重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展
综 述
重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展3
郑海洲,刘晓志,宋 欣
(华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄 050015)
摘 要 长期以来,大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统,重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性,在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌蛋白的N-端加工。本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展,目的是为了提高外源蛋白的生物活性。
关键词 大肠杆菌,分泌表达,重组蛋白
中图分类号:Q591.2 文献标识码:A 文章编号:100625687(2009)0420040203
Advance i n the secretory expressi on of reco m b i n an t prote i n i n escher i ch i a coli
Zheng Haizhou,L iu Xiaozhi,S ong Xin
(NCPC Ne w D rug Research and Devel opment Co.,L td,Shijiazhuang050015)
ABSTRACT Escherichia coli is one of the most widely used hosts for the p r oducti on of recombinant p r oteins.Pr oducti on of secre2 t ory p r oteins in escherichia coli p r ovides several advantages over exp ressi on in the cyt op las m.Peri p las m p r ovides the oxidative en2 vir on ment t o facilitate correct disulfide bonding and p r otein folding.It als o all ows correct p r ocessing of N-ter m inal a m ino acid during secreti on.This revie w discusses recent advances in secret ory and extracellular p r oducti on of recombinant p r oteins s o as t o
i m p r ove the bi ol ogical activity of the heter ol ogous p r oteins.
KE Y WO RD S escherichia coli,secret ory exp ressi on,recombinant p r otein
大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点,是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统[1]。蛋白分泌表达是指重组异源蛋白通过运输或分泌方式定位于细胞周质,甚至穿过外膜进入培养基中。重组蛋白分泌表达的优势在于胞周质或胞外分泌表达过程中,信号肽在细胞内剪切,更有可能产生目的蛋白的天然N-末端,如果含甲硫氨酸可能会降低产物的可溶性和稳定性[2];大肠杆菌的胞周质中含有一系列的酶,并提供了一个氧化环境,有利于二硫键的正确形成,并增强巯基蛋白的正确折叠,使活性蛋白质的产量得到提高[3];蛋白分泌性表达,减少了对宿主菌的毒性和代谢负担,使宿主菌适应性增加;周质空间和胞外培养基中宿主菌蛋白含量很低,有利于目的蛋白的纯化。本文将近年来一些提高重组蛋白在大肠杆菌胞周质和胞外分泌表达的策略简述如下。
1 利用E coli自身存在的分泌途径
根据识别特异的底物及透过细胞外膜机制的不同,革兰阴性菌共分为5种天然分泌系统,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型。革兰阴性菌E coli K-12和B菌株主要通过Ⅰ和Ⅱ型系统分泌重组蛋白,目前对后面三种分泌机制的研究还不透彻。Ⅰ型分泌系统通过α-溶血素途径直接介导胞外分泌,组成元件简单,外源重组蛋白与H ly A C-端结合后,再与H ly B/H ly D形成复合物,由ATP水解提供能量,通过Tol C通路实现胞外分泌。通过该系统分泌出胞外的蛋白C端仍然带有一段信号序列,需要在体外进行剪切;此外该系统中的一些共表达部件对目的蛋白的转运有竞争作用,重组蛋白表达量很低。Ⅱ型分泌系统先介导胞周质分泌,再经过MT B(main ter m inal branch)机制实现胞外分泌,然后利用以下三种途径透过胞质膜:依赖于Sec B的通路、信号识别颗粒(SRP)通路或双精氨酸转移(T AT)通路[4]。由于E coli跨越内膜的转运装置不完善,蛋白输出能力不够,蛋白酶降解等原因导致分泌效率低,胞外分泌量往往达不到实验或工业生产的要求,目前大肠杆菌的分泌主要是指重组蛋白通过Ⅰ或Ⅱ型系统透过胞质膜分泌至周质腔。
2 信号肽对重组蛋白分泌表达的影响
大肠杆菌的分泌型蛋白定位于内膜、外膜、周质空间和胞外环境,其在N端或C端带有一定的结构,其中N端带有信号肽分子的蛋白,而C端带有分泌信号的系统。信号肽位于分泌蛋白的N端,能有效地引导
04天津药学 Tianjin Phar macy 2009年 第21卷第4期3收稿日期:2009206212
新生肽穿越原核生物的质膜,对外源蛋白的分泌起主导作用,一般采用来自大肠杆菌的外膜蛋白或周质蛋白的信号肽。在实际研究中,由于目的基因和表达载体系统不同,为了提高外源蛋白的表达量,应试用不同的信号肽。
目前许多原核和真核细胞来源的信号肽已成功地用于大肠杆菌中重组蛋白从内膜到外周质的转运。Choi等[5]使用木聚糖酶信号肽将两种不同杆菌的碱性磷酸酯酶被分泌到大肠杆菌的周质空间。Jeong等[6]将人类β-内啡肽基因和一种外膜蛋白ompF融合后能促使其分泌到培养基中。郝春芳等[7]利用集胞藻6803膜蛋白的分泌信号肽作为革兰阴性菌分泌表达的信号肽,实现了hEGF多肽在大肠杆菌中分泌表达。肖洁等[8]根据研究报道,适当改造信号肽结构可提高外源蛋白的分泌效率。Ya mabhai等[9]利用芽孢杆菌自身的信号肽及大肠杆菌外膜蛋白信号肽(OmpA)成功在大肠杆菌分泌表达了芽孢杆菌胞外水解酶α-淀粉酶、甘露聚糖酶和壳多糖酶。
3 选择适当的宿主菌株
不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在着很大差别,因此,不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化有至关重要的作用[10]。利用蛋白酶表达缺陷的突变菌株可以提高重组蛋白的分泌表达量,一些缺陷性菌株(如合成外膜元件的基因突变体)既能够产生可溶性的、具有正确空间结构和二硫键的活性蛋白,又能够避免细胞壁在外源蛋白跨膜转运中的阻碍作用,有利于重组蛋白分泌到培养基中。最成功的例子就是L2型细菌(缺乏细胞壁和胞周质)已用于青霉素酰基转移酶、链激酶、微小抗体的分泌表达中。但因为这些菌株有生长受损性,不能耐受高密度发酵的过程,L2型细菌不适合工业化生产。另外,通过改变渗透压或者溶菌酶处理突变的大肠杆菌,能够重组蛋白的分泌表达[11]。生长受抑制、代谢活动处于静止期的细胞(Q细胞)已被成功用于抗体片段的胞外分泌中。
4 共表达跨膜转运蛋白
大肠杆菌分泌蛋白的跨内膜转运是由一系列结构相关的Sec蛋白顺序作用完成的,参与跨膜转运的有7个Sec蛋白:Sec A、Sec B、Sec D、SecE、SecF、SecG和SecY。此外,一些分子伴侣,如Gr oES/Gr oE L、DnaK/ DnaJ和Ffh/F fs,也参与跨内膜的转运。研究表明通过共表达参与或影响转运的蛋白,改善转运通路,可能会提高重组蛋白的分泌表达水平。D sb家族(二硫键还原酶及异构酶)能促进新的二硫键的连接,周间腔的两种二硫键异构酶D sbC和D sbD能促进二硫键的重新形成,D sb蛋白的过量表达能提高周间腔蛋白的分泌效率,改善折叠效果和促进蛋白的可溶表达。Tarid2 ow采用一种分子伴侣Catl M能使I L211和F1抗原融合蛋白分泌到周间腔[12]。孙永红等[13]利用融合标签技术,分别将大肠杆菌酸性蛋白M sy B,一个假定的大肠杆菌阅读框蛋白yjg D,大肠杆菌RNA聚合酶σ70的N-末端结构域及大肠杆菌硫氧还蛋白Trx与Aβ1-42淀粉样蛋白进行融合表达,实现了该蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。
5 优化培养条件
培养基成分、培养方式、培养条件及培养过程中抑制性代谢产物的积累等都会影响重组蛋白在工程菌中的表达产量和分泌的量。其中培养基营养成分、pH和温度等参数是影响工程菌生长和表达外源蛋白的重要因素,能够影响蛋白酶的活性、分泌和表达水平[14]。向培养基中添加甘氨酸可以在不导致菌体自溶的情况下促进蛋白从周质空间向胞外的分泌,且不引起明显的细菌裂解。在培养基中添加糖胶和Trit on X-100能阻止周间腔中包涵体的形成,并提高胞外表达的效率。改变培养基的渗透压、短时间的热冲击诱导及降低诱导时的温度,会明显提高重组蛋白在大肠杆菌的可溶性表达[15]。胡晓梅等[16]对分泌型重组铜绿假单胞菌外毒素A基因工程菌的发酵条件进行了优化研究,发现在30℃和37℃两种温度条件下培养表达,所得菌湿重分别为6.962g/L和4.253g/L,目标蛋白表达率分别为26.6%和19.5%,因此确定30℃为最佳发酵温度。Zhang等[17]探讨了当改变诱导剂乳糖浓度、诱导时的菌浓、诱导温度及培养基成分等培养条件时,葡聚糖蔗糖酶在大肠杆菌中分泌表达的变化情况。
6 结语
大肠杆菌是基础研究和商业生产重组蛋白的强大工具,由于来自真核生物的异源蛋白往往不能在大肠杆菌得到有效表达,特别是大肠杆菌本身的蛋白质分泌系统不够完善,分泌能力比真核生物要低,因此要获得重组蛋白的高效分泌表达面临许多问题。重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性,在周质腔能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌蛋白的N-端加工。随着各项研究的深入,重组蛋白在大肠杆菌的高效分泌表达技术将会越来越完善。
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环磷酰胺药理与毒理研究现状3
邓震亭
(天津中医药大学第一附属医院,天津 300193)
中图分类号:R979.1 文献标识码:A 文章编号:100625687(2009)0420042203
环磷酰胺(cycl ophos pha m ide,CTX)是临床上常用的免疫抑制剂和抗肿瘤药物,由于其在体内能转化成具有细胞毒活性的烷基化物而表现出毒副反应,如致畸、骨髓抑制、脱发等,尤其是对胚胎的致畸作用,使临床应用受到了限制。因此研究环磷酰胺毒副反应的作用及其机制,对预防和减少毒副反应的发生具有重要的意义。
1 不同剂量环磷酰胺对肺癌裸鼠移植瘤耐药的影响研究表明[1],小剂量、高频率化疗在减少毒副作用的同时,可特异性作用于肿瘤的血管内皮细胞,抑制肿瘤血管生成,且不易产生耐药。目前国内对低剂量化疗在肺癌耐药方面的实验研究较少。李娜等[2]研究了不同剂量CTX对裸鼠A549肺腺癌移植瘤耐药情况的影响,同时观察其抑瘤效果和毒副作用。通过建立荷A549肺癌的BALB/c裸小鼠模型,分别给予不同剂量CTX腹腔注射干预观察肿瘤体积、小鼠体质量和毒副作用。免疫组化检测移植瘤组织中GST2π和LRP的表达情况。结果显示小剂量、高频率CT X治疗组用药初期肿瘤生长较快,后逐渐延缓,且在较长一段时间内肿瘤生长缓慢;大剂量CT X治疗组用药初期肿瘤生长较慢,后生长加快。从化疗副作用来看,小剂量、高频率CTX治疗组裸鼠无明显体质量减轻及行动迟缓、反应迟钝、精神食欲差等毒副反应,大剂量CTX 治疗组则毒副反应较明显。免疫组化结果显示为小剂量、高频率CT X治疗组与对照组相比GST2π和LRP 表达程度稍强(P>0.05);大剂量组与对照组相比GST2π和LRP表达程度均明显增强(P<0.01);大剂量组与小剂量、高频率组相比GST2π和LRP表达增强(P<0.05)。由此认为CTX小剂量、高频率的给药模式不易产生获得性耐药,与传统的大剂量给药模式相比,小剂量、高频率的给药模式能够更显著、持久地抑制肿瘤增长,且毒副反应小,裸鼠耐受性好。
24天津药学 Tianjin Phar macy 2009年 第21卷第4期3收稿日期:2009203213
肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究
第45卷 增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science ) Vol .45 Sup. M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项 (20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@https://www.360docs.net/doc/50313013.html, ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn 肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 朱红梅1 ,周涵韬 1,23 ,张赛群 1,2 ,曹 宜2,刘 波 23 (1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003) 摘要:通过电击转化法,将带有 gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧 光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段. 关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1] .猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P . 来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2] .在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现 对生物的活体监测[3] ,为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段. 本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价. 1 材料与方法 1.1 材 料 肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2 LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和 阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因. 蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs . BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜. 1.2 实验方法 (1)质粒提取方法 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5 α的单菌落,于10mL 含100μg ?mL -1 Amp 的LB 液体 培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4] .提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度. (2)感受态细胞的制备 在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用. (3)电击转化 2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h, 取100μL 菌液涂布在NA +100μg ?mL -1 Amp +6mg ?mL -1 阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h . (4)转化子的荧光检测 将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察. (5)标记菌株的PCR 鉴定 细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备
1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
大肠杆菌表达系统的研究进展综述
基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
酵母表达系统的特点 大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化(参考资料)
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
高中组 11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达 前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 第一节基因的表达系统与表达策略 一、最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 二、宿主细胞的选择 （一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 （二）宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。 缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化 ●实验目的： 1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法 2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法 3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。 ●实验原理： 1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化. 4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC. 酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。该反应消耗一分子的三磷酸鸟苷以提供磷酰基。在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。
真核基因在大肠杆菌中的表达形式
真核基因在大肠杆菌中的表达形式 大肠杆菌被内膜和外膜隔成3个腔：胞内、周质和胞外，表达的蛋白定位于这3个腔内。真核基因在大肠杆菌的表达形式根据表达产物的定位一般可分为两类：胞内表达和蛋白分泌表达。胞内表达是最主要的表达形式，表达产物以可溶性蛋白和/或不溶性的包涵体形式存在于大肠杆菌细胞内。而根据表达产物本身的性质又分为融合表达和非融合表达。 一、胞内表达 1、非融合表达 非融合表达即直接表达天然蛋白，所表达的真核生物蛋白肽链的N端不含有任何原核肽段。真核基因通常缺乏能被原核生物的转录和翻译系统识别的序列，包括启动子、有效地核糖体结合位点，有时还缺乏ATG起始密码子和转录终止子，因此必须插入带有这些调控序列的表达载体方能表达。 有时，非融合表达不能产生目的蛋白，尤其是目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸时。由于甲硫氨酸是由ATG编码的，在大肠杆菌中，氨基端的甲硫氨酸会被不同程度地去除。此外，非融合蛋白易被宿主蛋白酶破坏，产生无活性的蛋白，这是影响表达效率的重要因素。克服的方法有：①采用Ion-营养缺陷型宿主。大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖于黄嘌呤核苷（Ion），用Ion-宿主，使蛋白酶不能合成，从而保护真核蛋白；②克隆Pin基因。T4噬菌体Pin基因产物为细菌蛋白酶抑制剂，将Pin基因克隆到质粒上，并转化大肠杆菌，可保护真核蛋白。 2、融合表达 融合表达即表达的真核蛋白肽链N端含原核生物肽段，融合表达的方法是将真核基因插入启动子后已证实能高效表达的原核结构基因的下游，以产生融合蛋白的方式表达目的基因。由于融合基因5'端为表达载体中的原核基因序列，已优化的翻译起始区的二级结构不受插入外源基因的干扰，因此，融合表达的效率高。需要注意的是，插入基因的转录方向和阅读框架必须与原核片段的阅读框架相吻合，不能产生移码，否则不能表达。 融合蛋白需经处理后方能释放出真核蛋白，常用的后处理方法有溴化氰和蛋白酶裂解，这就要求融合蛋白在其原核肽段与目的蛋白间应含有能被溴化氰和蛋白酶裂解的序列，而且目的蛋白内部不能含有溴化氰和蛋白酶切割位点。溴化氰能切割蛋氨酸残基后的肽键；牛凝血因子X用Russel蝰蛇毒液活化成因子X a后，能在四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg中的精氨酸（Arg）后特异地切割肽链；凝血酶（thrombin）也能识别和切割特定的肽序列，这些
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建
1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon和ompT 两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta(DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫键，则需要宿主表达环境为氧化条件的。AD494宿主菌是硫氧还蛋白突变型，可以促进二硫键的折叠。Origami菌株为硫氧还蛋白突变和谷胱甘肽还原酶突变，进一步加强了二硫键在细胞的形成[18]。另外一方面，如果表达的重组蛋白对于宿主菌是有毒性的，则需要表达为包涵体的形式。 表1：常用于重组蛋白表达的宿主菌及其特点
大肠杆菌表达宿主的特点
1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET 系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lac Ⅹ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影
基因克隆及在大肠杆菌中的表达
KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达 1引言 角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。 1.1 KGF-2的来源和基因结构 KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。 1.2 KGF-2的功能 KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。 [主要试剂] 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 [操作步骤] 1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。 PCR反应体系为： 模板（含R基因的重组质粒）1μl 上游引物PR11μl 下游引物1μl dNTP（2.5mmol/L）5μl 10×PCR buffer（含Mg2+）10μl Taq酶1μl ddH2O补至100μl PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。 2、构建重组表达载体 （1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）
进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为： pRSETA1μl R基因片段3μl T4 DNA连接酶（5U/μl）1μl 5×buffer2μl ddH2O补至10μl 3、获得含重组表达质粒的表达菌种 （1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 （3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。 4、诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。 2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大约需3hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70℃10min。 5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 6 5500rpm 15min 收集细胞
重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展
天津药学ＴｉａｎｊｉｎＰｈａｒｍａｃｙ２００９年第２１卷第４期 综述 重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展’ 郑海洲，刘晓志，宋欣 （华北制药集团新药研究开发有限责任公司，石家庄０５００１５） 摘要长期以来，大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统，重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性，在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠，还能促进分泌蛋白的Ｎ一端加工。本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展，目的是为了提高外源蛋白的生物活性。 关键词大肠杆菌，分泌表达，重组蛋白 中图分类号：Ｑ５９１．２文献标识码：Ａ文章编号：１００６－５６８７（２００９）０４－００４０－０３ Ａｄｖａｎｃｅｉｎｔｈｅｓｅｃｒｅｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｉｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ ＺｈｅｎｇＨａｉｚｈｏｕ，“ｕＸｉａｏｚｈｉ，Ｓ０ｎｇＸｉｎ （ＮＣＰＣＮｅｗＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１５） ＡＢＳＴＲＡＣＴＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｈｏｓｔｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ８ｅｃｒｅ—ｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｒｏｖｉｄｅｓｓｅｖｅｒａｌａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｐｒｏｖｉｄｅｓｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎ—ｖｉｒｏｎｍｅｎｔｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｃｏｒｒｅｃｔｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｉｎｇａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｆｏｌｄｉｎｇ．ＩｔａｌｓｏａｌｌｏｗｓｃｏｒｒｅｃｔｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＮ—ｔｅｒｍｉｎａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｄｕｒｉｎｇｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．ＴｈｉｓｒｅｖｉｅｗｄｉｓｃｕｓｓｅｓｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓＳＯａｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｈｅｔｅｍｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＫＥＹＷＯＲＤＳｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ 大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点，是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统…。蛋白分泌表达是指重组异源蛋白通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。重组蛋白分泌表达的优势在于胞周质或胞外分泌表达过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然Ｎ一末端，如果含甲硫氨酸可能会降低产物的可溶性和稳定性旧１；大肠杆菌的胞周质中含有一系列的酶，并提供了一个氧化环境，有利于二硫键的正确形成，并增强巯基蛋白的正确折叠，使活性蛋白质的产量得到 谢负担，使宿主菌适应性增加；周质空间和胞外培养基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的纯化。本文将近年来一些提高重组蛋白在大肠杆菌胞周质和胞外分泌表达的策略简述如下。 １利用Ｅｃｏｌｉ自身存在的分泌途径 根据识别特异的底物及透过细胞外膜机制的不同，革兰阴性菌共分为５种天然分泌系统，即Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ｖ型。革兰阴性菌ＥｃｏｌｉＫ一１２和Ｂ菌株主 ?收稿日期：２００９－０６—１２分泌机制的研究还不透彻。Ｉ型分泌系统通过仅一溶血素途径直接介导胞外分泌，组成元件简单，外源重组蛋白与ＨｌｙＡ 信号序列，需要在体外进行剪切；此外该系统中的一些共表达部件对目的蛋白的转运有竞争作用，重组蛋白 过ＭＴＢ（ｍａｉｎｔｅｒｍｉｎａｌ 后利用以下三种途径透过胞质膜：依赖于ＳｅｃＢ的通路、信号识别颗粒（ＳＲＰ）通路或双精氨酸转移（ＴＡＴ）Ｊ。由于Ｅｃｏｌｉ跨越内膜的转运装置不完善，蛋白输出能力不够，蛋白酶降解等原因导致分泌效率低，胞外分泌量往往达不到实验或工业生产的要求，目前大肠杆菌的分泌主要是指重组蛋白通过Ｉ或Ⅱ型系统透过胞质膜分泌至周质腔。 ２信号肽对重组蛋白分泌表达的影响 大肠杆菌的分泌型蛋白定位于内膜、外膜、周质空间和胞外环境，其在Ｎ端或Ｃ端带有一定的结构，其中Ｎ端带有信号肽分子的蛋白，而Ｃ端带有分泌信号的系统。信号肽位于分泌蛋白的Ｎ端，能有效地引导 万方数据
pKD3大肠杆菌表达载体说明
pKD3 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4290 pKD3 pKD3载体基本信息 载体名称: pKD3 质粒类型: 细菌表达；基因敲除系统 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: R6K 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 2804 b p 5' 测序引物及序列: R6K--‐3 3' 测序引物及序列: rrnB--‐T1--‐term--‐F 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: Ampicillin 和 Chloramphenicol 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ pKD3载体质粒图谱和多克隆位点信息
pKD3载体序列 ORIGIN 1 AGATTGCAGC ATTACACGTC TTGAGCGATT GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC GAAGTTCCTA 61 TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA GGAACTTCAT TTAAATGGCG CGCCTTACGC 121 CCCGCCCTGC CACTCATCGC AGTACTGTTG TATTCATTAA GCATCTGCCG ACATGGAAGC
181 CATCACAAAC GGCATGATGA ACCTGAATCG CCAGCGGCAT CAGCACCTTG TCGCCTTGCG 241 TATAATATTT GCCCATGGTG AAAACGGGGG CGAAGAAGTT GTCCATATTG GCCACGTTTA 301 AATCAAAACT GGTGAAACTC ACCCAGGGAT TGGCTGAGAC GAAAAACATA TTCTCAATAA 361 ACCCTTTAGG GAAATAGGCC AGGTTTTCAC CGTAACACGC CACATCTTGC GAATATATGT 421 GTAGAAACTG CCGGAAATCG TCGTGGTATT CACTCCAGAG CGATGAAAAC GTTTCAGTTT 481 GCTCATGGAA AACGGTGTAA CAAGGGTGAA CACTATCCCA TATCACCAGC TCACCGTCTT 541 TCATTGCCAT ACGTAATTCC GGATGAGCAT TCATCAGGCG GGCAAGAATG TGAATAAAGG 601 CCGGATAAAA CTTGTGCTTA TTTTTCTTTA CGGTCTTTAA AAAGGCCGTA ATATCCAGCT 661 GAACGGTCTG GTTATAGGTA CATTGAGCAA CTGACTGAAA TGCCTCAAAA TGTTCTTTAC 721 GATGCCATTG GGATATATCA ACGGTGGTAT ATCCAGTGAT TTTTTTCTCC ATTTTAGCTT 781 CCTTAGCTCC TGAAAATCTC GACAACTCAA AAAATACGCC CGGTAGTGAT CTTATTTCAT 841 TATGGTGAAA GTTGGAACCT CTTACGTGCC GATCAACGTC TCATTTTCGC CAAAAGTTGG 901 CCCAGGGCTT CCCGGTATCA ACAGGGACAC CAGGATTTAT TTATTCTGCG AAGTGATCTT 961 CCGTCACAGG TAGGCGCGCC GAAGTTCCTA TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA 1021 GGAACTAAGG AGGATATTCA TATGGACCAT GGCTAATTCC CATGTCAGCC GTTAAGTGTT 1081 CCTGTGTCAC TGAAAATTGC TTTGAGAGGC TCTAAGGGCT TCTCAGTGCG TTACATCCCT 1141 GGCTTGTTGT CCACAACCGT TAAACCTTAA AAGCTTTAAA AGCCTTATAT ATTCTTTTTT 1201 TTCTTATAAA ACTTAAAACC TTAGAGGCTA TTTAAGTTGC TGATTTATAT TAATTTTATT 1261 GTTCAAACAT GAGAGCTTAG TACGTGAAAC ATGAGAGCTT AGTACGTTAG CCATGAGAGC 1321 TTAGTACGTT AGCCATGAGG GTTTAGTTCG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTTAAACAT 1381 GAGAGCTTAG TACGTGAAAC ATGAGAGCTT AGTACGTACT ATCAACAGGT TGAACTGCGG 1441 ATCTTGCGGC CGCAAAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA 1501 AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT 1561 ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG 1621 CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA 1681 TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT 1741 ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT 1801 TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT 1861 TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT 1921 GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC 1981 CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC 2041 CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT 2101 GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG 2161 AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT 2221 ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC 2281 TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA 2341 GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG 2401 AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA 2461 TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGCAT CGATGGCCCC 2521 CCGATGGTAG TGTGGGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 2581 CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT 2641 CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCGGGAGCG GATTTGAACG TTGCGAAGCA ACGGCCCGGA 2701 GGGTGGCGGG CAGGACGCCC GCCATAAACT GCCAGGCATC AAATTAAGCA GAAGGCCATC 2761 CTGACGGATG GCCTTTTTGC GTGGCCAGTG CCAAGCTTGC ATGC