图中信号分子,自动寻找相关试剂

赤魟软骨血管生成抑制因子的制备【开题报告】

开题报告 药学 赤魟软骨血管生成抑制因子的制备 一、综述本课题国内外研究动态,说明选题的依据和意义 作为拥有1.8万公里海岸线的国家,我国的渔业资源非常丰富,赤魟就是这丰富资源中的一种。 魟鱼[1] (Ray)俗称鯆鱼,草帽鱼,蒲扇鱼,黄貂鱼。英文名:Red stingray。它属暖温类底层鱼,属于脊椎动物门Verterata,软骨鱼纲Chondrichthyes,板鳃亚纲Elasmobranchii,鳐目(或魟目)Rajiformes,魟科Dasyatidae和燕魟科Myliobatidae。全世界共有六个科158种。赤魟主要分布于我们南海和东海,长江口咸谈水中亦有分布。浙江沿海拥有丰富的海洋资源,其中以赤魟(Dasyatis akajei)资源最为丰富。 魟软骨味尚佳,皮厚实,无血有光泽,含丰富的胶质,水发后烹制成“大扒鱼皮”,味道鲜美,是宴席上的珍品。此外,作为药用,其肉性味甘、咸平,无毒,具有健脾补气、滋补强身之功效。用其熬油,主治小儿疳积。尾毒的毒液是一种氨基酸和多肽类的蛋白质,其药性咸、寒,有小毒,对于中枢神经和心脏具有一定的效应,有清热消炎、化结、除癥之功效。尾刺研末入药,对治疗胃癌、食道癌、肺癌、乳腺炎、咽喉炎、疟疾、牙痛、魟鱼尾刺刺伤均有一定疗效。其肝除作为制作鱼肝油的原料外,煮食后能治夜盲症。 但是,国内外对赤魟的生物活性研究还处于起步阶段,其应用研究和应用基础几乎空白,资源量丰富、营养药用价值高的赤魟仅处于被人们日常食用的阶段。上文所述赤魟的药用价值大多都是对赤魟尾刺提取物、赤魟肝脏活性蛋白、赤魟软骨多糖或其软骨活性蛋白的研究。 如肖湘等对赤魟肝脏活性蛋白体外抗氧化作用的研究[2],采用硫酸铵沉淀、Sephadex-G150柱层析的方法从赤魟肝脏分离活性蛋白,测定活性蛋白清除超氧阴离子自由基、羟自由基和抑制脂质过氧化作用,结果显示分离得到的三个蛋白峰均具有很强的抗氧化作用。 罗红宇等对赤魟软骨黏多糖的制备研究[3],探索利用碱浸提和酶法去蛋白从赤魟

minitab部分因子设计,响应面设计,参数设计

北京信息科技大学经济管理学院
《工程优化技术》
课程结课报告
成绩:_______________ 班级:__工商 1002_____ 学号:__2010011713____ 姓名:__魏坡 _______ 日期:_2013 年 6 月 7 日_

部分因子试验设计
1.实验设计背景
部分因子试验设计与全因子试验设计的不同之处在于大大减少了试验的次 数, 具体表现在试验设计创建阶段的不一致,下面主要就部分因子试验设计的创 建进行讲述。
2.因子选择
用自动刨床刨制工作台平面的工艺条件试验。在用刨床刨制工作台平面试验中, 考察影响其工作台平面光洁度的因子,并求出使光洁度达到最高的工艺条件。
3.实验方案
共考察6个因子: A因子:进刀速度,低水平1.2,高水平1.4(单位:mm/刀) B 因子:切屑角度,低水平 10,高水平 12(单位:度) C 因子:吃刀深度,低水平 0.6,高水平 0.8(单位:mm) D 因子:刀后背角,低水平 70,高水平 76(单位:度) E 因子:刀前槽深度,低水平 1.4,高水平 1.6(单位:mm) F 因子:润滑油进给量,低水平 6,高水平 8(单位:毫升/分钟) 要求: 连中心点在内, 不超过 20 次试验, 考察各因子主效应和 2 阶交互效应 AB、 AC、CF、DE 是否显著。由于试验次数的限制,我们在因子点上只能做试验 16 次,另 4 次取中心点,这就是 2 6 ? 2
? 4 的试验,通过查部分因子试验分辨度表可
知,可达分辨度为Ⅳ的设计。具体操作为:选择 [统计]=>[DOE]=>[因子]=>[创建 因子设计],单击打开创建因子设计对话框。在“设计类型”中选择默认 2 水平 因子(默认生成元) ,在“因子数”中选定 6。
单击“显示可用设计”就可以看到下图的界面,可以确认:用 16 次试验能 够达到分辨度为Ⅳ的设计。

银屑病与血管生成因子(一)

银屑病与血管生成因子(一) 摘要:银屑病是一种炎症性疾病,血管生成是银屑病病理改变的特征之一。作为银屑病发生发展必不可少的条件,血管生成相关因子在银屑病发病机制中的研究日益受到重视。现就目前若干银屑病血管生成研究中较热点的血管生成相关因子:血管内皮生长因子,肝细胞生长因子,胸苷磷酸化酶,血小板反应蛋白等的研究进展作一综述。 银屑病是一种常见的复发性、炎症性皮肤病。以角质形成细胞(KC)过度增生、炎症细胞浸润、新生血管形成为其组织病理三要素。目前研究表明:银屑病皮损处的真皮乳头层微血管扩张迂曲,通透性增高,血管数量增多,并认为这种变化主要发生在毛细血管后微静脉1]。银屑病中最先发生的病理改变是血管的分布和形成的改变1,2]。在银屑病患者非皮损皮肤中亦常能见到异常扩张的血管2]。银屑病的复发则与皮损内真皮乳头内皮细胞的过度表达有关。且银屑病患者皮肤血管生成只与表皮变化有关,而与真皮无关3]。微血管是皮肤组织与循环血液进行物质交换的场所。因此对银屑病血管生成的研究有助于揭示银屑病的发病机制,并指导临床治疗。目前有关银屑病血管生成,特别是一些血管生成相关因子以及抗血管生成药物治疗银屑病的研究日益受到重视。 促血管生成物质诱导血管生成的过程大致可分解为以下几步:①内皮细胞激活;②基底膜和细胞外基质降解;③内皮细胞增生,并迁移到血管周围基质形成管腔;④新生血管网络系统形成。现就近几年在银屑病研究中的若干热点血管生成因子的研究进展综述如下4,5]。 一、血管内皮生长因子 血管内皮生长因子(VEGF)又名血管通透性因子(VPF),有4种不同的亚型,在人类细胞中的氨基酸残基数分别为121,165,189,2066],是由同一基因因mRNA剪接差异而生成的不同表达产物。VEGF在体内可以增加血管通透性,促进血管生成;在体外则作为内皮细胞选择性的有丝分裂原。VEGF是内皮细胞特异性的,它能改变内皮细胞的基因表达。VEGF 与血管内皮细胞表面的两个酪氨酸激酶受体kdr与flt-1结合,使胞浆内Ca++浓度上升,刺激三磷酸肌醇(IP3)聚集,这一作用被认为与磷酸肌醇特异性的磷脂酶C有关6,7]。Siemeister 等8]报道:人工合成的VEGF变异体能抑制VEGF介导的受体自动磷酸化和内皮细胞增生。其增加血管通透性的作用可能是通过囊泡-液泡细胞器(vesicular-vacuolarorganelleVVO)起效的6]。VEGF能上调囊泡-液泡细胞器功能,调节血管基底膜上窗孔的开放或关闭,它的促血管通透性增加的作用较组胺强50000倍9]。另有报道,VEGF在冠状动脉内皮细胞中可能是通过一氧化氮/鸟苷酸环化酶信号级联(guanylatecyclasesignalingcascade)放大起作用的10]。Detmar等9]报道,VEGFmRNA及蛋白表达水平在银屑病患者皮损中明显增加,而在正常人皮肤中几乎没有VEGFmRNA表达。患者非皮损处VEGFmRNA及蛋白水平表达亦增加,且出现银屑病早期病理改变。研究发现VEGF染色位于基底层上(suprabasal)的KC胞浆内,kdr 与flt-1的mRNA则表达于活动期皮损的真皮乳头层微血管内皮细胞上,在正常人或皮损更深部位则无kdr与flt-1的mRNA表达。同时发现,转化生长因子/表皮生长因子(TGF-α/EGF)对培养的人KC中VEGFmRNA的表达有剂量依赖的诱导上调作用,TGF-α/EGF受体在银屑病皮损中表达也明显增高。TGF-α能刺激VEGF合成分泌。另外VEGFmRNA和TGF-αmRNA在表皮KC的相同定位也在一定程度上证实了上述观点。最近有研究表明,KC通过自分泌成纤维细胞生长因子FGF-4(bFGF)上调VEGFmRNA来表达其血管生成活性11]。 由此可见VEGF所介导的银屑病血管生成过程是:表皮KC在受到刺激后能通过自分泌或旁分泌的形式释放细胞因子,促进VEGF表达,而VEGF则通过内皮细胞上的特异性受体kdr 和flt-1使胞内发生一系列改变,促使血管通透性增加及血管内皮细胞增生、迁移,最终导致新生血管形成。 二、肝细胞生长因子 肝细胞生长因子(HGF)又名扩散因子(SF),是由基质细胞(stromalcell)、成纤维细胞及

中药抗肿瘤血管生成研究进展

中药抗肿瘤血管生成研究进展 (作者:__________ 单位: __________ 邮编:____________ ) 【摘要】抗肿瘤血管生成为肿瘤的治疗提供了新的契机,中药均为有效的血管生成抑制剂,具有廉价无毒等优点,随着其抗肿瘤,血管生成等机制方面研究的不断深入,中草药极有希望成为理想 而全面的癌症预防和治疗药物。 【关键词】肿瘤血管抑制因子综述 近年来中药或有效成分抑制肿瘤血管生成研究非常活跃,也具有明显的广度和深度。 1中草药研究动态 1.1去甲斑蝥素范跃祖等观察了去甲斑蝥素(NCTD对胆囊癌肿瘤血管生成的抑制作用及其机制NCTD可有效抑制、破坏胆囊癌肿瘤血管生成,进而抑制胆囊癌的增殖与生长。其机制可能与NCTD诱导血管内皮细胞凋亡、直接破坏血管内皮细胞、改变血管内皮细胞PCNA/凋亡比、下调血管生成因子VEGFA n期2和上调血管抑制因子TSP TIMP2表达有关[1]。 1.2小檗碱小檗碱(berberine)为黄连(毛茛科植物)、黄柏等

(芸香科植物)植物的一种生物碱,作为抗菌药已有悠久的历史。初步研究表明它在体内、体外对多种肿瘤细胞具有较强的抑制和杀伤作用 :2]。娄金丽等研究小檗碱对bFGF活化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响,探讨其对肿瘤新生血管形成作用的机制。方法:MTT法检测小檗碱对bFGF活化HUVEC勺增殖作用;流式细胞仪检测用药后细胞周期的变化;激光共聚焦扫描显微镜下观察药物对细胞形态、细胞内钙的影响;流式细胞仪检测小檗碱对细胞凋亡的作用。结果:小檗碱能明显抑制bFGF活化的HUVE(增殖,且存在剂量依赖关系;使细胞在GG以G1期的比例明显增多;使细胞核浓缩、甚至裂解成碎块,同时使细胞内钙增多;并诱导活化HUVEC 发生细胞凋亡。结论:小檗碱可能通过将bFGF活化的HUVEC田胞周期阻滞在G期G1期,抑制活化HUVEC勺增殖;诱导活化HUVEC田胞发生凋亡等机制,阻止新生血管形成,发挥其抗肿瘤作用]3]。 1.3白藜芦醇白藜芦醇是广泛存在于葡萄、花生和多种药用植物中的一种多酚类化合物,目前至少已经在21个科,31个属的72 种植物中发现了白藜芦醇。早期研究发现,白藜芦醇具有保护心血管, 调节血脂、抗病原微生物、护肝等多种生物学作用。自从Jang等于1997年系统报道了白藜芦醇的抗肿瘤作用后,迄今已发现白藜芦醇能通过多种途径抑制肿瘤细胞的起始,促进,发展三个阶段,而且可以抑制肿瘤血管形成。1.对内皮细胞的作用,能够直接抑制血管内皮细胞的增生,迁移及诱导其凋亡,从而抑制血管的生成。 2.对血管生

血管生成实验模型研究进展

血管生成实验模型研究进展 吴家明1 ,陆 茵 1,2 ,郜 明1,张伟伟 1 (1.南京中医药大学中医药研究院,江苏南京 210029;2.江苏省方剂研究重点实验室,江苏南京 210029) 收稿日期:2007-09-21,修回日期:2007-11-01 基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 30371727,30772766);江 苏省自然科学基金资助项目(No BK2003113) 作者简介:吴家明(1980-),男,硕士生,研究方向:肿瘤血管生成与 抗肿瘤转移研究,E 2mail:nj w ujia m ing@https://www.360docs.net/doc/407834747.html,; 陆 茵(1963-),女,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤血管生成与抗肿瘤转移研究,通讯作者,Tel:0252 86798154,E 2mail:luyingreen@https://www.360docs.net/doc/407834747.html, 中国图书分类号:R 205;R 332;R 3632332;R 36413 文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)01-0011-04摘要:抗血管生成已经成为治疗肿瘤转移、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等疾病的重要策略之一。血管生成模型作为一种研究工具在探讨血管形成机制、发现促进或抑制血管生成药物等研究中发挥十分积极的作用。如何寻找适合的血管生成模型是研究人员在研究中常遇到的问题。该文就主要常用模型做较全面的介绍,并对其优缺点进行评价。关键词:血管生成;模型 血管生成(angi ogenesis )是指在原有的毛细血管和(或)微静脉基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖,从已存在的血管处以芽生或非芽生(套迭)形式形成新的、以毛细血管为主的血管系统过程 [1] 。血管生成是许多促进或抑制血管 生成的分子参与调节的一个平衡过程[2]。血管生成过多与肿瘤、糖尿病性视网膜病变等疾病有关[3],抑制血管生成已经成为治疗这些疾病的重要策略。因此寻找血管生成抑制剂成为研究热点。血管生成研究需借助血管生成模型进行,血管形成的许多过程都可以在血管生成模型中模拟完成,包括内皮细胞增殖、迁移、毛细血管网状结构的形成等。本文就常用体内、体外及整体模型进行综述。 1 体外模型 体外模型主要分为细胞水平及组织学水平两类,常用的体外模型有以下4种。 1.1 内皮细胞增殖实验(cell proli fera ti on a ss ay) 内皮细 胞活化增殖是血管生成的起始阶段。目前主要有两种测定细胞增殖的方法即净细胞数测定和细胞周期分析。 1.1.1 净细胞数测定 M TT 法(四甲基偶氮唑比色法)是 测定活细胞数的化学定量方法,操作简便,价格低廉。但它不适合测定对细胞代谢有影响的药物,因为这类药物能影响 MTT 测定的活细胞数。另外通过胸腺嘧啶核苷参入法测定DNA 合成来测定细胞增殖能力。抑制细胞增殖可能是由于 药物的抑制作用,也可能是药物的毒性作用引起。因此,这种方法常需要结合细胞凋亡实验的数据才可以更好地评价药物对细胞增殖的影响。 1.1.2 细胞周期分析 近年来有报道通过细胞周期分析来 评价药物对细胞增殖的影响,细胞短时间暴露到溴脱氧尿苷 (B rd U )中可以促使B rdU 参入细胞DNA 中。碘化丙啶(P I ) 染色后测定细胞的总DNA 量,再用荧光激活细胞分析仪测定细胞中B rd U 和P I 的量可得出细胞周期信息[4]。但实验用的内皮细胞处于增殖状态,与体内静止状态的内皮细胞是不同的,实验结果与体内还是存在一定差异。 1.2 内皮细胞迁移实验(cell m i gra ti on a ss ay) 常用迁移 模型有两种:①细胞损伤模型:在培养血管内皮细胞的培养皿上用刀片划出#形区,经P BS 洗涤后再用含011%明胶的 ME M 培养20h,细胞用甲醇固定,Gie m sa 染色。在光镜下计 数从损伤边缘迁移出的细胞数,需要注意的是划出的损伤区域一定要精确。②Boyden 室模型,Boyden 室由两层组成,两层之间为胶原包被的多孔的多聚碳酸盐滤膜;血管内皮细胞放于上层,同时加入待测药物,共同培养6h 后,除去上层的细胞,下层细胞用甲醇固定,HE 染色,光镜下计算下层的血管内皮细胞数。龙淼云等[5]采用本模型研究证明了血管生成抑制因子arresten 对huvec 迁移有抑制作用。Boyden 室模型优点在于它对药物浓度梯度差异很敏感。但对实验技术要求较高且计数方法不同可能会造成统计结果误差较大。因此有必要建立一个严格的计数标准以减少因方法不同产生的误差。 1.3 小管形成实验(tube for ma ti on a ss ay) 小管形成实验 能模拟人体内毛细血管生成的过程,包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤,接近人体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时能形成网状结构。用电子显微镜来分析小管间的紧密连接,从而定量血管生成情况[6]。需要指出的是似乎所有的内皮细胞都能在细胞外基质上形成管状结构,有些非内皮细胞也能在基质胶上形成管腔结构[7]。实验一般采用24孔培养板,但它底面积大,Matrigel 用量多,计数区域大只能随机选择几个典型区域且数据分析耗时长。Sanz 等[8]采用384孔和1536孔培养板培养可节约胶的用量,借助计算机可以计算整个孔的小管及小管之间的连接数及小管的长度和面积。改进方法后减少了原来分析困难及重现性差的缺点。 1.4 大鼠动脉环实验(ra t aorti c r i n g a ss ay) 1990年N ic 2osia 等首次将此模型应用于血管生成研究中。取下大鼠主 动脉后,剪成1mm 宽的血管环,再用纤维蛋白胶或胶原蛋白胶包埋,然后以无血清的MC DB131培养液培养。培养过程中每天计算主动脉环产生的新生微血管数并进行定量分析。用不同胶培养的大鼠主动脉环新生血管的生长曲线不同。胶原包埋的主动脉环,培养1wk 时血管数达到顶峰,第 2wk 开始萎缩。用纤维蛋白胶包埋时能使血管数顶峰期维 ? 11?中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2008Jan;24(1):11~4

血管新生概念及其调控因子网络

血管新生概念及其调控因子网络 1.1病理性血管新生与治疗性血管新生 任何组织损伤后的修复都离不开血管生成,血管生成是组织修复的中心。血管生成过程包括血管新生、血管发生和原已存在的血管剪切重构形成的成熟毛细血管网。血管新生,是指毛细血管从原血管以出芽方式形成新血管床的过程。通常存在于胚胎形成和产后组织正常生长的过程中,成年女性生殖系统子宫内膜血管的周期性反复重建和组织受损后正常的修复也有血管生成的参与。在这些过程中,血管生成的启动受到多种因素的控制,仅随刺激信号的出现开启短暂时间,然后即被关闭。所以,体内血管的生长与抑制处于动态平衡,以保持相对静止状态,当这一状态一旦被打破,即导致许多疾病的发生[5]。在创伤、缺血、炎症、伤口愈合、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎、牛皮癣等许多病理条件下亦可发生新的血管形成。血管新生包括以下几个过程[6]:①小血管(常常为毛细血管后静脉)基底膜和基质的降解,参与这一过程的有胶原酶、尿激酶型纤溶酶原激活物等;②内皮细胞在趋化因子的作用下发生迁移,bFGF、VEGF、IL-8等对这一过程均具有促进作用;③内皮细胞增殖;④在内皮芽生的基础上形成管腔;⑤芽生的管腔相互融合成环状血管分支,形成三维管状结构,允许血流通过;⑥血管周细胞进一步构建血管结构;⑦血管周围基膜的形成。 血管新生性疾病即指与微血管异常生长有关的疾病,表现为血管生成的过度与缺陷。自1971年Folkman[7]提出:“三维生长的肿瘤 2mm×2mm×2mm之后是绝对血管生成依赖性”的观点后,血管生成的研究受到了广泛的关注,并取得飞速进步。探讨血管生成发生机理和研制逆转血管生成病变的治疗方法和药物是近年医学研究的热点课题。其中,抑制血管新生(抗病理性血管新生)研究与肿瘤的治疗密切相关;而对促进血管新生(治疗性血管新生)的研究多围绕冠状动脉侧枝循环的治疗展开。冠状动脉粥样硬化和渐进型冠状动脉闭塞常能形成侧枝循

神经生长因子与血管生成的相关性研究进展.

.138? 中国现代医药杂志2009年8月第11卷第8期MMJC,Aug2009.Vol11,No.8 神经生长因子与血管生成的相关性研究进展 于一凡综述孙晋民审校 神经生长因子f nerve growth factor,NGF)作为一种传统 意义上的神经营养因子,具有多方面的作用,它能促进中枢及外周神经系统的 发育与分化.维持神经系统的正常功能,促进神经维的再生,并对神经元有保护作用。有两种膜受体介导NGF的信号,即高亲和性的TrkA受体。和低亲和性的 p75受体。近来研究表明NGF还具有促周围再生神经…和非神经组织12t31的血管生成作用。研究发现NGF不仅可以通过调节血管内皮细胞生长因子(v ascular endothelial growthfactor, VEGF)的表达间接地促进血管形成141,NGF还具有直接促进血管形 成的作用阁。1血管生成的机制 血管生成是新血管形成的主要过程。它在机体胚胎发育中起着重要作用,参与 人体正常的生理活动,而且血管生成也是很多病理情况的重要标志.包括糖尿病和 癌症.在创伤修复、缺血缺氧、慢性炎症和癌症等情况下,原有微血管内皮细胞经

过生芽、迁移、增殖及基质重塑等形成新毛细血管问.血管生成受促血管生成因子和相应受体间的相互作用调节。在新血管形成过程的不同阶段中均有参与。 2 NGF促进血管生成的作用 2.1 NGF与血管内皮细胞的相互作用Tanaka等同研究发 现,大鼠主动脉内皮细胞可产生并释放NGF,从而确认血管内皮细胞是NGF的又一重要来源。Dolle7等【{I用人类主动脉内皮细胞human aorticendothelial cells.HAECs)I羞行全方位迁 移分析.发现NGF刺激了HAECs的迁移,这和血管内皮生长因子vascularendothelialgrowthfaetor,VEGF).基本成纤维 细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGn的作用相 似。NGF介导的HAEC迁移可被NC胁kA受体拮抗剂 K252a阻断。而不被VEGF,F1k受体拮抗剂SU一5416阻断,说明了NGF通过TrkA受体直接激活了HAEC迁移,数据还显示HAEC表达p75NTR。此外,有研究显示mGF促进血管内皮增生,提高了胰岛移植的

血小板第四因子抗肿瘤血管生成研究进展

?2948?[22] [23] [24] [25] [26]匡堂筮述!Q塑生!Q旦箜!!鲞笙!!翅丛!ii型塾!!!唑!!!塑:Q堕!Q鲤:!!!:!§,盟!:!! proteinincreasesdoxorubicin sensitivity andnuclearaccumulation anddisruptsitssequestrationinlysosomes[J].MolCancerTher,200r7,6(6):1804.1813. HuhHJ。ParkCJ,JangS,eta1.Prognosticsignificanceofmultidrug resistancegenel(MDRl),muhidrugresistance—relatedprotein(MRP)andlungresistanceprotein(LRP)mRNAexpressionina—cuteleukemia[J].JKoreanMedSci,2006,21(2):253-258. BergerW,Spiegl—KreineckerS,BuchroithnerJ。eta1.Overexpres—sionofthehumanmajorvaultproteininastracyticbraintumorcells[J].InlJCancer.2001,94(3):377-382. BergerW,ElbtingL,MickscheM.ExpressionofthemajorvaultproteinLRPinhumannon—small—celllungcancercells:activationbyshort—termexposaretoantineoplasticdrugs[J].IntJCancer。2000,88(2):293-300. SteinU,BergmannS,sche艉rGL,eta1.YB—lfacilitatesbasaland5-fluorouraeil-inducihleexpressionofthehumanmajorvaultpro-tein(MVP)gene[J].Oncogene,2005,24(22):3606-3618. 1kutaK,TakemuraK,SasakiK,eta1.Expressionofmuhidrugre- sistaneeproteinsandaccumulationofcisplatininhumannon—smallcelllung cancercells[J].BiolPharmBull,2005,28(4):707-712.[271I(jtazonoM,Sumiz.awaT,TakebayashiY,da/.Muhidrugresistanceandthelungresistance—relatedproteininhumancoloncarcinoma SW-620cellslJ1.JNatlCancerlnst,1999。91(19):1647-1653.[28】LewinJM,LwaleedBA,CooperAJ,eta1.Thedirecteffectofnacle— arporesoilnuclearchemotherapeuticconcentrationinmuhidrug resistantbladdercancer:thenuclearsparingphenomenonJ】.J Urol。2007.177(4):1526一1530. [29】YasunamiT,WangYH,TsujiK,eta1.Multidrugresistanceprotein expressionofaduhT-cellleukemia/lymphoma【J1.kukRes, 2007.31(4):465-470. [30]樊娟,周慧,张丽,等.急性白JlIL病细胞肺耐药相关蛋白的表达及其临床意义[J].中华肿瘤防治杂志,2007,14(19): 1477-1479. [31]KourtiM,VavatsiN,GombakisN,eta1.Expressionofmultidrug resistance1(MDRI),multidrugresistance—relatedprotein1 (MRPI),lungresistanceprotein(LRP),andbreastcancerre? sistanceprotein(BCRP)genesandclinicaloutcomeinchild— hoodacutelymphoblasticleukemia[J].IntJHematol,2007, 86(2):166-173. 收稿日期:2009-03-30修回日期:2009-07-10 血小板第四因子抗肿瘤血管生成研究进展 张华1△(综述),任宏轩h,伍治平2(审校) (1.云南省肿瘤医院内二科,昆明650018;2.云南省肿瘤研究所,昆明650018) 中图分类号:R730.5文献标识码:A文章编号:1006-2084(2009)19-2948-03 摘要:血小板因子4是由活化的血小板ot颗粒分泌的趋化因子,属于CXC4家族,具有抗肿瘤血管生成的活性,属于内源性的血管生成抑制因子。其可以通过多种机制抑制肿瘤的血管生成,如抑制血管内皮细胞生长园子、碱性成纤维细胞生长园子介导的血管内皮的增殖;削弱p21的下调,抑制内皮细胞分裂、增殖;抑制基质金属蛋白酶的表达,防止新生血管向周围组织的蔓延等。从而有效抑制肿瘤的新生血管形成。 关键词:血小板因子4;肿瘤血管生成;抗血管生成 ResearchProgressinAnti—tulnorAngiogenesisofPlateletFactor.4Z托4NGHual.兄FNHong.z“Ⅱ,l‘.删Zhi-pin92.(1.DepartmentofInternalMedicine,ynn,zⅡnProvinceTumorHospital。Kunmin9650018,傩i—w;2.CancerResearchInstituteofy“n№n,Kunming650018.吼ina) Abstract:Plateletfactor-4isachemokinereleasedbytheactivatedplateletintheplasma.whichisin.dexedintheCX(=4 superfamily.It hasanti?angiogenesisactivity.istheantiangiogenesisinvivo.ThrotIghavarietyofmechanisms,plateletfactor-4caninhibittumorangiogenesis.SU(-hasinhihitingVECF。bFGF-medi.atedproliferationofvascularendothelial.weakenthedownwardofp21.inhibitedendothelialeelldivisionandproliferation;inhibitingtheexpressionofmatrixmetalloproteinases.topreventneovascularizationspreada.roundtheorganizatinnsoastoeffectivelyinhibittumorangiogenesis. Keywords:Plateletfactor-4;Angiogenasis;Anti—angiogenesis 目前恶性肿瘤已成为威胁人类健康最严重的一 类疾病,肿瘤的发病率和病死率都日益增高。临床 上绝大多数的肿瘤患者死于肿瘤的远处转移。血管 生成在肿瘤转移中起到了非常重要的作用。同时也 是肿瘤转移的必需条件…。血小板因子4(platelet factor-4,PF4)属于内源性血管生成抑制因子,它可以 通过多种机制抑制肿瘤的血管生成,是近几年研究 的热点[23。 1PF4及其生物学活性 早在1948年,Conley就发现血小板减少患者对肝素的敏感性异常增加,从而推测血小板可能释放某种具有中和肝素抗凝活性的因子,此后被其他学者陆续证实,并部分纯化了这种血小板蛋白,并命名为PF4。因其有中和肝素的作用又称其为肝素结合蛋白或抗肝素因子。PF4是由巨核细胞合成的,生理状态下存在于巨核细胞及血小板at颗粒致密体中,在血小板黏附、聚集等 活化状态下以高分子质量蛋白多糖一PF4复合物的形 式释放。因此,它可以作为巨核细胞分化成熟以及 血小板活化的一种标志物∞J,但是最近研究显示单 核.巨噬细胞在细菌、真菌、脂多糖、酵母多糖及血小 板碱性蛋白等的刺激下也可以分泌PF4HJ。酶联免 疫吸附法测定其在正常人血浆中的浓度为0.9 ~5.5斗g/LⅢ。 PF4属于人趋化因子超家族C.x—C亚族,含有 70个氨基酸,由4个单体组成,每个单体相对分子质 量为7.8×103,单体是N端的可变区通过二硫键锚万方数据

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