小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体结合关键氨基酸的鉴定

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小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体结合关键氨基酸的鉴定△

郁婷婷1，刘宏景2，傅启华“

I1．上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科。上海。200127；

2．上海交通大学医学院附属新华医院检验科)

摘要：目的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(u_PA R)在细胞表面介导多种生物学效应。本文目的是解析小鼠uPA蛋白结构中与其受体结合的关键氨基酸。方法包含小鼠uPA全长cD N A的质粒购于A T C C公司，小鼠cD N A序列进一步克隆至Pur o．pM T表达载体。用定点突变法构建各类uPA突变体表达质粒。表达质粒用磷酸钙转染至s2细胞中，用10斗g／TI l l嘌呤霉素筛选稳定表达细胞。表达的重组蛋白分别用C Ms ephadex柱和sephadex G75柱纯化。纯化后的蛋白分别用SD S．PA G E和免疫印迹法鉴定。用表面等离子共振技术(SPR)检测重组uPA与uPA R的结合常数。结果用定点突变法成功构建小鼠uPA$22、Y23、K24、Y25、F26、$27、129、R31、F A l、$358分别突变为丙氨酸的突变体及R28、30、31突变为N28、1-130、W31的突变体M3。经阳离子交换层析和分子筛纯化，重组蛋白的纯度均大于95％并能被小鼠uPA抗体所识别。结合试验表明野生型uPA和M3型uPA的K D值分别为0．467nM和1．64nM，10种点突变uPA的K D值范围为0．388nM至36．5nM。结论小鼠uPA中至少有7个氨基酸(Y23、K24、Y25、F26、$27、129、1131)涉及小鼠uPA—uP A R的结合；Y23、Y25和F26是其中的关键氨基酸。

关键词：尿激酶型纤溶酶原激活物；受体；结合；小鼠

[中图分类号]Q517[文献标志码]A[文章编号]1009-6213(2010)06-25905

I dent i f i cat i on of C r i t i cal A m i no A ci d R es i dues f or M ous e U r ok i nas e-t ype Pl as m i nogen

A ct i vat or

B i ndi ng t o i t s R ecept or

Y U T i ng t i ng，L I U H ong-j i ng，FU Q i-hua

(D epar t m ent of Labo r at or y M e di ci ne，Sha ngha i C hi l dr en’s M e di cal C en t er，Shangh ai J i ao t ong U ni ver s i t y Sch ool of M edi ci ne，

S ha ngh ai200127，C hi na)

A bst r act：O bj ect i ve U roki na se—t ype pl as m i nogen act i vat or(uPA)w i t h i t’S r ecept o r，uP A R，m edi at e a

va r i et y of bi ol ogi ca l act i vi t i es at t he cel l sur fac e．T he ai m of t hi s s t udy is t o di ss ect t he m ou s e uP A am i no a ci ds

i nvol vi ng i n uPA R bi ndi ng．M et hods r11l e pl asm i d c ont a i ni ng m ou s e f ul l-l e ngt h cD N A w a s pur ch as ed f r om

A T CC．a nd w a s c l oned i nt o Pur o-pM T vect or．％e m ut at ed e xpre s si on pl a s m i ds w er e gene ra t ed w i t h t he

Q ui kC hange X L si t e—di r ec t ed m ut agenesi s ki t．Expre ss i on pl as m i ds w er e t r ansf ect e d i nt o dr osophi l a s chnei der S2cei l s usi ng a cal ci um phos p hat e t r ans f ec t i on ki t．St ab l y t r ans f e ct e d S2eel s w er e t hen pl a c ed under se l ec-t i on pr es s ur e w i t h10“g／m l of pur om yci n．R ecom bi nant pr ot ei ns w er e pu r i f i e d usi ng bot h C M s ephadex col—

a nm and s ephadex G75c ol um n．Pur i fi ed pr ot e i ns w er e i de nt i f i ed by bot h S D S．PA G E and w es t er n bl ot．T he

bi ndi ng of m ou s e uP A S t o uPA R w a s a na l yz ed by s ur fa ce pl as m on r esonance(SPR)．R esul t s R28，30，31t o N28，H30，W31subst i t ut i on(M3)and10poi nt subst i t ut i ons i nc l udi ng$22A，Y23A，K24A，Y25A，F26A，$27A，129A，R31A，E4l A a n d$358A w er e gene ra t ed by si t e—d i r ect ed m u t agenes i s m et hodol ogi e s．A ft er cat i on—exchange chr o m at ogr aphy and gel-f i l t r at i on pur i f i cat i on，t he pu r i t i e s of t he t ar get pr ot e i ns w er e gr e at er t h an 95％a nd r ec ogni z ed by an ant i body t o m ou s e uroki na se．B i ndi ng as s ays dem onst r at ed t ha t t he K D s五D r w i l d-

t ype uPA and M3w er e0．467nM and1．64nM．r especti vel y．T he K D val ue s f or10poi nt m ut at ed uPA s w er e

f r o m0．388nM t o36．5nM，r es pect i vel y．C oncl us i on A t l east s e v e n am i no aci ds(Y23，K24，Y25，F26，$27，

△基金课题：本文受教育部留学回国人员科研启动基金资助。

’通讯作者