盐酸小檗碱对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞PGE2COX2表达的影响
现代医院２００８年１２月第８卷第１２期专业技术篇ＭｏｄｅｍＨ０８ｐｉ“Ｄｅｅ２００８Ｖｏｌ８Ｎ０１２
盐酸小檗碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４。７细胞
ＰＧＥ２、ＣＯＸ一２表达的影响
毛秋娴龙启才
ＴＨＥＥＦＦＥＣＴＳＯＦＢＥＲＢＥＲＩＮＥＯＮＰＧＥ２ＡＮＤＣＯＸ－２ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＩＮＬＰＳ—ＩＮＤＵＣＥＤ
ＲＡＷ２６４．７ＣＥＬＬＳ
ＭＡＯＱｉｕｘｉａｎ，ＬＯＮＧｇ∞ｉ
【攘豢】爱黪酝究蓝鳇小蔡碱对鼹多耱（ＬｅＳ）谤导螃，ｊ、最ＲＡＷ２６４．７巨噬魏憩盛教蝣皴砖影瞬，探鸯燕羧，｛、蘩碱醣藐炙锋蕉羁理。穷法ＭＴｒ法测髭簸黢，争襞碱砖璐蘩导酌夺燕ＲＡＷ２６４．７蔽噬缎戆生长毽疆戆彩喃；跨袋免疫法（ＥＬＡ）裣涮釜酸小黎减黪瓣毪生成秘影疃；逆转裹聚合酶链麓庶（１联一ｒＣＲ）裣羲ＣＯＸ一２ｍＰ蠛Ａ的表逮；蛋白印迹法（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）检演ＩＣＯＸ一２的蛋白袁迭。结暴藏黢小黎碱对￡鹅诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞有生长增殖抑制忭用；盐酸小檗碱抑制ｕ焉诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞
Ｈ；Ｒ的崴成；Ｏ－是对ＣＯＸ一２ｍＲＮＡ及ＣＯＸ一２赞白表达均元明显影响。结论盐酸小紫碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞有生长增殖抑制作用，熊酸小檗碱不是通过抑制ＣＯＸ一２生成的浚径来影响Ｐ（冯的生成的。
【麓键词】盐酸小檗碱环氧合酶一２前列腺常Ｅ脂多耱
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓ￡岫ｔｈｅｅｆｆｅｃｔ。ｆｂｅｒｂｅｔｌｎｅｏｎ瞄ａｎｄＣＯＸ一２ｅｘｐｒｅＭｉｏｎｉｎ瞒一ｉｎｄｕｃｅｄ
ｌ渔礅６毒．７ｃｅｌｌｓ。ＭｅｔｈｏｄｓＡｆｔｅｒｂｅｉｎｇｐｒｏｃｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎ∞＂ｎｔｎｇｉｏｍｏｆｋ捌ｎｅｆｏｒ２ｈ。ａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｕ－ｂａｔｅｄｗｉｔｈＩｍｇ／ＬＬＰＳｆｏｒ９ｈ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＩｘａ－ｂｃｆｉｎｅＯｎｔｌｍｐｒｏｄｕｃｔｏｆ％＆ｉｎＢＡＷ２６４．７ｃｅｌｌｓ黼ｍｅａｓｕｒｅｄ玲蝴ｅｉｍｍｕｎｏｔ瞎ｓａｙ（Ｅ王舂）．ＴｈｅｎＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ∞Ｘ一２ｉｎＲＡＷ２６４．７ｃｅｌ．ｋ娜ａｎａｌｙｚｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．ＴｈｅＧＯ涎一２ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＲＡＷ２６４－７ｃｅｌｌｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｈＷｔ器ｔＣｒｌｌｂｌｏｔｔｉｎｇ。ＲｅｓｕｌｔｓＢｅｒｂｅｒｉｎｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅＰＣＦ≈ｓｙｍｈｅｓｉｓｉｎＲＡＷ２５４?７∞ｌｌＢ．‰砸搬峨ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ一２ｉｎＲＡＷ２６４。７ｃｅｌｌｓｗｔ！ｒｃｎｏｔａｌ－ｔｅｒｅｄｂｙｂｅｒｂｅｒｉｎｅ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＢｅｒｂｅ６ｎｅｃ姒ｎｏｔｉｎｋｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ一２ｉｎＰＣＥ，ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙ．【ｌ【蚶ｗｏｒｄｓ】Ｂｅｒｂｅｆｉｎｅ，ＣＯＸ－２，ＰｒｏｓｔａｇｈｎｄｉｎＥ２，ＬＰＳ
【Ａｕｔｈｏｒ’ｓａｄｄｒｅｓｓ】ｃｈｅｎ】【ｉｎｇｌ“Ｈｏｓｐｉｔａｌｏｆ２ｈｏｎｇＢｈａｎＣｉｔｙ，ＧｕｓｎｓｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ５２８４１５ＰＲＣ
小綮碱（Ｂｃｒｂｅｒｌａｅ，Ｂｅｔ，又称黄连裹）为毛茛科黉遴属植物黄连鹩授蒸中提取的主要成分，是扶黄连、黄撼审提取或入王会裁鹣一耱舅瞳熬类生耪碱，是一餮应震掰受悠久戆捷炎孛嚣掇敬耱，遥寒骚突表鹱盐酸枣檗藏其骞辫廒耱、藏耱瘸、抗炎、免疫调节等多种作震。有簪｝究表明蕊酸小檠碱懿抗炎作孀与其抑制炎症奔质的释放有关。本文溉祭了盐酸小檗碱对脂多糖诱导的ＲＡＷ２６４．７细胞前列腺索Ｅ（ＰＧＥ２）合成的影响，及其对ＰＧＥ２合成途径中关键酶环裁含酶（ＣＯＸ一２）袭选的影响，以便进一步探讨盐酸小檗碱的抗震机理。ｌ材料嚣方法
１．１药茹及试荆
觳黢小繁碱《纯度９８％）购自天津海光药厂；麟多糖为
毒皲娥：枣凌枣薮差海嚣藐广衷孛出５２８４１５
意意考：串瓣天学药擎浣广东广髑５１００８０Ｓｉｇｍａ产晶；小牛血清为槐州四拳学生物工程公司产品；ＰＧ砭酶联兔疫试剂窳灸戴淡中美辩技有限公司产品；惹Ｐｄ≮ＩＡｔｒｉｐｕｒｅ擒疆取试麴窳兔Ｇｉｂｃｏ产品；§一ａｇａｉｎ氆莩趋：Ｇ多宽隆撬漆、ＣＯＸ一２逡繁耘移多竟隆筏薅均麦嚣衮孛氆公司产瑟。
１．２实验方法
１．２．１细胞培养ＲＡＷ２６４．７细胞（小鼠单核／巨噍细胞系）购自中山大学北梭暇动物中心，在３７℃、５％ＣＯ＝条件下，用含１０％小牛血｛ｉ警、衡艨索（１×１０５Ｕ／Ｌ）及链霉素（１００ｍｇ／Ｌ）的ＤＭＥＭ培养液传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。
１．２．２细胞生长增殖试验（采用艄－ｒ法）取对数生长期鹣爨骓，按５×１０４／魏予２００赫菠孛接静于９６魏板，在３７＂Ｃ、５％Ｃ０：条终下避蔽薅，熬入零嚣浓度戆盐酸枣囊簇，霹嚣维鸯羹入藤交薅获戆ＰＢＳ，簿缝设３令乎每琵。蕊秘熬大
万方数据
２ｈ后再加入终浓度为ｌ“ｇ／ｔｎｌ的ＬＰＳ，继续培养９ｈ，然后每孔加入２０出ＭＴＴ（５ｍｇ／ｎ１１），继续培养４ｈ。倾去培养液，每孔加入１５０山ＤＭＳＯ溶解，以测定波长为５７０蛐，参考波长为４５０ｎｍ于酶标仪测定其吸光度，重复３次。根据公式计算抑制率：细胞生长增殖抑制率（％）＝（１一处理组的吸光度／对照组吸光度）ｘ１００％。
１．２．３ＰＣ；Ｅ２含量测定将对数生长期的ＲＡＷ２６４．７细胞接种于６孔培养板中，设空白对照组、ＬＰＳ处理组、及１０，５０和１００ｌｕｎｏｔ／Ｌ盐酸小檗碱处理组。药物加人２ｈ后再加入终浓度为１Ｖ．ｇ／ｍｌ的ＬＰＳ，继续培养９ｈ，收集细胞培养液，以ＰＧＥ：ＥＩＡＫｉｔ测定其中的ＰｃＥ２浓度，每组重复３次。１．２．４ＲＴ—ＰＣＲ检测ＲＡＷ２“．７细胞中ＣＯＸ一２ｍＩ姒的表达设组同上，分别在ＲＡｗ２“．７细胞中加入盐酸小檗碱孵育２ｈ后再分别加入终浓度为１懈／ｍｌ的ＬＰｓ（空白对照组除外），继续在３７＇Ｅ、５％ＣＯ：培养箱中培养９ｈ后取出。用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细胞的总ＲＮＡ，按一步法试剂盒步骤进行ＲＴ—ＰＣＲ。ＰＴ—ＰＣＲ引物设计参照文献…：引物序列ＣＯＸ一２为：正义引物为５’一Ｃ，ＧＧＡＡＧＣＣＴｒＣＴＣＣＡＡＣＣ一３’，反义引物５’一Ｇ从ＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴｃＣ，Ｃ＇ＩＴ一３’，产物长度２４５ｂｐ；内参照物选用ＧＡＰＤＨ：正义引物为５’一ＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴ－ＴＣＣＡＧＣＡＧＣＧ一３’，反义引物引物５’一ｃＡＧＧＧＧｃｃＡｒｃ－ＣＡＣＡＧＴＣＴｒＣ一３’，产物长度３５７ｂｐ。ＣＯＸ一２的反应条件为：５０℃逆转录３０ｒａｉｎ，９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃变性４５８，５６℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸ｌｍｉｎ，扩增３０个循环；７２。Ｃ延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物１．５％琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照。１．２．５Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＲＡＷ２６４．７细胞中ＣＯＸ一２蛋白的表达细胞处理同上，细胞裂解液裂解细胞后提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量。每组各取５０｝ｔｇ蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行１０％ＳＤＳＰＡＧＥ；电转闭２ｈ；分别加入适量ＣＯＸ一２和Ｂ—ａｃｔｌｎ多克隆抗体，摇床上室温反应２ｈ；洗膜３次，每次２ｍｉｎ；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应２ｈ；洗膜后作ＥＣＬ化学发光，ｘ片曝光显影。
１．３统计学方法
所有数据以ｉ±－表示。所有数据使用ＳＰＳＳ统计软件包进行分析，ｐ＜０．０５认为差异有统计学意义。
２实验结果
２，１盐酸小檗碱对小鼠ＲＡＷ２“．７细胞生长增殖的影响ＭＴｒ结果表明不同浓度（５—１０００｝ＬＩ，ｎｏｌ／Ｌ）的盐酸小檗碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７细胞的生长有抑制作用，这种抑制作用与盐酸小檗碱对细胞作用的浓度及时问有关。盐酸小檗碱的浓度越高，作用时间越长，对细胞的抑制作用越强，见表１。
２．２盐酸小檗碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２５４．７细胞产生ＰＧＥ＇浓度的影响
当盐酸小檗碱的浓度为１０、５０、１００ｔｔｍｏｌ／Ｌ时，显著性抑制小鼠ＲＡＷＲ６４．７细胞的ＰＧＥ２的生成，与ＬＰＳ组（模型组）的ＰＣＥ２浓度（９６０．６７±７６．８５）ｐｇ／ｍｌ有显著性差异。阳性对照组消炎痛组（Ｏ．１２５斗ｍｏｌ／Ｌ）明显降低ＰＧＥ：的浓度，与ＬＰＳ组相比具有显著性差异，见表２。
表１不同浓度小檗碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７
巨噬细胞增殖的抑制作用（％．ｉ．４－ｓ，ｎ＝３）
注：ＬＰＳ（脂多糖）：浓度均为１ｍｇＪＬ；不同浓度组与ＢＨ０比较：１’，＜０．０５；不同浓度组与消炎痈０．１２５比较：２’ｐ＜０．０５；ＢＨ表示盐酸小檗碱，ＢＨ０表示盐酸小檗碱的浓度为０ｌａｍｏｌ／Ｌ，ＢＨ５表示盐酸小檗碱的浓度为５岬ｏｌ／Ｌ，下同
裹２小檗碱对小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞产生
ＰＧＥ２的影响（ｐｇ／ｎｄ．ｉ±ｓ．ｎ＝３ｌ
注：１）各组懈．ＬＰＳ：ｐ‘Ｏ．Ｏｌ；２’懈．消炎痛：ｐ＜ｏ．０５
２．３盐酸小檗碱对Ｉ腮诱导的小鼠ＲＡｗ２６４．７细胞ＣＯＸ一２ｍＲＮＡ表达的影响
消炎痛在ＲＮＡ水平抑制ＣＯＸ一２的表达。但是不同浓度的盐酸小檗碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞产生的ＣＯＸ一２的表达没有抑制作用，提示盐酸小檗碱对ＣＯＸ一２的基因转录水平无影响，见图ｌ。
圈Ｉ不同浓度小檗碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７
巨噬细胞ＣＯＸ一２ｍＲＮＡ表达的影响
Ｍ：ｍｍ＇ｋｅｒ；１：对照组；２：１ｍ∥ＬＬＰＳ刺激组；３：阳性对照；４：／ｂ集碱（１０ｐ．ｍｏｌ／Ｌ）＋ＬＰＳ；５：小檗碱（５０删Ｌ）＋Ｕ垮；６：小檗碱（１∞
ｐ。ｍｄ／Ｌ）＋ＩＹＳ
万方数据
２．４盐酸小檗碱对ＬＰＳ谤导ＲＡＷ２“．７细胞ＣＯＸ一２蛋白表这的雾蟾
嶷白对照组无明显的ＣＯＸ一２蛋白条带。消炎媾处理组的ＣＯＸ－２蛋白寝达萤螭显减少；不同浓度的盐酸小檗碱组的ＣＯｘ一２蛋自表达量嚣职照变化。维果表明盐酸小爨碱对鹏诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞产难的ＣＯＸ一２懿蛋鑫表达凭影璃，凳图２。
田２不阿浓度盐酸小集碱对小飘从Ｗ２６４．７
Ｅ鏖镪貔ＣＯＸ一２翟囊表迭瓣彩薅
１：对照组；２：ＬＰｓ（脂多糖）１ｍ∥Ｌ刺激组；３：阳性对照组；４：小繁碱（１ｅ删Ｌ）＋ｌ鹈；５：尽菜碱（鼹ｊＬｍｏｔ／Ｌ）＋ｌ於；６：小禁碱（１００舯１ｄ／Ｌ）＋Ｉ飓
３讨论
在本实验孛不麓滚度（５一ｌ０００ｔａ，ｍｏＶＬ）薛盐酸夺絮碱对ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞的生长增殖穗抑制作用，细胞抑制率璧时阃帮莉量依赖性，随着毓酸小巢碱浓度约增搬，堵莠对阅的延长，缨赡翔刳窭增如。当其浓度丈于ｌｏｏＩＬｍ彬Ｌ时，盐酸小檗碱对１２＂３诱导的小鼠ＲＡｗ２６４．７匿嚷缀瞻表褒窭甓燕麴捧销箨焉，纲窿鹣形态发生爨鬟静交化，出现核浓缩，靠边甚至核破裂。因此选取了１０、５０、１００ｉｓｍｏＶＬ作为实验浓度。
近来班究表爨旌酸，』、撰碱具寿痒壶攘、抗黪癌、抗炎、免疫调节等多种作用。对于盐酸小檗碱的抗炎分子机理，纪桂赞等发瑶鏊羧乐襞碱霹潞诱簿熬枣簸结瑟炎有效。乐襞碱星时间、剂量依赖性抑制组织ＣＯＸ一２ｍＲＮＡ和蛋臼的表达【２】。小鬃藏发挥抗炎散应，熊抑制斑管损伤后炎瘫因子的表达，其挽炎机瑷包括遗过抑制ＡＰ一１调节Ｐｃ毪翻ＣＯＸ一２的表达【３ｊ。吕燕宁认为‘４ｌ小檗碱抑制了ＩＦＮ一叭ＩＬ一１、搿Ｆ—ｏＩ、ＩＬ一２等缨魏瓣子鹃产生蠢分泌，扶褥｛牵弱免疫反应，减轻炎症损伤，故有抑制小鼠迟发墅超敏反应（ＤＴｔｔ）
的作用。
峨蹩强热簸酶终爆于兹熊四燎羧后的主要产物之一，怒与炎症、细胞生长、刨伤愈合等过程密切相关的重要奔垂，逶遘鑫分泌绒旁分游戆形式发挥其垄勃擘砖麓持。３。在这个实验中盐酸小檗碱浓度为１０、５０、１００ｊＪ，ｍｏＶＬ肘，呈捅量依赖饿影响ＬＰｓ诱簿的，ｊ、鼠ＲＡｗ２６４．７蘸噬缅腕产生翦ＰＧＥ２趣浓度，嬲毪撼度疆裁酸小嫌碱的浓度舞高两降低。
ＣＯＸ又称蘩臻腺素蠹遘氧纯合成薅，基鼹爵究裘臻ＣＯＸ至少存在两种同工酶ＣＯＸ一１和ＣＯＸ一２。ＣＯＸ一２是诱导垄袋纯骜，在生理较提下，绝大部分组绞缨疆审不表迭，但可为多种刺激所诱导，是ＰＧＥ：的重要关键酶。ＣＯＸ一２作为诱导酶，与入类许多疾病的病理过程榴联系，也是许多簸型非甾锩抗炎药物的主要作用靶点。杰这个实验中缀然盐酸小檗碱是浓魔依赖性地抑制１２Ｓ诱导的小鼠ＲＡＷ２醋．７重噬缨蘧产受戆筏羲，爨盐酸夺襞碱鼹ＣＯＸ～２ｍＲＮＡ及ＣＯＸ一２蛋自表达均无明显抑制作用，说明盐酸小桀碱不是通过摊箭ＣＯＸ一２盼途径来影响ＰＧ黾的生成。蹋戴盐酸小黎碱有可能是通过ＣＯＸ—ｌ的途径来影响ＰＧＥ２的生成；又由于ＣＯＸ一２和ｍＰＧＥｓ—ｌ均为ＰｃＲ诱导酶，生褒条搀下表达镶毽，毽在程炎往缨熬医子等诱导勰餐蘩激下，ＣＯＸ－２和ｍＰＧＥＳ一１表达上调，催化生成大爨的ＰＧＥ２参与炎症的产生［９】，据此理论，，ｊ、檗碱有可髓是通过ｍＰＧＥＳ
—ｌ斡途径来影响ｐＧＥ：辫生成。至予ＣＯＸ—ｌ或旺慢Ｓ—ｌ是否为盐酸小檗碱的作用靶点还需要避一步的实验来谣实。
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２３ｆ３）：１４４一ｌ黪。 万方数据
盐酸小檗碱对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞PGE2、COX-2表达
的影响
作者：毛秋娴， 龙启才， MAO Qiuxian， LONG Qicai
作者单位：毛秋娴,MAO Qiuxian(中山市陈星海医院,广东中山,528415)， 龙启才,LONG Qicai(中山大学药学院,广东广州,510080)
刊名：
现代医院
英文刊名：MODERN HOSPITAL
年，卷(期)：2008,8(12)
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本文链接：https://www.360docs.net/doc/4b18760781.html,/Periodical_xdyy200812003.aspx
诱导性多功能干细胞——产生,发展,应用及展望
诱导性多功能干细胞 ——产生，发展，应用及展望 张博文，杨星九，李玖一，白末* 摘要：在胚胎干细胞研究因伦理道德和免疫排斥问题而受阻的时候，诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cell，以下简称iPS细胞)的横空出世为干细胞研究指明了一条新的方向。近几年来iPS细胞研究取得了许多突破性的进展，其广泛的应用前景更向人们昭示着一个新的时代的到来。本文主要从iPS细胞的发展历程入手，综述了iPS细胞的理论及应用研究的关键进展，并对之后的研究进行了展望。 关键词：诱导性多功能干细胞，胚胎干细胞，病毒，癌变，细胞治疗 Abstract:When the embryonic stem cell research was blocked by ethical issues and immune rejection, induced pluripotent stem cell (hereinafter referred to as iPS cells), turned out for stem cell research indicated a new direction. iPS cells’ research in recent years has made many breakthroughs, prospects for its wide application to remind people of a new era. This article summarizes the theory and application of iPS cells, and the key to progress in the study, from the iPS cells to start the development process, and discussed the study in the future. Key words：induced pluripotent stem cell, embryonic stem cell, virus, Canceration, cell therapy IPS细胞是通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞。iPS细胞的产生可谓干细胞领域的新里程碑。近几年，iPS细胞的研究突飞猛进，本文中结合最新的研究结果，综述了iPS细胞的产生背景、发展历程及其应用前景，并对今后iPS的研究发展进行了客观的展望。 1产生背景 干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。其中胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)更是具有全部的全能性，能够分化成人体内的所有细胞，具有非常广阔的应用前景。 早在上个世纪，人类就已经开始针对干细胞进行研究，试图通过各种不同的方法得到多能干细胞，其中突出的方法有胚胎干细胞（ES细胞）直接植入法；体细胞核转移 ----------------------------------------- *张博文，杨星九，李玖一：资料查阅与论文编写白末：资料查阅与论文整合
遗传学实验指导
遗传学实验指导 实验1 细胞有丝分裂与减数分裂 实验1.1 植物根尖细胞有丝分裂过程的制片与观察 目的要求 学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术；观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化。 实验原理 有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。有丝分裂的目的是增加细胞的数量而使植物有机体不断生长。在有丝分裂过程中，细胞核内的遗传物质能准确地进行复制，然后能有规律地均匀地分配到两个子细胞中去。植物有丝分裂主要在根尖、节间、茎的生长点、芽及其它分生组织里进行。将生长旺盛的植物分生组织经取材、固定、解离、染色、压片等处理即可以观察到细胞内的有丝分裂图象。如若需要进行染色体计数，则需进行前处理，即取材之后采用物理的或化学的方法，阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期。这时，染色体不排到赤道板上，而是散在整个细胞质中。这十分便于对染色体的形态、数目进行观察。 试剂和器材 1材料 均可以大蒜(Allium sativum 染色体数目2n=16)、玉米(Zea mays 染色体数目2n=20)、洋葱(Allium cepa染色体数目2n=16)或蚕豆(V icla faba染色体数目2n=12) 等根尖为实验材料。 2试剂 95％乙醇、冰乙酸、石炭酸品红、l mol／L HCl。 3器材 恒温培养箱、显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、单面刀片、镊子、培养皿、量筒、吸水纸。 操作方法 1生根 植物根尖是植物的分生组织，取材容易，操作方便。植物根尖细胞分裂旺盛，因此，它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。大蒜、洋葱易于在水培、沙培、土培条件下生根。采用水培时要注意在暗处培养，以满足根生长条件，使根系生长旺盛。玉米和蚕豆种子可先用温水浸泡1天之后，再转入铺有多层吸水纸或纱布的培养皿中，上面盖双层湿纱布置于24～26℃温箱中培养，每天换水二次。 2取材 待根长至l.5~2.0 cm时，将根取下。若实验只需观察细胞有丝分裂的过程和各时期的特征，可将根尖直接放入Carnoy固定液(95％乙醇：冰乙酸=3：1)中固定；如果要观察染色体形态和数目，则必须对根尖进行前处理后才能固定。取材和固定必须要在细胞分裂高峰期进行，即分裂细胞占细胞总数最大值时进行，这样分裂细胞比例大，便于选择和观察。 不同的植物在不同的环境条件，其细胞分裂高峰的时间是不同的。大蒜和洋葱的细胞分裂高峰期通常
常用疾病动物模型
常用疾病动物模型 上海丰核可以为广大客户提供各种疾病动物模型定制服务，同时提供相关疾病模型的药物敏感性实验分析服务。 客户只需要提供疾病模型的用途及建模方法的选择，我们会根据客户的具体要求量身定做各种动物模型服务。
小鼠或裸 鼠 加贴近实际（八）心血管疾病模型 1. 动脉粥样硬化（高脂高胆固醇+维生素D喂养）兔高脂、高胆固醇饲喂兔造模，成 膜后血脂变化显著，为伴高血脂 症的动脉粥样硬化 4月血管组织病 理切片染色 2. 主动脉粥样硬化（高脂高胆固醇+主动脉球囊损伤）兔此模型用大球囊损伤加高脂饲 养方法成功建立兔主动脉粥样 硬化狭窄的动物模型，为相关基 础研究提供可靠模型。 2月动物实验模型病理切片展示 一、CCl4诱导的肝脏纤维化 简介：肝纤维化是肝细胞坏死或损伤后常见的反应，是诸多慢性肝脏疾病发展至肝硬化过程中的一个中间环节。肝纤维化的形成与坏死或炎症细胞释放的多种细胞因子或脂质过氧化产物密切相关。CCl4为一种选择性肝毒性药物，其进入机体后在肝内活化成自由基，如三氯甲基自由基，后者可直接损伤质膜，启动脂质过氧化作用，破坏肝细胞的模型结构等，造成肝细胞变性坏死和肝纤维化的形成。通过CCl4复制肝纤维化动物模型通常以小鼠或大鼠为对象，染毒途径主要为灌胃、腹腔注射或皮下注射。 动物模型图. 经过3个月的CCl4注射造模，小鼠的肝脏在中央静脉区形成了比较明显的肝纤维化，中央静脉之间形成了纤维桥接。（Masson染色） 二、CXCL14诱导的急性肝损伤动物模型
简述：CCl4是最经典的药物性肝损伤造模毒素之一，其在肝内主要被微粒体细胞色素P450氧化酶代谢，产生三氯甲烷自由基和三氯甲基过氧自由基，从而破坏细胞膜结构和功能的完整性，引起肝细胞膜的通透性增加，可溶性酶的大量渗出，最终导致肝细胞死亡，并引发肝脏衰竭。根据CCl4代谢和肝毒性机制可复制不同的肝损伤模型，其中给药剂量和给药方法是其技术关键。对于复制急性肝衰竭动物模型，往往采用大剂量一次性灌胃或腹腔注射给药。 图. (A) CCl4注射后0.5 d的HE染色表明CXCL14过表达增加了肝脏组织的嗜酸性变性面积(在照片中用虚线标记)(p < 0.05)。 (B) 1.5天组织样本的HE染色表明CXCL14过表达造成了比对照组更大面积的细胞坏死(p < 0.05)。 (C)同时还造成了中央静脉周围肝细胞中明显的脂肪滴积累。图中P和C分别表示动物模型的门静脉和中央静脉。KU指凯氏活性单位。 细胞凋亡检测结果 TUNEL标记没有显示CXCL14免疫中和小鼠和对照小鼠在凋亡细胞数量上的差异。C0, C1和C2分别是对照组0 d，1 d,和2 d样本，T1
阿尔茨海默病动物模型研究进展
阿尔茨海默病动物模型研究进展 发表时间：2019-09-23T09:21:11.433Z 来源：《医药前沿》2019年22期作者：朱恒延郭燕君（通讯作者） [导读] 阿尔茨海默病动物模型是研究人类阿尔茨海默病发病机制和寻求治疗方法的重要工具。 (嘉兴学院医学院浙江嘉兴 314001) 【摘要】阿尔茨海默病动物模型是研究人类阿尔茨海默病发病机制和寻求治疗方法的重要工具。本文在总结近年来最新研究成果的基础上系统阐述阿尔茨海默病研究中常用的动物模型，为AD的生物性特征和预防研究提供帮助。 【关键词】阿尔茨海默病; 动物模型; 研究进展 【中图分类号】R745 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）22-0010-02 Research progress of animal models of Alzheimer's disease Zhu Hengyan,Guo Yanjun (communications author) Medical College of Jiaxing University, Jiaxing, Zhejiang 314001, China 【Abstract】Animal model of Alzheimer's disease is an important tool for studying the pathogenesis of human alzheimer's disease and seeking for treatment. On the basis of summarizing the latest research achievements in recent years, this paper systematically describes the animal models commonly used in Alzheimer's disease research, providing help for the biological characteristics and prevention of AD. 【Key words】Alzheimer's disease; Animal model; Research progress 阿尔茨海默病是以进行性记忆缺失和痴呆为特征的神经退行性疾病。65岁前发病称早老性家族性痴呆；65岁后发病称迟发的老年性痴呆。典型病理变化为细胞外由β淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)形成的老年斑块，过度磷酸化的tau蛋白组成的神经元纤维缠结［1］。AD分为早发的家族性AD(Familial AD，FAD)和迟发的散发性 AD(Sporadic AD,SAD)。SAD发病机制主要与遗传和环境有关。胰岛素通路和能量代谢障碍、糖尿病，脑外伤，神经炎症反应以及Apo Eε4等位基因等都是AD的危险因素［2］。目前尚无有效安全的治疗AD的方法及药物。科学家们一直试图建立与AD发病机制接近的灵长类动物模型。本文着重探讨与AD相关的转基因动物模型和灵长类动物模型的现状及特点作一综述。 1.AD相关的转基因模型的特点 研究证实多数 FAD患者是由PSEN1突变所致［3］，PSEN1第4～12外显子之间是主要基因突变位点，近年来，研究者们建立了几种AD PSEN1基因突变的转基因模型，包括PSEN1(A246E)[4]、PSEN1(M146L)[4]、PSEN1(M146V)[4]、PSEN1(P264L)[4]、 PSEN1(P117L)[4]、PSEN1-YAC[4]等。研究者们发现携带人PSEN1突变的转基因AD小鼠不能模拟出FAD的典型特征，因此转入人PSEN1基因突变的同时加入PSEN2其他突变基因，用这种方法成功建立了十多种转基因AD小鼠，而且十多种AD转基因小鼠都能能表现出FAD部分神经病理学特征和行为学上的改变。目前AD转基因小鼠是研究阿尔茨海默病发病机理和治疗方面经典的动物模型，但是已知的这些PSEN1转基因模型小鼠同时不能模拟FAD的全部神经行为学和病理学特征。灵长类动物由于在生理结构和生物化学方面与人类高度相似。因此急需建立一种灵长类非人动物模型，探索这种模型是否能够更好的模拟FAD的多种神经行为学及病理学的特征。 2.FAD灵长类非人动物模型研究现状 近十几年来，随着转基因技术进步和灵长类动物转基因技术的发展，使得建立灵长类非人阿尔茨海默病转基因模型成为可能[5]。由于从发病机制上看FAD是由APP或PSEN1、PSEN2突变所致，专家们尝试将结合其他突变基因(PSEN2、APP和 MAPT) 和PSEN1突变来建立FAD转基因灵长类非人动物模型。上述方法在理论上能够模拟出FAD的发病原因和疾病特征，而且可以通过遗传保种，在建立模型动物群体方面表现出优势。但是灵长类非人阿尔茨海默病转基因动物模型面临严峻的问题：（1）转入AD致病基因的灵长类非人转基因动物通常需十几年才呈现AD特征性的神经病理学和行为学改变，灵长类动物模型效率低、成本高，尚未见成功模型报道；（2）短期难以开展对转基因的个体开展临床病理鉴定和行为学的评价。PSEN1在灵长类动物中非常保守。有关非人灵长类动物中AD基因突变是否与人类相似方面的研究较少。John J．Ely发现一只黑猩猩PSEN1突变[5]，其PSEN1突变的特征未知；与其他年龄及性别相匹配的未突变PSEN1黑猩猩相比，其是否出现神经退行性病理改变和行为学变化均不知道；其子代是否有PSEN1基因突变、行为学及病理变化是否出现等还没有报道。 目前AD尚未研制出安全有效的药物和方法，迫切需要能模拟AD经典病理变化的理想动物模型，以前建立在啮齿类的动物模型各有优缺点，不能全面体现AD的病例神经行为学方面的全部改变。目前被大家所认可的转基因动物模型也有待完善。利用基因筛选和基因修饰分子生物学技术建立AD灵长类非人动物模型意义重大，对于进一步明确发病机理，AD药物的治疗、开发和筛选，早期诊断有重要的应用价值和前景。 【参考文献】 [1] Grundke-Iqbal I,Iqbal K,Tung YC,et.al.Abnormal phosphorylation of the microtubule associated protein tau(tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology.Proc Natl Acad Sci U S A 83(13):4913-4917. [2] Iqbal K,Grundke-Iqbal I.Alzheimer's disease,a multifactorial disorder seeking multitherapies.Alzheimers Dement 6(5):420-424. [3] Ballard C,Gauthier S,Corbett A,et al.Alzheimer’s disease[J].Lancet 2011,377(9770):1019-1031． [4] Wen P H,Shao X,Shao Z,et al.Overexpression of wild type but not an FAD mutant presenilin-1 promotes neurogenesis in the hippocampus of adult mice[J].Neurobiol Dis,2002,10(1):8-19． [5] Chan A W.Progress and prospects for genetic modification of nonhuman primate models in biomedical research[J].ILAR J,2013,54(2):211-223． [6] Joseph M.Erwin P RH J.One Gerontology:Advancing Understanding of Aging through Studies of Great Apes and Other Primates[M].Aging in Nonhuman Primates，Erwin Jm H P,Basel:Interdiscipl Top Gerontol,Karger,2002:31,1-21. 基金项目：浙江省科技计划项目(2017C37173);嘉兴学院南湖学院重点SRT资助项目(NH85178445)；2016年度浙江省教育技术研究规划课题(JB039)
诱导性多潜能干细胞_iPS cells_的研究进展
诱导性多潜能干细胞(iPS cells)的研究进展 学生：吴淑可元培学院学号：00646145 摘要：诱导性多能干细胞被誉为生命科学领域新的里程碑, 本文将通过iPS细胞的由来、研究概况、制备方法以及应用前景四个方面来简述iPS细胞的发展历程和应用前景。 关键词：iPS细胞、转录因子、小分子化合物 1.iPS细胞的由来 2007年11月，日本和美国科学家分别宣布独立发现将普通皮肤成纤维细胞转化为多潜能干细胞的方法，得到的干细胞称为诱导多能干细胞iPS（induced pluripotent stem cells）细胞。这项发现一方面解决了利用胚胎进行干细胞研究在伦理、宗教和法律等诸多限制，另一方面也使得干细胞的研究来源更方便且制备相对简单易行，故iPS细胞一经问世，即在生命科学领域引起了一次轰动，被誉为生命科学领域新的里程碑。简单来说，iPS细胞就是借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的体细胞，同时可选择性地在培养液中加入特定的小分子物质，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞，这类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体(embryoidbodies，EBs)形成、畸胎瘤(teratoma)形成和嵌合体(chimeras)形成(针对小鼠)等方面与ES 细胞非常相似[1]。 2. iPS 细胞的研究概况 2006年8月，Yamanaka小组确定最少有4 种转录因子组合——Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可将成纤维细胞重编程为iPS细胞[2]。次年11～12月，该小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞[3.4]。 2007年12月，Jaenisch小组用iPS细胞来源的造血前体细胞成功治疗镰状红细胞贫血，从理论和实践上为人类单基因遗传病治疗奠定基础，次年4月，该小组证实鼠iPS细胞来源的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠脑内，可有效缓解其症状和改善其行为, 说明iPS对复杂疾病治疗的可能性[5]。 2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的iPS细胞培育出鼠角膜上皮细胞。同年3月，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则宣布，他们可以将iPS细胞中因iPS转化需要而植入的有害基因移除，保证获得的神经元细胞的基本功能不受影响。同时美国研究人员宣布，他们可以通过蛋白质，而非任何核酸材料，将普通皮肤细胞转化为iPS细胞。紧接着，2009年4月，美国科学家首次对遗传疾病Fanconi 贫血症患者皮肤细胞中的基因缺陷进行了修补，进而将这些组织转化成了能扭转疾患病情的干细胞，从而在基因重组过程中，制造出了无遗传缺陷、功能强大的诱导多功能干细胞（iPS细胞），并再次定向诱导分化出纠正患者遗传性贫血所需的健康血液细胞。 2009年6月，日本iPS之父证明了不同细胞来源的iPS具有不同的致瘤性。同时鉴于目前iPS诱导效率太低，提出了iPS诱导的种质模型和随机模型加以探讨。 2009年7月，iPS细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据《自然》和《细胞：干细胞》杂志报道，中国上海和北京两个科学团队分别利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了iPS细胞具有实用性。 (https://www.360docs.net/doc/4b18760781.html,/society/2009-07/24/content_11766251.htm) 3. iPS 细胞的制备方法 目前，iPS细胞制备流程如下。简言之：a．分离和培养宿主细胞；b．通过病毒(逆转录病毒、慢病毒或腺病毒) 介导的方式将外源基因导入宿主细胞；c．将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES 细胞专用培养体系中培养，同时在培养液中根据需要加入相应的小分子物质( 如Wnt3a、5-AZA、BIX-01294、VPA、TSA等)以促进
小鼠肿胀模型及实验
小鼠耳肿胀模型及药理应用 周娟1, 张梦军2, 张惠静1,2, 郭嘉伟2, 李滨3 (1重庆大学化学化工学院,重庆,400044; 2第三军医大学药学院药物分析与分析化学教研室， 重庆,400038;3重庆市科学技术研究院,重庆, 401123) 摘要：小鼠耳肿胀模型因价格便宜、操作简便、易于测量和模型稳定等特点，广泛用于合成化合物和植物有效成分的抗炎活性评价。本文介绍了二甲苯、佛波酯、花生四烯酸、组胺、辣椒素和地蒽酚诱导的小鼠耳肿胀模型的造模方法、作用机理和应用特点，希望能为初步评价抗炎药物的药效和机制研究提供新的思路。 关键词：耳肿胀模型; 炎症;佛波酯; 花生四烯酸 第一作者简介：周娟，女，硕士研究生 研究方向：抗炎药物的药效及机制研究 炎症是损伤和抗损伤的统一过程。尽管炎症反应过程中，通过实质和间质细胞的再生使受损的组织得以修复和愈合，但损伤因子直接或间接造成组织和细胞的破坏，也会给机体带来损伤，如引起疖、痈、肺炎、关节炎以及机体失调，而抗炎药能治疗组织受到的这种损伤。目前的抗炎药物仍存在许多问题，如选择性较差、会引起胃肠道不适、肾功能衰竭和心功能衰竭等副作用。因此寻找安全有效的抗炎药物，以及选择合适的动物模型来初步评价抗炎药的药效和机制仍是众多学者共同关注的问题。 炎症根据感染的途径分为感染性炎症和非感染性炎症。感染性炎症主要是由生物病原体引起。非感染性炎症包括无菌性炎症（非特异性炎症）和变态反应性炎症。小鼠耳肿胀模型是非特异性炎症模型的一种，主要是以化学物质作为致炎剂来诱导小鼠耳肿胀。近几年来，小鼠耳肿胀模型已发展成为一类比较成熟的动物炎症模型，由于其操作简单、模型稳定且小鼠价格便宜等优点，常用它来评价一些合成化合物和植物有效成分的抗炎活性[1-3]。 小鼠耳肿胀模型常用的致炎物质有二甲苯、花生四烯酸（Arachidonic Acid, AA）、佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA/PMA）、巴豆油、组胺、辣椒素和地蒽酚等。然而，不同的致炎物质诱导的小鼠耳肿胀模型的机理存在较大的差异，下面我们将阐述不同致炎物质诱导的小鼠耳肿胀模型的造模方法、机理和应用特点。 一、二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型 二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型的造模方法：将20ul二甲苯均匀地涂抹在小鼠左耳或右耳内、外两侧，30至60min之内达到最大肿胀度，90min后肿胀基本消除。实验中通常选
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考 ——2012年诺贝尔生理学或医学奖解读班级：生物技术基地姓名：林立梅学号：0131122635 【摘要】John B. Gurdon和Shinya Yamanaka获得2012年诺贝尔生理学或医学奖，他们的相继研究成果证明，成熟、分化的细胞可以被重新组装或诱导重新编程，变成未成熟的干细胞，能够发育成机体内所有种类的组织。 【关键字】重新编程干细胞诱导定向分化临床医学 【内容】 （一）两位科学家的实验概述 （1）约翰.格登：用“细胞核重编程”克隆出新动物 所谓“细胞核重编程”，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能性干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。通俗一点讲，就是在细胞层面实现“返老还童”。 1962年，格登做了一个划时代的实验：他假设：这些细胞的基因组仍然包含着驱动它发育成机体所有不同类型的细胞所需的信息。并进行相关实验，将非洲爪蟾（Xenopus，一种蛙）卵细胞内不成熟的细胞核移除，然后把非洲爪蟾的成熟肠细胞的细胞核注入其中。在此过程中，他采用核标记技术（Elsdale et al，1960），将标记的供体细胞核移植到未标记的受体卵。在实验中，控制由囊胚或原肠胚（简称胚胎细胞核）穿插与转让肠细胞核。移植的胚胎中，所有那些超出了囊胚期的细胞中包含明显的被标记的核，可以证明它们来源于核移植而不是从卵核。核标记只出现在渡过了囊胚期胚胎中。整个实验的目的很简单，就是想看看这个卵子最终会变成什么。结果发现，一部分卵依然可以发育成蝌蚪；其中的一部分蝌蚪，可以继续发育成为爪蟾。 (2)山中伸弥：用基因技术制造出“诱导多能干细胞” 2006年Shinya Yamanaka教授从数据库中筛选出大约100个有可能在ES细胞中特别活跃的基因。再经过近4年的紧张工作，从这100个基因中筛选出24个活跃
使用诱导性多能干细胞_iPScells_修复心脏
数、着床数与空白对照组比较差异均无显著性。胎鼠发育良好,内脏观察指标均未见异常。说明复方枸杞子口服液在本实验规定剂量下未引起母体毒性、胚胎及胎鼠毒性,无明显的致畸作用,为生育期妇女服用该药的安全性提供了实验依据。 实验结果显示,低剂量组胎鼠表现为体质量较重、身长较长(P<0.01);中剂量组表现为活胎率高(P<0.05),死胎率低(P<0.05);3个剂量组的胎鼠骨骼发育都较空白对照组好,尤其是高剂量组胎鼠骨骼发育完全,无胸骨异常胎鼠(P<0.05),也无肋骨异常胎鼠(P<0.01)。表明复方枸杞子口服液对胎鼠发育有一定保健作用,尤其对骨骼发育的影响较大,为今后复方枸杞子口服液的药效学研究奠定了基础。本实验不足之处在于由于胎鼠出生率低,实验结果有待于进一步的实验证实。 参考文献: [1]汪建龙.枸杞多糖药理作用的研究进展[J].时珍国医 国药,2005,16(10):1032-1033. [2]张庆.大枣多糖体外抗补体活性剂促进小鼠脾细胞的 增殖作用[J].中药药理与临床,1998,14(5):19-22. [3]保健食品检验与评价技术规范[S].国家食品药品监督 管理局,2003. [4]陈平雁.SPSS13.0统计学软件应用教程[M].北京:人 民卫生出版社,2005:255-269. 使用诱导性多能干细胞(i PS c ells)修复心脏 梅约临床和医疗中心(Mayo Clinic)研究人员进行的一项概念验证研究显示,诱导性多能干细胞(iPS cells)可用于心脏病治疗。诱导性多能干细胞是被重新编程从而进入一个类似胚胎干细胞状态的成年细胞。在该项研究中,研究人员对普通的成纤维细胞进行重新编程,有助于结痂的细胞(譬如那些因心脏病发作产生的细胞)转化为干细胞,修复因心肌梗死造成的心脏损伤。 该项研究结果于2009年7月20日提前发表于Circulation杂志在线版。 论文第一作者Ti mothy Nelson博士指出:“这项研究发掘了在心脏治疗中使用诱导性多能干细胞的真正潜力,使生物工程成纤维细胞获得修复和再生梗死心脏的能力。” 这是基于诱导性多能干细胞的技术首次用于心脏疗法。在此之前,诱导性多能干细胞仅用于帕金森氏症、镰状细胞性贫血和甲型血友病3种疾病模型,最终目标是使用诱导性多能干细胞修复损伤。在此过程中使用患者自身的细胞,避免了排斥反应的风险及抗排斥药物进行维持治疗的需要。该再生医学策略将有助于缓解受限于捐赠者短缺的器官移植需求。 论文通讯作者Andre Terzic博士指出:“这项诱导性多能干细胞创新性研究为转化应用奠定了基础。借助于核编程方面的进展,我们将能逆转成年细胞,在心血管再生医学中实现按需定制。” 该研究团队通过“干性相关”人类基因集(“stemness2related”human gene set)对成纤维细胞进行遗传重编程,使其反分化成诱导性多能干细胞,进而重新分化为新的心肌细胞。移植入受损的小鼠心脏后,诱导性多能干细胞在2周后实现嫁接,4周后明显有助于改善受损心脏结构和功能。相比之下,普通成纤维细胞则无此功效。 与非工程化成纤维细胞相比,诱导性多能干细胞能够恢复心脏病发作后缺失的心肌功能,阻止受损心脏功能损伤进程,并在心脏受损部位再生组织。 (C irculation,2009:published online before p rint,July20,2009) 883广东药学院学报 第25卷
细胞遗传学复习资料
细胞遗传学复习资料 第二章染色体的形态结构 Chromosome: A molecular of DNA, and associated protein bound together. Each chromosome contains: Centromere, Kinetochore, Telomere, Euchromatin and Heterochromatin. 染色质（Chromatin）：在尚未分裂的细胞核中，显微镜下可见的可被碱性染料染色较 深的、纤细的网状物。 染色体（Chromosome）: 细胞分裂时，由染色质卷缩（螺旋化）而形成的呈现为一定数目 和形态的细胞结构，是遗传物质的最主要的载体。 研究染色体形态最适合的时期： ?有丝分裂中期 ?减数分裂第一次分裂前期I的粗线期 第一节有丝分裂中期染色体 大小：不同物种间染色体的大小差异很大，长度的变幅为(0.20-50 μm)，宽度的变幅为(0.20-2.00 μm)。(显微镜的最小分辨率δ=0.61λ/ NA ，λ＝0.55 μm NA=1.4，δ约为0.25 μm。NA为物镜的数值孔径） 同一物种不同染色体宽度大致相同，其染色体大小主要对长度而言。 小麦：染色体平均长度11.2 μm,总长235.4 μm。 在细胞周期中，染色体处于动态的收缩过程中。 绝对长度：实际测量值。 相对长度：特定染色体的长度在单倍染色体组总长度中所占的比例。 染色体大、数目少的物种是细胞遗传学研究的优良实验材料，如果蝇（2n=8)、玉米、蚕豆、洋葱、麦类。 着丝粒（Centromere）：A specialized chromosome region to which spindle fibers attach during cell division. 着丝粒是细胞分裂时，纺锤丝附着(attachment)的区域，又称为着丝点。 着丝粒不会被染料染色，所以在光学显微镜下表现为染色体上一缢缩部位(无色间隔点)，所以又称为主缢痕(primary constriction)。 着丝粒所连接的两部分称为染色体臂(arm)。 着丝点：具有聚合微管蛋白的作用，是微管组织中心(microtubule organized center, MTOC)，因而与细胞分裂过程中牵引染色体移动的驱动力有关系。 1.按着丝粒位置将染色体分为几种类型： 1）中着丝粒染色体 2）近中着丝粒染色体 3）亚中着丝粒染色体 4）亚端着丝粒染色体 5）近端着丝粒染色体 6）端着丝粒染色体 臂比(arm ratio,A)=长臂/短臂（q/p或L/S） 着丝粒指数(Centromeric Index,C)=短臂长度(p)/染色体长度(p+q)×100% 动粒（Kinetochore): 为着丝粒的外层结构，是细胞分裂时纺锤体微管附着部位。 动粒的类型： ?固定位置动粒( localized kinetochore)
化学诱导的急性和慢性小鼠肠炎模型的构建—更新方案
化学诱导的急性和慢性小鼠肠炎模型的构建—更新方案 订阅号APExBIO 炎性肠病（IBDs）如克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）的特征是慢性腹泻和腹痛。然而，随着时间的推移许多患者发生严重并发症，如组织纤维化，狭窄，瘘和结肠癌。动物模型有助于了解IBDs的免疫发病机制和新型治疗方案的设计。在这里，作者Wirtz等介绍了其在2007年发布的关于2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），恶唑酮（oxazolone）和硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的急性和慢性结肠炎模型的更新实验方案。论文在线发表在《Nature Protocols》。 TNBS结肠炎。在该模型中，通过直肠内给予半抗原物质TNBS和乙醇，在易感性小鼠品系中诱导结肠炎症。乙醇是损害屏障功能，允许TNBS渗透肠壁的关键。TNBS给药导致结肠或微生物蛋白衍生蛋白的半抗原化，随后导致TNP特异性CD4 + T细胞和抗体的产生。由于该模型与高活性T细胞的增加相关，因此T细胞在TNBS结肠炎中具有关键的致病作用，该模型适用于确定发炎肠道中的CD4 + T细胞依赖性免疫。先天性免疫机制也参与TNBS结肠炎的发展。炎症过程的强度和长度在很大程度上取决于几个因素，例如小鼠的遗传背景以及当地动物设施中T细胞活化细菌菌株的存在与否。因此，每个小鼠系和每个设施中TNBS给药的个体优化是必不可少的。 恶唑酮结肠炎。恶唑酮是一种半抗原试剂，在小鼠内直肠给药后引起严重的结肠炎。远端结肠粘膜和粘膜下层的急性炎症的特征在于嗜中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的溃疡和固有层浸润。虽然SJL / J和C57BL / 10小鼠是高度敏感的品系，但是C57BL / 6小鼠对恶唑酮结肠炎更具抗性，并且可能在直肠内给药之前需要皮下致敏步骤。该模型已被用于研究肠道炎症期间的2型和9型相关免疫应答。重要的是，较低剂量的恶唑酮也可能诱导混合的Th1 / Th2反应，在每种小鼠品系中，恶唑酮结肠炎需要单独的优化策略。 DSS结肠炎。通过饮用水将硫酸多糖DSS以口服方式给予小鼠，导致以体重减轻，血性腹泻，溃疡形成，上皮细胞丧失和嗜中性粒细胞浸润为特征的严重结肠炎。该模型已被用于探究微生物群对结肠炎发展的影响，及导致微生物群组成变化的因素（如饮食因素）。例如，有研究已经表明，缺乏炎症性蛋白质NLRP6的小鼠更容易发生DSS结肠炎。基于其简单性和重复性，剂量和治疗周期的修改允许模拟急性，复发和慢性肠炎症形式，以及分析上皮损伤时重复的组织再生和慢性伤口愈合。
人类诱导性多能干细胞技术指导手册
人类诱导性多能干细胞（iPS细胞） 技术指导手册 目录： 1. 前言 (1) 2. 人类胚胎成纤维细胞培养 (2) 3. 重编程载体构建 (3) 4.病毒包装 (4) 5.人类iPS细胞的诱导 (6) 6. iPS细胞鉴定 (8) 6.1碱性磷酸酶活性检测 (8) 6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (9) 6.3干性因子的去甲基化程度分析 (10) 6.4干细胞内源基因的表达分析 (13) 6.5端粒酶活性检测 (14) 6.6核型检测 (15) 6.7拟胚体形成 (15) 6.8畸胎瘤形成实验 (15) 7．干细胞技术培训及服务一览表 (15) 8．附录 (16) 1. 前言 iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。2006年Y amanaka 和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和Klf4，Y amanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，
细胞遗传学完整版答案讲课教案
《细胞遗传学》复习题 第一章染色体的结构与功能+第三章染色体识别 1.什么是花粉直感？花粉直感是怎样发生的？作物种子的哪些部分会发生花粉直感？ 花粉直感又叫胚乳直感，植物在双受精后，在3n胚乳上由于精核的影响而直接表现父本的某些性状。 由雄配子供应的一份显性基因能够超过由母本卵核或两个极核隐形基因的作用，杂交授粉当代母本植株所结的种子表现显性性状。 胚乳和胚性状均具有花粉直感的现象。 2.什么叫基因等位性测验？如何进行基因等位性测验？ 确定两个基因是否为等位基因的测验为基因的等位性测验。 将突变性状个体与已知性状的突变种进行杂交，凡是F1表现为已知性状，说明两对基因间发生了互补，属于非等位基因。若F1表现为新性状，表明被测突变基因与已知突变基因属于等位基因。 3.原位杂交的原理是什么？原位杂交所确定的基因位置与遗传学上三点测验所确定的基 因位置有何本质的不同？ 根据核酸碱基互补配对原则，将放射性或非放射性标记的外源核酸探针，与染色体经过变性的单链DNA互补配对，探针与染色体上的同源序列杂交在一起，由此确定染色体特定部位的DNA序列的性质；可将特定的基因在染色体上定位。 第一步，制备用来进行原位杂交的染色体制片；第二步，对染色体DNA进行变性处理；第三步，进行杂交；第四步，信号检出和对染色体进行染色；第五步，显微镜检查。 原位杂交是一种物理图谱绘制的方法，它所确定是特定基因在染色体上的物理位置；三点测验是绘制连锁图谱的实验方法，它是利用三对连锁基因杂合体，通过一次杂交和一次测交，确定三对基因在同一染色体上排列顺序以及各个基因的相对距离。 4.什么叫端粒酶(telomerase)？它有什么作用？ 端粒酶是参与真核生物染色体末端的端粒DNA复制的一种核糖核蛋白酶,由RNA 和蛋白质组成，其本质是一种逆转录酶。 作用：它以自身的RNA作为端粒DNA复制的模版，合成出富含G的DNA序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定了染色体的结构。 端粒起到细胞分裂计时器的作用，端粒核苷酸复制和基因DNA不同，每复制一次减少50-100 bp，正常体细胞染色体缺乏端粒酶活性，故随细胞分裂而变短，细胞随之衰老。人的生殖细胞和部分干细胞染色体具有端粒酶活性，所以人的生殖细胞染色体末端比体细胞染色体末端长几千个bp。肿瘤细胞和永生细胞系具有端粒酶的活性。端粒酶的活性是癌细胞的一种标誌，可以作为癌症治疗中的一个靶子。 5.染色质修饰和DNA修饰如何影响基因的表达？ 染色质修饰包括: （1）组蛋白的化学修饰：组蛋白乙酰化使之对DNA的亲和力降低，降低了核小体之间的相互作用，异染色质中组蛋白一般不被乙酰化，而功能域中组蛋白常被乙酰化；组蛋白去乙酰化抑制基因组活化区域。 （2）核小体重塑：核小体的重塑影响基因的表达，核小体的重新排列，它可以改变核小体在基因启动子区域的排列，从而增加启动子的可接近性，调节基因的表达。基因激活伴随着DNA酶I敏感位点的形成，影响基因的表达。基因激活伴随着DNA酶I敏感位点的形成。DNA修饰包括：（1）DNA甲基化（2）基因组印记 甲基化是指在甲基化酶的作用下，将一个甲基添加在DNA分子的碱基上。DNA甲基化修
疼痛动物模型系列
疼痛实验动物模型 科研探索2007-04-25 23:11:36 阅读147 评论0 字号：大中小订阅 疼痛是机制非常复杂的神经活动。疼痛研究已经成为当前神经科学研究的重要课题之一。由于疼痛机制的复杂性，使得在患者身上研究与疼痛有关的神经机制成为不可能的事。因而，我们的研究需要相应的动物模型。本章介绍了在现代神经科学研究中常用的疼痛动物模型。在概要介绍了疼痛研究的意义及其现状之后，重点介绍了在生理痛研究和急性、慢性病理痛研究中所应用的动物模型。生理痛的模型即常用的动物伤害性感受阈测定法；急性病理痛的模型则主要是各种急性炎症模型模型；慢性病理痛的模型则包 括慢性炎症模型和慢性神经损伤模型。 前言 疼痛(pain)是人们一生中经常遇到的不愉快的感觉。它提供躯体受到威胁的警报信号，是生命不可缺少的一种特殊保护功能。另一方面，它又是各种疾病最常见的症状，也是当今困扰人类健康最严重的问题之一。近年来，仅在美国就有三至四千万人患有慢性痛。据估计，美国每年用于治疗慢性痛的费用约为400~600亿美元；澳大利亚每年用于治疗疼痛的费用占全部医疗费用的40%。随着医学的进步和人类生活水平的提高，烈性传染病逐渐得到控制，疼痛在人的身心痛苦和医疗费用消耗上的相对地位将越来越重要。 由于难以在人体对疼痛进行深入的机制研究，有必要建立疼痛的动物模型。但疼痛是是包括性质、强度和程度各不相同的多种感觉的复合，并往往与自主神经系统、运动反应、心理和情绪反应交织在一起，它既不是简单地与躯体某一部分的变化有关，也不是由神经系统某个单一的传导束、神经核和神经递质进行传递的，所以很难将某种客观指标与疼痛直接联系起来。因而，我们只能根据模型动物对伤害性刺激的 保护反应和保护性行为来推测它们的疼痛程度。 伤害性感受(nociception)和痛觉是两个有密切关系但又不相同的概念。前者是指中枢神经系统对由于伤害性感受器的激活而引起的传入信息的加工和反应，以提供组织损伤的信息；痛觉则是指上升到感觉水 平的疼痛感觉。两者之间有时并没有严格的相关性。 生理痛模型与常用的痛阈测定法 概述 为了能够对痛觉现象及其机制作深入细致的观察，特别是在中枢神经系统的形态学、细胞生物学和分子生物学水平研究痛觉机制，必须建立动物的痛觉模型。又由于痛觉是意识水平的感觉，我们无法确定动物是否具有痛觉，只能观察其对伤害性刺激的行为反应。因而在下文的描述中有时用伤害性感受阈 (nociceptive threshold)取代痛阈(pain threshold)。 正常情况下，疼痛是机体对外界伤害性刺激的感受，它是一种报警系统，提示实存的或潜在的组织损伤的可能性。如果这种伤害性刺激是可以回避的，那么痛觉就是一种具有完全的积极意义的感觉形式，称为生理痛。这种意义上的疼痛模型实际上就是对伤害性感受阈的测量。它是通过观察动物对伤害性温度 和机械刺激的逃避反应实现的。 如果动物遇到无法逃避的伤害性刺激，就会引起它的情绪反应，发出嘶叫声。这是需要高级神经中枢配合的反应，并且不受局部运动功能的影响。因而，在伤害性刺激下引起的嘶叫反应也可以作为伤害性 感受阈的测量指标。 热辐射-逃避法 这是最常见的伤害性感受阈测量方式。最常用的有热辐射-甩尾法、热辐射-甩头法和热辐射-抬足法。
阿尔茨海默病模型小鼠凋亡相关蛋白的表达
阿尔茨海默病模型小鼠凋亡相关蛋白的表达 王晓映1 刘鹏朱华徐艳峰马春梅代小伟刘颖秦川（中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心，北京100021） 〔摘 要〕目的 探讨阿尔茨海默病（AD ）凋亡相关蛋白的表达情况。方法 取3月龄和6月龄APPswe /PS ΔE9小鼠脑组织，利用Western 印 迹的方法检测APPswe /PS ΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中bcl-2、caspase-9以及caspase-3的表达情况。结果与同月龄的对照小鼠相比，APPswe / PS ΔE9转基因小鼠中，bcl-2表达水平明显降低，而caspase-9和caspase-3表达水平明显升高。结论凋亡相关蛋白的异常表达可能在AD 的发生发 展过程中起到一定作用。 〔关键词〕阿尔茨海默病；bcl-2；APPswe /PS ΔE9小鼠〔中图分类号〕R749 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-9202（2012）07-1446-02；doi ：10.3969/j.issn.1005- 9202.2012.07.0561山东大学第二医院病理科 通讯作者：秦 川（1959-），女，教授，博士生导师，主要从事神经系统退行性病变研究。 第一作者：王晓映（1981-），女，医师，医学博士，主要从事神经系统退行 性病变研究。 阿尔茨海默病（AD ）是一种神经系统退行性疾病，是导致老年人痴呆的主要原因，其特征性的病理改变是在大脑皮质和海马区域出现老年斑和神经原纤维缠结。目前， AD 的发病机制仍然不明确， 一些研究发现，凋亡的异常可能在AD 的发生发展过程中起到重要作用。本实验以APPswe /PS ΔE9模型小鼠作为研究对象，探讨AD 中凋亡相关蛋白的表达情况。1材料与方法 1.1 APPswe /PS ΔE9转基因小鼠的建立 APPswe /PS ΔE9转 基因小鼠由中国医学科学院实验动物研究所构建并提供〔1〕 。 APPswe 转基因编码一段人鼠嵌合的蛋白，其中APP 的胞外和胞内区域为鼠源性序列，而A β结构域为人源性序列并包含瑞士突变K594N /M595L 。PS ΔE9转基因编码人源性E9外显子缺失的PS1。转基因小鼠在出生9 14d 用剪趾法标记，收集剪下的组织及鼠尾，用碱裂解法提取基因组DNA ，PCR 分别检测APPswe 及PS ΔE9基因的表达。APP 基因PCR 产物长344kb ，PS 基因PCR 产物长608kb 。1.2 Western 印迹法检测bcl-2、caspase-9以及活化caspase-3的表达 将小鼠脱颈处死后，迅速取出其脑组织，用生理盐水 洗去血液， 立即置于RIPA 蛋白裂解液中，提取总蛋白。蛋白浓度用BCA 法进行测定。蛋白上样量为40μg ，利用12%的SDS-PAGE 胶进行分离，然后将其转移至NC 膜（Millipore ）上，室温下封闭1h ，与bcl-2（Abcam ）、capase-9（Millipore ）及caspase-3（Abcam ）抗体进行杂交，4?过夜，用TBST 洗膜3次，与辣根酶标记的羊抗兔IgG 和GAPDH 进行杂交，室温下孵育1h ，TBST 洗膜3次，然后进行化学发光。1.3 统计学分析 运用SPSS11.0统计软件。用t 检验对 Western 印迹的结果进行统计学分析。 2结果 2.1 APPswe /PS ΔE9转基因小鼠鼠尾DNA 鉴定结果 裂解鼠 尾后提取DNA ，分别用针对APP ，PS1的引物进行扩增，筛选鉴定阳性小鼠， 部分检测结果见图1 。1、2、3泳道分别为阴性对照、空白对照和阳性对照，4、8和10为阴性小鼠， 5、6、7和9为阳性小鼠图1APPswe /PS ΔE9转基因小鼠鼠尾DNA PCR 鉴定结果 1，2，3，4分别代表3月龄模型鼠、3月龄对照鼠、6月龄模型鼠和6月龄对照鼠；图3同 图2APPswe /PS ΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中bcl- 2蛋白表达情况2.2 APPswe /PS ΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中bcl-2 蛋白的表达情况 利用Western 印迹的方法分别检测了3月龄 和6月龄小鼠脑组织中bcl-2蛋白的表达情况，并将检测结果进行半定量分析。由图2可以看出，与同月龄的野生型对照小鼠相比， APPswe /PS ΔE9转基因小鼠中，bcl-2表达水平明显降