水果各指标测定方法

失重率

%100贮藏前的重量贮藏后的重量贮藏前的重量?-=失重率

果实硬度

果实硬度采用手持硬度计（四平兴科仪器仪表厂）法测定，每处理测定10个果实，每果实以对应面去皮测两次，硬度计探针以进入果肉0.5cm 为准，测得果实硬度为相对硬度。最后以10个果实测得硬度值求平均值作为该处理的硬度。 好果率

以计数法测定，好果率=完好脆果数/检查总果数*100%

转红率

转红率=全红果/检查总果数*100%

冰点：

基本原理

冰点(freezing point)是果蔬的重要物理性状之一。果蔬组织冰点受果蔬种类、品种、发育程度、栽培条件等的影响。测定果蔬的冰点有助于确定果蔬适宜的贮运温度及冻结温度。但是，果蔬活组织的冰点测定过程比较复杂。由于果蔬榨汁后汁液的冰点要比果蔬活组织的冰点略高，因此，通过测定果蔬汁液的冰点，在一定程度上可以反映果蔬活组织的冰点状况。

将溶液置于低温下，其温度会随着降温时间的延长而下降。当溶液温度降至其冰点时，由于液体结冰放热的物理效应，使得溶液温度不再随着降温时间的延长而下降，而是保持一段时间。此后，随着降温的继续进行，溶液(实际上已经为冻结的固体)的温度又开始下降。根据溶液结冰过程的这种特点，通过测定溶液温度降低过程与降温时间的关系，可以确定该溶液的冰点，即降温曲线中温度不随时间下降的一段。同样道理，果蔬汁液的冰点即为降温冻结过程中温度不随时间下降的一段曲线所对应的温度。

材料及仪器

(一)材料

苹果、梨、枣、菠菜等。

(二)仪器及用具

标准温度计(精确度±0.01℃)、烧杯(1000mL,l00mL)、研钵、纱布。

(三)试剂

﹣6℃以下冰盐水：质量分数大于11%氯化钠或氯化钾溶液，预先冷却至出现冰盐结晶体。

实验步骤

(一)测定

取果蔬样品研碎，用双层纱布过滤。取50mL 滤液置于100mL 小烧杯中，将小烧杯置于冰盐水中，插人温度计，温度计的水银球必须浸在样品汁液中，并且不断轻轻搅拌汁液。从汁液温度降至2℃时开始记录温度读数，每隔20s 记录1次，直到果蔬出现完全结冰为止。

(二)绘制降温曲线

分别记录果蔬汁液温度读数和降温时间，以温度(℃)为纵坐标，时间(s)为横坐标，绘制果蔬汁液的降温曲线，曲线上出现平稳变化时的温度就是样品汁液的呼吸强度

原理

植物进行呼吸时放出CO 2，测定一定的植物材料在单位时间内放出的的量CO 2，即可测知该植物材料的呼吸强度。

实验材料、试剂与仪器设备

1 实验材料：苹果、蒜薹等果蔬产品

2 仪器设备：呼吸强度测定仪

实验步骤：

将呼吸强度测定仪先调至零，将果蔬产品称0.4kg ，平放于塑料托盘中置于呼吸强度测定仪中，打开气泵，记录最后读数N 。

计算公式：

W

T N h Fw kg mgCO X +?

???=??--2732734.2244604.0)(112 式中：X ——呼吸强度（mgCO2·kg-1Fw ·h-1）

N ——读数（μL ·L-1CO2）

W ——样品重量（kg ）

T ——温度

可溶性固形物含量的测定

基本原理

手持式折光仪是一种通过测定糖的水溶液的折光率来测定其浓度的仪器。手持式打光仪具有测量迅速，操作简便，体积小，质量轻，便于携带等特点，已被广泛地应用于工业、农业、食品、饮料加工业等行业。

材料及仪器

(一)材料

苹果、梨、桃等。

(二)仪器及用具

手持式折光仪(手持式糖度计)、研钵、滴管、滤纸、擦镜纸、蒸馏水。

买验步骤

(一)样品制备

取一定量(5.0g)果实样品(可食部分或果肉部分)放人研钵中磨碎后，经过离心(4000r/min ，10min)或过滤后取汁液测定。

(二)调零

打开手持式折光仪棱镜盖板，用擦镜纸或柔软绒布轻轻擦净折光镜面，滴几滴蒸馏水于折光镜镜面上，合上盖板，将仪器对向光线，由目镜观察，转动棱镜旋钮，使视野分成明暗两部分。并用专用螺丝刀旋动补偿器旋钮，使视野为黑白两色，同时使明暗分界线与标尺上的“0”位重合。然后打开盖板，擦干水分。

(三)测定

用滴管吸取样品液，滴加在检测镜上，合上盖板。注意盖板时要防止产生气泡。将折光仪持平对向光源，调节目镜视度圈，使视野黑白分界线清晰可见，读取刻度尺读数，即为样品液中可溶性固形物的含量，以质量分数(%)表示。重复测定三次，计算平均值和标准偏差。

注意事项

(1)通常规定在20℃时利用手持式折光仪测定折射率，得到的读数即为可溶性固形物的含量。若测定温度不是20℃时，则应加以校正。由于手持式折光仪使用方便，在生产中得到较多应用。

(2)有时为了进一步简化测定过程，可取一些果肉组织，直接用手挤出果汁，滴加在检测镜上进行测定。

(3)每次测试前先用蒸馏水将折光仪调节到零位。测定完后，必须擦净镜身各部分。

可滴定酸

基本原理

果蔬中含有多种有机酸，主要有苹果酸、柠檬酸、酒石酸、草酸等。果蔬种类、品种不同，所含有机酸的种类和数量也不同。果蔬中有机酸的种类和含量对果蔬的口味、风味、糖酸比、pH,贮藏性、加工性质都具有重要的影响。

果蔬可滴定酸(titritable acidity , TA)含量的测定是根据酸碱中和原理进行的，即用已知浓度的氢氧化钠溶液滴定果蔬提取液，根据氢氧化钠的消耗量计算果蔬中可滴定酸的含量。然而，由于每种果蔬中所含有的有机酸种类较多，在计算时，就要根据该果蔬中所含的主要种类有机酸进行折算。

材料、仪器及试剂

(一)材料

苹果、芒果、番茄等。

(二)仪器及用具

碱式滴定管(20mL)、容量瓶(100mL,1 000mL)、移液器，三角瓶(100mL)、研钵、电子天平、漏斗、滤纸、铁架台、蒸馏水。

(三)试剂

1. 0. 1 mol/L氢氧化钠溶液

称取4. 0g分析纯氢氧化钠，加新煮沸过的蒸馏水溶解，待冷却后，再用新煮沸过的蒸馏水定容至1000mL，保存到带塑料盖的玻璃瓶中。

使用时，需用邻苯二甲酸氢钾溶液标定氢氧化钠滴定液。准确称取0. 600g 在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加人50mL新煮沸过的冷水，振摇，使其尽量溶解。再滴加2滴1%酚酞指示剂，用配置的氢氧化钠溶液滴定。在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液呈粉红色。每1mL的NaOH 滴定液(0. lmol/L)相当于20. 42mg的邻苯二甲酸氢钾。根据NaOH溶液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的用量，计算出NaOH滴定液的浓度。

2. 1 %酚酞指示剂

称取1.摊酚酞，加人到100mL 50%的乙醇溶液中溶解。

实验步骤

(一)提取

称取混合均匀的果蔬样品10.g(或吸取10. 0mL汁液)，置于研钵中磨碎，转移到100mL容量瓶中，再用蒸馏水冲洗研钵，一并转人到容量瓶中，并定容至

刻度，摇匀。静置30min后过滤。

(二)测定

吸取20. 0mL滤液，转人三角瓶中，加人2滴1%酚酞指示剂，用已标定的氢氧化钠溶液进行滴定。滴定至溶液初显粉色并在0. 5min内不褪色时为终点(pH=8.1~8.3)，记录氢氧化钠滴定液的用量，重复三次。再以蒸馏水代替滤液进行滴定，作为空白对照。

实验结果与计算

重复

次数

样品

质量

m/g

提取液

总体积

V/mL

所取滤

液体积

V S/mL

NaOH溶液

浓度

c/( moL/L)

NaOH溶液消耗量/mL

折算

系数

?

可滴定酸含量/%(质

量分数)

测定（V1）空白（V0）计算值

平均值±

标准偏差1

2

3

根据NaOH滴定液消耗量，计算果蔬组织中可滴定酸含量，以质量分数(%)表示。计算公式:

式中V—样品提取液总体积，mL；

V S—滴定时所取滤液体积，mL；

c—NaOH滴定液浓度，mol/L；

V1—滴定滤液消耗的NaOH溶液体积，mL；

V0—滴定蒸馏水消耗的NaOH溶液体积，mL ；

m—样品质量，g；

?—折算系数，g/mmol。

折算系数，即在反应过程中中和1 mmol氢氧化钠所需的有机酸的质量。果蔬中含有的有机酸种类较多，在计算可滴定酸含量时只需按照其中主要的有机酸进行折算即可。果蔬组织中常见的有机酸及其折算系数如下:

苹果酸一一0.067(苹果、梨、桃、杏、李子、番茄、葛首);

柠檬酸一一0.064(柑橘类);

酒石酸一一0.075(葡萄)。

注意事项

(1)一些果蔬中含酸量较少，利用0. 1 mol/L NaOH溶液进行滴定时，NaOH 溶液消耗的体积过小，容易引起较大的误差。在实际操作过程中，可以将NaOH 滴定液适当稀释后使用。如利用0. 05mol/L甚至0.01 mol/L的NaOH溶液进行滴定。

(2)可滴定酸含量计算公式中的V0为三次空白测定的平均值。

乙醇含量

原理

蒸馏分离乙醇，在硫酸介质中，用重铬酸钾氧化，然后在指示剂-菲绕啉亚铁盐的存在下，用硫酸亚铁铵滴定过量的重铬酸钾即可得到果实乙醇含量。

材料、仪器设备

1、材料：果蔬产品

2、试剂。

（1）浓硫酸。比重1.84mg/mL。

（2）硫酸溶液。硫酸:水=1∶1,比重1.49。

（3）氢氧化钙悬浮液。110～112g氧化钙于1L水中消和而成。

（4）42.572g/L重铬酸钾溶液。每毫升此溶液相当于0.01g乙醇。

（5）1.372g/L高锰酸钾(GB 643)溶液。10毫升该溶液相当于1mL硫酸亚铁铵溶液。（6）硫酸亚铁铵溶液〔(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O〕。170.2g六水合硫酸亚铁铵溶于水,加入20mL硫酸(3.1)用水定容至1L。加入2片铝片稳定。2mL该溶液相当于1mL重铬酸钾溶液

（7）邻二氮菲亚铁溶液。溶解0.695g七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)于100mL水中,加1.485g一水合邻二氮菲并加热以助溶解。

3、仪器设备

（1）蒸馏装置：500mL烧瓶上装有一分馏柱及冷凝管，冷凝管末端渐细，延伸部分长度应足以达到100mL容量瓶之底部。蒸馏装置应达到以下要求：10.0％乙醇/水混合液经过蒸馏乙醇浓度起码为9.98％，即在蒸馏过程中乙醇的损失不得超过0.02％。

（2）加热装置：不得使烧瓶中的可提物有任何分解。

（3）容量瓶、移液管、酸式滴定管、具塞锥形瓶、组织捣碎机、分析天平分析步骤

1、试样制备

（1）固体或浓稠样品(水果、蔬菜、罐头制品等)将样品机械捣碎，仔细混合均匀，冷藏样品要在密封容器中预先融化，样品融化过程中出现的液体，在混合样品以前，要加到样品中并混匀。注意在处理过程中不要让样品发热，且取量应足以进行两个平行测定。

（2）液体样品样品需充分混合，取量应足以进行两个平行测定。

2、试样的称量：称取一定量(准确至0.01g)或量取一定体积的制备好的样品,该量应使100mL馏出液中收集的乙醇量少于1g。

注意：样品处理完要及时测定，尤其是罐头制品开封后要马上测定，不然乙醇含量变化很大。

3、测定

（1）蒸馏：用最多180mL水将样品定量转移到蒸馏装置的烧瓶中。加入氢氧化钙悬浮液(用时摇匀)使烧瓶中的试样略呈碱性(pH约为8)。加入玻璃珠或瓷片以控制沸腾速度。在100mL容量瓶中加入10mL水并插入冷凝管,使其延伸部分的末端浸入水中。控制沸腾程度，使馏出液的温度为15～20℃。收集80～85mL馏出液,用水冲洗延伸部分，停止蒸馏。用水定容并摇匀。

（2）氧化：准确量取一定体积(V1)的重铬酸钾溶液和20mL硫酸溶液置于250mL 具塞锥形瓶中，摇匀。准确量取一定体积(V0)馏出液置上述锥形瓶中，用1滴浓硫酸润湿瓶塞并盖好瓶塞，振摇，反应不少于30min，其间不时摇动。所得混合液应不呈绿色，如呈现绿色，说明试样中乙醇含量过高，应减少馏出液的取样量重新氧化，必要时可将蒸馏与氧化时的试验样品一并减少。

（3）滴定：用硫酸亚铁铵溶液滴定过量的重铬酸盐。过量的重铬酸盐应不少于空白滴定中重铬酸盐用量的20％。滴定过程中每次滴加后均需摇动烧瓶，当试液颜色变为蓝绿时，加入4滴邻二氮菲亚铁溶液，继续滴加硫酸亚铁铵溶液，直至溶液由蓝绿色变为棕色，记下消耗滴定液体积(V2)。若滴定过了终点，可用高锰酸钾溶液准确的回滴至终点，由所用的硫酸亚铁铵溶液的体积减去所用高锰酸钾溶液体积的1/10，此差值即为(V2)。

（4）用同一制备好的样品做两个平行测定。

4、空白滴定：用等体积的蒸馏水代替馏出液，在同样的滴定条件下，进行空白滴定，所消耗的硫酸亚铁铵溶液的体积为V3。氧化时可适当加入一定体积的蒸馏水以使得滴定时终点明显。空白滴定时溶液的总体积要与试验部分总体积相同,以减少滴定误差。操作者也可根据情况,在滴定时选择以下指示剂:1mL 正磷酸(85％)比重1.71加1mL 浓度为0.5g/100mL 的二苯胺磺酸钡溶液。

5、计算方法与公式

（1） 固体样品：乙醇含量表示为g/100g ，按式(1)计算为

m

V0 V3100 100 V2)-(V30.01V1 (g/100g)????=?=乙醇 式中

m ——为试样质量 g;

V0——用于滴定的馏出液体积,mL;

V1——为氧化时所用重铬酸钾溶液体积,mL;

V2——为回滴重铬酸盐所用硫酸亚铁铵溶液的体积,mL;

V3——为空白滴定所用硫酸亚铁铵溶液的体积,mL 。

（2） 液体样品

乙醇含量表示为g/100mL ，按式(2)计算

V4

V0 V3100 100 V2)-(V30.01V1 (g/100mL)????=?=乙醇 式中:V0、V1、V2、V3——意义同5.2

V4——为试样体积,mL 。

相对电导率

基本原理

果蔬细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。细胞膜具有选择透过性功能，果蔬细胞之间以及细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。果蔬组织后熟衰老过程中，细胞质膜功能活性下降，膜通透性增加，出现细胞内电解质向外渗漏。果蔬组织在受到不良环境胁迫时，如高温、低温、振荡伤害或病原菌侵染时，细胞膜的完整性和功能也会遭到不同程度的损伤，往往表现为膜透性增加和电解质外渗(主要是钾离子)速度加快。

果蔬组织细胞膜受损伤后，细胞膜内电解质外渗，会引起提取液的电导率增加。通过测定果蔬组织浸提液或外渗液的电导率，可以了解果蔬细胞膜通透性的变化，反映果蔬抗逆性的强弱或受到伤害的程度。一般利用相对电导率表示细胞膜渗透率以及细胞膜受到伤害的程度。

相对电导率(γe )为测试材料活组织提取液的电导率(γ1)与被杀死后提取液的电导率(γ0)的百分比，即:

%1000

1?=γγγ 煮沸杀死果蔬活组织时，果蔬细胞完全破坏，细胞内电解质完全进人浸提液，因此，γe 实际表示在一定时间内，细胞内电解质渗出量占总电解质的百分比。

三、材料及仪器

(一)材料

叶片或果蔬组织，取样部分要避免损伤。

(二)仪器及用具

电导率仪、电子天平、真空干燥器、真空泵、真空压力表、恒温水浴锅、小烧杯(100mL )、大试管、带十字头玻璃棒、不锈钢打孔器、单面刀片、摇床。

实验步骤

(一)取样

对于蔬菜，选取一定部位上生长龄相似的叶子，剪下后，先用纱布拭净，再用打孔器打取相同大小(直径8mm)的圆片，称取2.g 叶肉圆片(要求各样品的圆片数目相同)。

对于果实，用打孔器打取果实(果肉或果皮)组织后，用锋利的刀片将果实组织切成相同厚度(2mm)的薄片，要求均匀一致，尽量减少损伤。称取相同质量(相同数目)的果实圆片。

将圆片置于小烧杯中，加人20mL 去离子水浸泡、振荡10 min ，将水倾去，再用去离子水冲洗3次，最后用干净滤纸吸干圆片上的水分。

(二)测定过程

将组织圆片放人大试管中，并用玻璃棒或干净尼龙网压住，准确加人20. 0mL 去离子水，浸没叶片，放人到真空干燥器中。真空干燥器连接上真空表和真空泵，抽气，以抽出细胞间隙中空气，使去离子水进人细胞间隙。将真空干燥器的压力控制在0. 04~0. 06MPa,真空渗透l0min 。然后，缓缓放人空气，水即被吸人组织中而使圆片下沉。取出大试管，放在摇床上振荡1h ，在20~25℃恒温下，用电导率仪测定溶液电导率。

测定电导率后，将大试管再放人到100℃沸水浴中煮沸15 min ，以杀死果蔬组织圆片。然后取出大试管冷却，至温度降到20~25℃时，再次测定煮沸后的果蔬组织电导率。

实验结果与计算

记录测定结果，按前面的公式计算相对电导率。重复三次，计算平均值和标准偏差。

注意事项

整个过程中，组织圆片接触的用具必须绝对洁净(全部器皿要洗净)，也不要用手直接接触叶片或果实组织，以免污染。测定后电极要清洗干净。此外，温度对溶液电导率的影响很大，必须在相同温度下测定活组织和杀死后组织的电导率。

丙二醛含量

基本原理

果蔬组织在后熟衰老过程中，遭受病害、冷害或其他伤害等逆境胁迫时，细胞中产生的超氧阴离子自由基和羟基自由基，能诱导膜脂中不饱和脂肪酸发生过

氧化作用，产生脂质自由基。脂质自由基可进一步诱发膜脂的过氧化作用，导致细胞膜透性增加，细胞受到损伤或死亡。丙二醛( malondialdehyde , MDA)是膜脂过氧化作用的主要产物之一，通常利用它的含量作为脂质过氧化指标，反映细胞膜脂过氧化的程度。MDA 可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或使之产生交联反应，从而丧失生物功能。MDA 还可以使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA 的积累能对果蔬细胞质膜和细胞器造成一定的伤害。

在高温、酸性条件下，MDA 能与硫代巴比妥酸(TBA)发生反应形成红棕色的三甲基复合物(3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮)，该复合物在波长532nm 处有最大光吸收。然而，果蔬组织中存在的可溶性糖类物质对MDA-TBA 反应有干扰作用。糖与TBA 显色反应产物的最大吸收波长在450nm ，在532nm 处也有光吸收。为消除这种干扰，可用下列经验公式消除由蔗糖引起的误差，

45060053256.0)(45.6)/(OD OD OD L umol c ?--?=

式中OD 450、OD 532、OD 600—分别代表450nm,532nm,600nm 波长处的吸光度值。 运用上式可直接求得果蔬组织提取液中的MDA 浓度，从而进一步计算出果蔬组织中MDA 的含量。

材料、仪器及试剂

(一)材料

黄瓜、香菜等。

(二)仪器及用具

研钵、试管、移液器、恒温水浴锅、离心机、分光光度计、电子天平、离心管。

(三)试剂

1. 100g/L 三氯乙酸(TCA)溶液

称取l0g 三氯乙酸，用蒸馏水溶解、稀释至100mL 。

2. 6.7g/L 硫代巴比妥酸(TBA)溶液

称取0.67 g 硫代巴比妥酸，用100mL 0.05mol/L NaOH 溶液溶解。

实验步骤

称取1.0g 果蔬样品，加人5.0mL 100g/L TCA 溶液，研磨匀浆后，于4℃,10000 xg 离心20min ，收集上清液，低温保存备用。

取2. 0mL 上清液(对照空白管中加人2. 0mL 100g/L TCA 溶液代替提取液)，加人2. 0mL 0. 67% TBA,混合后在沸水浴中煮沸20min ，取出冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm,532nm 和600nm 波长处的吸光度值。重复三次。

实验结果与计算

1.测定数据记录

2.计算结果

根据溶液吸光度值，按照前面的公式计算出反应混合液中丙二醛含量，再按照下式计算出每克果蔬样品(鲜重)中丙二醛的含量，以μmol/g m F表示。计算公式:

式中c—反应混合液中丙二醛浓度，μmol/L ;

V—样品提取液总体积，mL ;

V S—测定时所取样品提取液体积，mL;

m—样品质量，g。

注意事项

(1)在测定可溶性糖含量较高果蔬组织中的丙二醛时，测定结果容易受到糖的影响，测定结果甚至出现负值。因此，在具体测定时，需要进行预实验，确定适宜的条件。

(2)测定过程中，需在同一台分光光度计上分别在波长450nm,532nm和

600nm处进行测定。

多酚氧化酶（PPO）

基本原理

多酚氧化酶( polyphenol oxidase , PPO)是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。

材料、仪器及试剂

(一)材料

梨、苹果、马铃薯等。

(二)仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶(100mL,1000mL)。

(三)试剂

1、0. lmol/L、pH 5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液

母液A ( 200mmo1/L醋酸溶液):量取11. 55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000mL。

母液B ( 200mmo1/L醋酸钠溶液):称取16. 4g无水醋酸钠(或称取27. 2g三水合乙酸钠)，用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68 mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5. 5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2、提取缓冲液(含lm MPEG,4% PVPP和1 % Triton X-100)

称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000),4g PVPP(聚乙吡咯烷酮，polyvinyl 一poly-pyrrolidone)，取1mL Triton X -100，用0. lmol/L pH 5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3、50mmol/L邻苯二酚溶液

称取275 mg邻苯二酚，用0. 1mo1、pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释

至50mL 。

实验步骤

(一)酶液制备

称取5.0g 果蔬组织样品，置于研钵中，加人5.0mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃ ,12 000 x g 离心30min ，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

(二)活性测定

取一支试管，加人4.0mL 50mmol/L 、pH 5. 5的乙酸-乙酸钠缓冲液和1.0mL 50mmol/L 邻苯二酚溶液，最后加人100 μL 酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒人比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s 时开始记录反应体系在波长420nm 处吸光度值，作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。

实验结果与计算

记录反应体系在420nm 处的吸光度值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分(从时间I 到时间F)计算每分钟吸光度变化值△OD420。

I

F I F t t OD OD OD --=?420420420 式中△OD 420—每分钟反应混合液吸光度变化值;

OD 420F —反应混合液吸光度终止值;

OD 420I —反应混合液吸光度初始值;

t F —反应终止时间，min;

t I —反应初始时间，min 。

以每克果蔬样品(鲜重)每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位，单位是 ΔOD 420/min ·g 。计算公式:

m

V V OD U S ???=420 式中V —样品提取液总体积，mL ;

V S —测定时所取样品提取液体积，mL;

m —样品质量，g 。

多酚氧化酶活性还可以每分钟反应体系在波长420nm 处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位，单位是△OD 420 /min ·mg 蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。

注意事项

应进行预实验，测定每分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化(初级反应)的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值(OD0 )和最终值(OD1)这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。

过氧化物酶（POD）

基本原理

过氧化物酶( peroxidase , POD)是果蔬体内普遍存在的一种重要的氧化还原酶，它与果蔬的许多生理过程和生化代谢过程都有密切关系。在果蔬的生长发育、成熟衰老过程、抗病、抗氧化、抗逆境胁迫中，过氧化物酶活性不断发生变化。在受到外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境变化、加工条件改变等作用时，果蔬组织中过氧化物酶活性都会做出相应的应答反应。

过氧化物酶催化过氧化氢(H202)氧化酚类物质产生醌类化合物。这些化合物进一步缩合，或与其它分子缩合形成颜色较深的化合物。在过氧化物酶催化作用下，过氧化氢能将愈创木酚(邻甲氧基苯酚)氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色，在470 nm处有最大光吸收，故可通过比色法测定过氧化物酶的活性。

三、材料、仪器及试剂

(一)材料

各种水果和蔬菜。

(二)仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、秒表、移液器、离心管、试管、容量瓶(50mL,100mL,1000mL)。

(三)试剂

1、0. lmol/L,pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲液

母液A ( 200mmoL/L醋酸溶液):量取11. 55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000mL。

母液B ( 200mmo1/L醋酸钠溶液):称取16. 4g无水醋酸钠(或称取27. 2g三水合乙酸钠)，用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68 mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5. 5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2、提取缓冲液(含1mmoLPEG,4% PVPP和1 % Triton X-100)

称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000),4g PVPP(聚乙吡咯烷酮，

polyvinyl-poly-pyrrolidone)，取1mL Triton X -100，用0. lmol/L pH 5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3、25 mmol/L愈创木酚溶液

取320 μL愈创木酚，用50mmol/L pH 5. 5乙酸缓冲液稀释至100mL。

4、0. 5 mol/L H202溶液

取1.42mL 30% H202溶液(30% H202溶液的浓度约为17. 6mo1/L)，用

50mmol/L pH 5. 5乙酸缓冲液稀释至50mL，现用现配，避光保存。

实验步骤

(一)酶液制备

称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加人5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000 x g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低

温保存备用。

(二)活性测定

取一支试管，加人3.0mL 25mmo1/L 愈创木酚溶液和0. 5 mL 酶提取液，再加人200 μL ，0. 5 mol/L H 202溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒人比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s 时开始记录反应体系在波长470 nm 处吸光度值，作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。

实验结果与计算

记录反应体系在470 nm 处的吸光度值，制作OD 470值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD 470。

I F I F t t OD OD OD --=?470470470 式中△OD 470—每分钟反应吸光度变化值；

OD 470F —反应混合液吸光度终止值；

OD 470I —反应混合液吸光度初始值；

t F —反应终止时间，min;

t I —反应初始时间，min 。

以每克果蔬样品(鲜重)每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位，单位是△OD 470 /min ·g 。计算公式:

m

V V OD U S ???=470 式中V —样品提取液总体积，mL ;

V S ——测定时所取样品提取液体积，mL ;

m —样品质量，g 。

过氧化物酶活性还可以每分钟反应体系在波长470 nm 处吸光度值读数变化增加1所需的酶量为1个活性单位，单位是△OD 470 /min ·mg 蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。即:

c

V OD U S ??=470 其中，c 表示酶提取液中蛋白质含量(mg/mL)。这里所计算的实际上是酶的比活力，有利于减少操作过程带来的误差。

注意事项

(1)应进行预实验。测定每分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化(初级反应)的时间段。这样，只测定某一段时间内反应液的初始吸光度值( OD I)和最终值(OD F)这两个数据，就可以计算出每分钟吸光度值的变化量。

(2)利用0. lmol/L,pH 6.0磷酸钠缓冲液(配制方法见附录1)作为提取液，可以提取多数果蔬组织中过氧化物酶。

(3)在提取缓冲液中加人PEG,PVPP和Triton X-100等是为了提高酶蛋白的溶解性，减少提取过程中酶活性的损失。这些物质的具体作用可以参阅本书第一篇相关内容。

Vc含量：2，6－二氯靛酚法

原理：还原型抗坏血酸能还原染料2.6-二氯酚靛酚（2.6-D），该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2.6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2.6-二氯酚靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

试剂与仪器设备

（1）1％HCl

（2）2％草酸溶液：溶解20克草酸结晶于200毫升水中，然后稀释至1000ml。

1％草酸溶液：取上述2％草酸溶液500ml，用水稀释至1000m1。

（3）NaHCO3

，（4）1％淀粉溶液，（5）碘化钾。

（6）0.1N碘酸钾溶液：精确取干燥的碘酸钾0.100ml。0.3567克用水稀释至100ml. （7）抗坏血酸标准溶液：准确称取50mg抗坏血酸，溶于1％草酸溶液中，移入250ml量瓶中，并用1％草酸溶液稀释至250毫升，

（8）2.6-D溶液：称取碳酸氢钠52mg，溶于200ml沸水中，然后称取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氢钠的溶液中，待冷，此液应贮于棕色瓶中并冷藏. 标定方法：取5m1抗坏血酸标准溶液于50ml三角瓶，加入1％草酸溶液5滴以及5-10mgKI，摇匀，用0.001mol/L的KIO3溶液滴定滴定至溶液呈淡蓝色于15秒不褪色为止。另取5m1抗坏血酸标准溶液于50ml三角瓶，用的2，6-D溶液滴定至溶液呈粉红色

溶液的浓度（T）= ( V1×0.088)/V2

V1：滴定时所耗0.001N碘酸钾标准溶液的量(ml)

V2：所取2，4-D的量(ml)

0.088：lml 0.0001N碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量(mg／mL) 仪器设备组织捣碎机、三角瓶、容量瓶、小烧杯、移液管

实验步骤：

称取0.5g样品，加等放入研钵中，加入约10ML1%HCl研磨，将提取液虑入50ml 容量瓶中，反复提起三次，最后用量1%HCl 定容至刻度。摇匀然后迅速吸取5～10mL滤液，置于50mL三角瓶中，用标定过的2，6－二氯靛酚染料溶液滴定，直至溶液呈粉红色于15s内不退色为止。

为了检查试剂是否洁净，必须测定用来提取样品的1%HCl的还原力，为此5mL2%HCl作为空白，按同上方法进行滴定。所得值从滴定提取液的结果中减去，根据实际消耗2，6-D的量来计算抗坏血酸的量

计算：

抗坏血酸含量(mg/100g)=100)(2

10???-V V M T V V V ：滴定时所耗去染料溶液的体积(mL)

V 0：滴定空白时所耗染料的体积(mL)

V 1：样品处理液体积(mL)

V 2：测定用样品液体积(mL)

T ：1mL 染料溶液相当于维生素C 标准溶液的质量(mg) M ：滴定时所需的滤液中含样品量的质量(g)