桔青霉素人工抗原合成及偶联比测定

李娇

1,2

,钟理

,田世民2,金涌2,崔艳芬3,任香夫2,祁淑红2,刘畅2

(1.河北大学生命科学学院,河北保定071002;2.中国检科院综合检测中心,北京100123;3.天津泰达园林建设有限公司,天津300457)

摘要　[目的]建立一种快速准确测定人工抗原偶联比的方法。[方法]通过载体蛋白BS A 合成桔青霉素人工抗原,用S DS 2P A GE 电泳法、紫外吸收法、质谱法对其进行鉴定。[结果]经过3种方法的鉴定,桔青霉素人工抗原偶联成功,紫外吸收法测得其偶联比为8.4,质谱法测得其偶联比为6。[结论]对3种供试方法比较发现,质谱法能够快速鉴定人工抗原而且能够准确测定人工抗原的偶联比。该研究为桔青霉素克隆抗体的制备及建立桔青霉素的酶联免疫检测方法奠定了基础。关键词　桔青霉素;人工抗原;偶联比;质谱中图分类号　Q 812 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2010)36-20737-03Syn th esi s of C i tr i n i n A r ti f i c i a l An t i gen an d Its Coup li n g Ra t i o D eterm i n a ti on L I J i a o et a l (College of L ife Scien ce,Hebei Un iv ersity,Baod ing,H ebe i 071002)

A b stra ct [Ob jecti ve ]This study ai med t o estab lish a detec ti on meth o d t h at cou ld rap id l y and accurately identify the coup ling rati o of artificial an tigen .[Meth o d ]Citrin i n a rti ficial an tig en was s yn t he si zed by BS A and identi fied by S DS 2PAGE electrophore sis,UV ab s orp tion and mass s p ectro metry res p ecti vely .[Re s u lt]Aft e r th ree method s of i den tificati o n,citri n in artificial antigen was cou p led successfu lly .Cou p li ng rati o was 8.4by UV absorp ti o n wh ile 6by mass s p ec tro metry .[Conc l u si o n ]The co mpa rison of th ree ex pe ri mental met hod s s ho wed thatmass s p ec 2tro metry could rap i d ly iden tify t he artificial an tigen and accu rately detect its coup ling ratio .This study had p rovided basis for t he p repa rati o n of citrinin anti gen as well as the estab lish ment of ELAS A de t e r mination meth o d of citrinin .Key wor ds Citrin i n;A rti ficial an tigen;Coup ling ra ti o;Mass s p ectro metry

基金项目　国家863基金项目(2007AA10Z42621)。作者简介　李娇(),女,河北保定人,硕士研究生,研究方向食

品生物技术。3通讯作者。

收稿日期　22 桔青霉素(Citrinin,C IT)分子式是C 13H 14O 5,分子量250,在319、253和222nm 紫外光下具有吸收峰。其由桔青霉等多种霉菌产生[1]

,易污染大米、小麦[2]

、玉米

[3]

、面粉

[4]

和饲料[5]

。桔青霉素是毒性很强的真菌毒素,它能引起肾毒

性

[6]

,致癌[7]

、致畸

[8]

、致突变

[9]

。近年来有研究发现,在红曲霉发酵晚期也产生桔青霉素

[10]

。桔青霉素的存在给我国

粮食带来严重影响,也使我国的红曲出口受到严重威胁。

免疫检测分析方法因特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点,在生物毒素检测领域日益受到关注

[11]

。桔青霉素属

小分子化合物,其本身没有免疫原性,在小分子半抗原的免疫分析中,合成具有免疫原性的人工抗原是建立免疫分析方法的关键[12]

。其中,半抗原与载体蛋白的偶联比是影响下一步单抗制备的重要因素,过高或过低的偶联比都会影响抗

体的生成

[13]

。因此,对合成人工抗原的鉴定及偶联比的快

速准确测定也是建立免疫分析方法的关键。目前,鉴定人工抗原的方法较多,有S D S 2PAGE 电泳法、紫外吸收法、红外光谱法、核磁共振法、同位素跟踪联合薄层层析法、质谱法等。笔者采用SDS 2P A GE 电泳、紫外吸收法、质谱法3种方法对合成的桔青霉素人工抗原(Cit 2BS A )进行鉴定,并进行比较,以期发现一种能够快速准确鉴定人工抗原及偶联比的方法。1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　试剂。桔青霉素、牛血清白蛋白(BSA )、无水吗啉乙磺酸(MES)、EDC HCl,Sig ma 公司;BAC Protein Assay Kit,美国Ther mo 公司;甲醛、无水乙二胺、甲醇,国产分析纯。1.1.2　仪器。UV 22501紫外可见分光光度计,日本岛津公司;MALD I 2T O F/T OF 4700基质辅助激光解吸电离飞行时间

质谱,美国AB I 公司;高精度数控摇床,上海堪鑫仪器设备有限公司;垂直板电泳仪,北京六一仪器厂。1.2　方法

1.2.1　偶联物的制备。按参考文献[14]的方法并有所改进,合成桔青霉素抗原:取1.2ml 乙二胺加入8ml 水,再加入6mol/L 盐酸5.5ml,用2mol /L 盐酸调pH 值至5.0。加入200mg BS A 、12mg E DC HCl,12℃反应24h (摇床120r/min)。之后用超纯水透析48h 后,再取出200μl 加入120μl 水,80μl (0.5mol/L MES)缓冲液,30μl 的桔青霉素标准品,50μl 甲醛,37℃反应2h 。最后用0.01mol/L (pH =7.4)磷酸缓冲液(PBS )透析24h 。1.2.2　偶联物的鉴定与偶联比计算。

(1)SDS 2PAGE 电泳方法。配制各种电泳溶液,浓缩胶浓度5%,分离胶浓度12%,浓缩胶电压120V,分离胶电压80V,上样量20μl,考马斯亮蓝染色1h,置脱色液中脱色至条带清晰。

(2)紫外扫描方法。共分为3个步骤:①用35%的甲醇溶液溶解桔青霉素标准品,终浓度为2.5mg/ml,用0.01mol /L PBS 倍比稀释,配制成0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mg/ml 的系列质量浓度,分别进行紫外图谱扫描;从桔青霉素的紫外图谱上读出最大吸收峰处的吸光度A max ,绘制桔青霉素浓度对吸光度的标准吸收曲线。②透析后的Cit 2BS A 偶联物经BAC Protein Assay Kit 测定得其浓度,用0.01mol/L PBS (pH =7.4)倍比稀释至浓度为110、0.5、0.25、0.125mg/mL,进行紫外图谱扫描。分别读出280、319n m 处的吸光度值A 280、A 319。③偶联比的计算。近似认为BS A 在反应和透析过程中不发生分解和损失等,则可将偶联物的浓度近似看成BSA 浓度,将测偶联物紫外图谱时读出的A 319代入“步骤①”所制得的标准曲线中求出偶联物中桔青霉素的浓度,将BS 的质量浓度换算成摩尔浓度,两者相除,所得比值即为偶联比。

安徽农业科学,J ou rnal of Anhui Agri .Sci .2010,38(36):20737-20739责任编辑　陈娟　责任校对　况玲玲

1984-:20101022