动物组织小分子RNA的提取
动物组织小分子RNA的提取
该方案适合于从≤100mg动物组织中富集小分子RNA(<200nt)。若不需要去除大分子RNA(>200nt)，可按方案8抽提总RNA(含大分子RNA和小分子RNA)。
1.组织用量
组织用量是RNA产量和纯度的关键因素。试剂盒的组织用量可低至0.01mg，但最大的组织用量取决于样品中RNA、蛋白质和杂质的含量。
●动物脑组织、脂肪组织，RNA含量较低，组织最大用量可至100mg；
●动物肝脏、脾脏、肾脏、胸腺等，含有丰富的RNA，组织用量不要超过30mg；
●心脏、肌肉、皮肤含有中丰度的RNA，组织用量不要超过80mg。
HiPure RNA Mini Column结合能力为200μg。过多的组织用量会造成大分子RNA的污染。如果处理的组织没有相关的信息，我们推荐第一次起始用量为30mg，根据获得的结果来提高或降低组织的用量。[对多数组织，3mm立方块的重量约为25-40mg。]
2.组织的裂解和匀浆：按10-100mg的组织量，加入1ml MagZol Reagent。选择合适的匀浆工
具进行匀浆，详细参照第5-6页“样品的打散及匀浆”。
3.室温放置2-3分钟让组织充分裂解。
4.(可选)4℃，12,000 x g离心10分钟。小心转移上清液至新的离心管中。
处理脂肪样品时，离心后溶液表面会飘浮一层油脂类，小心吸弃油脂层。
5.加入200 μl氯仿至裂解液或上清液中。用手剧烈振荡15秒；室温静置3分钟。
用涡旋取代振荡会带来更多的基因组DNA污染。氯仿必须按比例加入，过多的氯仿会逼使DNA和蛋白质回到水相中，导致RNA的纯度下降。由于氯仿挥发性强，毒性较大，亦可用100μl BCP(1-Bromo-2 chloropropane)代替。
6.4℃，12,000 x g离心15分钟。转移500μl上清液至新的1.5ml离心管中。按方案1的第6-16
步进行操作富集小分子RNA(第8页)，或按方案8进行操作提取总RNA(含小分子RNA)。
若需提取同时小分子RNA和大分子RNA时，按方案8进行操作。某些实验表明，方案8有利于提高小分子RNA产量的稳定性。初步使用时，建议对两个方案进行比较，根据实验结果进行选择。
实验九-动物组织中核酸的提取和鉴定
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。 H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O H3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O5 2、嘌呤碱：能与苦 味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸 (盐酸与硫酸)共热生成 糠醛，后者可与3;5二羟 甲基苯缩合成绿色化合 物。 (2)脱氧核糖：在强 酸中加热，可生成ω—羟 基γ—酮基戊醛，后者再 与二苯胺作用生成一蓝 色化合物。 上述二反应如下 【操作】
(一)核酸提取 l、用酚提取法： （1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 （3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心， （4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解： 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定： 取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定：
QIAGEN试剂盒——动物组织样品DNA提取方法
QIAGEN试剂盒提取组织DNA 试验前的注意事项 1、仔细阅读试剂盒使用说明。 2、所有的离心操作应在15-25℃下完成。 3、涡旋一般进行5-10s。 4、对于福尔马林或石蜡浸泡过样品，另见说明。 5、总RNA提取另见说明。 试验准备 1、Buffer ATL 和 Buffer AL保存时可能会出现沉淀，如果必要的话，可置于56°C 水浴至完全溶解。 2、提供的Buffer AW1 和 Buffer AW2是高浓度液，使用前需用96-100%的乙醇稀释至瓶子上注明的使用浓度。 3、预备一个热的振荡器或摇床或摇动的平板至56°C备步骤2使用。 4、如果为冻存的组织，需要将其溶至室温。但是要避免此类的反复溶解。 应额外准备的物品： 200μL枪及枪头；20μL枪及枪头；2mL的微量离心管；96-100%乙醇；56℃水浴锅；离心机（20,000×g(14,000rpm)）；小镊子；振荡器
操作步骤： 1、取25mg的动物组织（脾脏最多10mg）粉碎成碎片放入1.5ml的微量离心管中。对于啮齿类的尾巴，择取两只小鼠或一只大鼠尾巴0.4-0.6cm。加入180μL buffer ATL，并将对应的动物作以标记。 （保证足够量的组织样本，对于脾脏由于其细胞含量丰富，我们建议不超过10mg。我们强烈建议将组织粉碎以便于溶解提取DNA。最好的方法是在添加bufferATL和蛋白酶K之前置于液氮中冻融。同时，也可以采用QIAGEN公司产的几种组织匀浆机进行组织粉碎） 2、加入20μL蛋白酶K，涡旋混合均匀，56℃孵育直至溶解。在组织溶解的过程中不断（偶尔）涡旋使组织充分散开，或将该微量离心管置于摇晃的平台上，如摇床等。（不同组织溶解时间不同，通常组织为1-3h，小鼠尾巴为6-8h。如果试验条件许可，可以溶解过夜，其不会影响DNA提取） 3、涡旋15s。加入200μL buffer AL 并涡旋使充分混匀，70℃孵育10min，然后加入200μL乙醇（96%-100%），再次涡旋混合。 （如果在做多个样品时，可以将buffer AL和乙醇先混合均匀，一起加入到组织中涡旋均匀。在添加bufferAL与乙醇后可能会出现白色沉淀，该沉淀不会影响试剂盒的操作。一些组织（如脾脏）添加了bufferAL与乙醇后出现凝胶状产物，这种情况下，我们建议剧烈摇晃或涡旋样本使之消失。70℃孵育10min该步骤在我在河南农大用的盒子操作中没有） 4、移出步骤3中的混合物（包括沉淀物）至DNeasy Mini spin column，该柱子放在一2mL收集管中（本试剂盒提供的）。6000 × g(8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。 13000 rpm 5、将DNeasy Mini spin column放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW1，6000×g (8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。 6、将DNeasy Mini spin column 放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW2，20,000 ×g (14,000 rpm)离心3min，使Dneasy膜干燥，收取管子，弃去滤液。 （使DNeasy Mini spin column膜干燥是非常重要的，因为残留的乙醇会影响下面的反应。这个离心步骤就是为了确保没有残留的乙醇影响下步的洗脱。离心后，小心地取出DNeasy Mini spin column防止其与下边的滤液接触。如果与下边的滤液接触沾了少量乙醇则需要再次20,000×g(14,000rpm)离心1mim） 7、向DNeasy Mini spin column膜移入1mL或2mL的微量离心管中（本试剂盒不提供）直接加入200μL buffer AE，清洗DNeasy Mini spin column膜，室温孵育1min，然后6000 × g(8000 rpm)离心1min。 （为了DNA浓度可将200μL buffer AE改为100μL，但是这样会减少DNA的总产量） 8、推荐：如果需要获取最大量的DNA，可将步骤7重复1次。 （使用一个新的1mL或2mL的微量离心管，这样可防止降低前者DNA浓度。当然也可以使用前者离心管） 注意：洗脱液不要多于200μL，以防止滤液过多与DNeasy Mini spin column发生接触。
动物肝脏中DNA的提取检测实验报告
动物肝脏中DNA的提取及检测 一、前言 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。 DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。 在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟
核内。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。 脱氧核糖核酸的结构 DNA的结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。 DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP 脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP 脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP 脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA（信使RNA）的核酸分子。 DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA含有两条这样的长链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。DNA 有环形DNA和链状DNA之分。在某些类型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年
动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书
磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Tissues Gen DNA Extraction Kit 【目录号】TGDE-5005、TGDE-5030 【运输条件】2~25℃； 【保存条件】磁珠悬浮液2~8℃，其它组分室温保存； 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，使用前请充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现结晶，如有结晶请置于65℃水浴重新溶解； 3. 在使用本试剂盒前，请用户自配80%乙醇； 4. 如需去除RNA请自备RNase A溶液（100mg/mL, 分散液10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH值8.0）； 5. 本操作指南经本公司反复验证，使用前请仔细阅读，并且按照操作指南的建议操作。
磁珠法·自动化：为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案 【产品简介】 本产品适用于从各种动物组织以或者细胞样本中提取基因组DNA。试剂盒采用具有独特分离作用的纳米磁珠和独特的缓冲液系统。特殊技术包埋的纳米磁珠在特定条件下对核酸具有极强的亲和力，而当条件改变时可以释放所吸附的核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的。 本试剂盒提取所得基因组DNA产物得量高、纯度好，适用于各种下游分子生物学实验，如：酶切、PCR、QPCR、文库构建、Southern 杂交、芯片检测和高通量测序等。本试剂盒可配合核自动化酸提取仪或工作站使用，实现高通量操作。 【试剂盒说明】 【自备仪器、耗材及试剂】 仪器自动版 研钵（或组织研磨机、匀浆机）、英芮诚ETP-300型全自动核酸提取仪、核酸提取仪配套用磁棒套、水浴锅或金属浴、涡旋振荡仪、96孔方孔圆底板、80%乙醇、异丙醇、液氮。 手动版 研钵（或组织研磨机、匀浆机）、水浴锅或金属浴、涡旋振荡仪、真空干燥箱、80%乙醇、异丙醇、2.0mL离心管、离心管配套用磁力架、液氮。 【仪器自动版操作步骤】 本操作以英芮诚ETP-300型全自动核酸提取仪为例，同步可完成32个样本的提取。 1．准备96孔板 参照下表向96孔板各孔位中分别加入相应试剂：
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取 一、实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。 二、仪器及试剂 1. 仪器： 恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌） 2. 试剂： （1）细胞裂解缓冲液： Tris (pH8.0) 100 mmol/L EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L NaCL 20 mmol/L SDS 10%
胰RNA酶20ug/ml （2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。 （3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。 （4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、 （5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。 三、操作步骤 1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行） 3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。 8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。 10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
动物基因组DNA的提取流程总结
动物基因组DNA的提取 1.切取组织5g左右，用组织粉碎机或研钵将细胞分离。 注：1）少量结缔组织并不影响最后得到的DNA的质量；2）若标本为血液，则只需肝素抗凝、离心后取白细胞层；3）若为培养的贴壁细胞，则用胰酶消化后收集，PBS洗涤即可。 2.加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-Cl，0.1 mol/L EDTA，0.5% SDS), 混匀。 注：1）最好先加入Tris-Cl、EDTA，再加入SDS；2）最好一边匀浆，一边加入液体，使之充分混匀。 3.加入25ul 蛋白酶K，使终浓度达到100ug/ml，混匀，37℃温浴过夜。 注：1）致密组织（如小鼠尾巴）可以适当延长蛋白酶的作用时间；2）若组织量很大且组织比较疏松（如动物脾脏），或对所提取的DNA完整性要求不高时，可以不用蛋白酶K，而是剧烈振荡20分钟，将组蛋白与ＤＮＡ分离。 此法可能会使部分DNA链断裂，但足以达到一般实验要求，并不影响后续处理；3）也可同时加入RNase。 4.加入等体积的酚－氯仿－异戊醇混合物(25:24:1)，剧烈振荡10分钟，冰浴 10分钟，2500rpm 10分钟离心收集水相。 注：不要混带中间蛋白层。 5.加1/10体积3mol/L NaAc 及2倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒混匀。冰浴 １小时，沉淀DNA。 注：冰浴时间从10分钟到２小时均可，只是时间太短会影响到最后的产量，但不影响质量。 6.用玻棒轻搅钩出DNA沉淀，置于另一离心管中。 注：如果确信没有混入蛋白，也可用离心的方法去除液体，但应在加入蛋白酶K的同时加入RNaseA。 7.70%乙醇洗涤，晾干，加适量TE或灭菌水溶解，-20℃保存。 注：若要长久保存DNA（数年以上），最好将其沉淀以无水乙醇封闭后，置于-80℃。
动物组织基因组DNA的提取
实验一动物组织基因组DNA的提取 一、实验目的 掌握从动物组织中提取总DNA的方法。 二、实验原理 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA 是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。 染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。 整个实验可分为细胞裂解、DNA分离与纯化和DNA的洗脱收集。1.细胞裂解：酶法（蛋白酶K）。2. DNA分离与纯化：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。本实验采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒中的硅基质材料的离心吸附柱。硅基质材料吸附核酸的原理，主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。 三、材料、试剂和设备 1.材料：动物组织 2.试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等 3.设备：离心机，微量移液器等 四、实验步骤 1.处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。 2.加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同， 通常需1-3小时即可完成）。简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。（细胞裂解） 3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以 去除管盖内壁水珠。（溶解DNA） 注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA 不纯。 4.加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管 盖内壁的水珠。（沉淀DNA） 5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，
实验九动物组织中核酸的提取和鉴定
实验七 动物组织中核酸的提取和鉴定 【原 理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C 等。 H 3PO 4＋12H 2MoO 4→H 3PO 4·12MoO 3+12H 2O H 3PO 4·12MoO 3 H 3PO 4·6MoO 3·3Mo 2O 5 2、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。 (2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成ω—羟基γ—酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。上述二反应如下 【操 作】(一)核酸提取l、用酚提取法：（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管 吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml 比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml 于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml 充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾
动物组织块DNA的提取
【实验目的】 （1）学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。 （2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。 【实验原理】 DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。 【仪器、材料、试剂】 （一）仪器 1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴锅 5．微量移液器 6．高压灭菌锅 （二）材料 1．生理盐水 2．十二烷基硫酸钠（SDS） 3．三羟甲基氨基甲烷（Tris） 4．乙二胺四乙酸（EDTA） 5．饱和酚 6．氯仿 7．异戊醇 8．无水乙醇 9．75%乙醇 10．蛋白酶K 11．RNase酶 12．手术剪刀、镊子、吸水纸 13．微量取液器 14．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔
（三）试剂配制 1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法： 40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml 容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。 2．生理盐水: 0.85%NaCL 100ml 配制方法： 在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。 3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法： 将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。 4．TES缓冲液（释放DNA）100ml 配制方法： 将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml 的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。 5．10% SDS（变性剂破细胞壁）100ml 配制方法： 将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。6．蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。 7．RNA酶（降解RNA） 配制方法： 将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20℃。8．氯仿：异戊醇=24：1 100ml
动物基因组DNA的提取 DNA实验技术方法汇总
动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液
动物组织 细胞基因组DNA提取试剂盒使用说明
动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒使用说明货号：D1700 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：D1700-50T D1700-100T RNase A1ml1ml×2 蛋白酶K1ml1ml×2 溶液A10ml20ml 溶液B10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 说明书1份1份 产品简介: 本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取组织和细胞的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。
操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入休积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、样品的处理： a、细胞：取1×106-1×107个悬浮培养细胞，12000rpm离心1mi n 收集细胞，贴壁细胞先用胰蛋白酶消化处理，再用预冷的PBS吹打成细胞悬液，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。 b、组织：组织量不宜过大，一般不要超过25mg，可以使用匀浆器匀浆，最好用液氮研磨成粉末状，再用预冷的PBS或无菌水充分悬浮，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。 2、向悬浮液中加入20ul(10mg/ml)的RNase A，55℃放置15min。 3、加入20ul(10mg/ml)的蛋白酶K，充分颠倒混匀，55℃水浴消化，细胞消化时间较短，组织消化时间较长，一般需要1-3个小时才能完成（鼠尾需要消化过夜）。消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。 消化完全的指标是：液体清亮及粘稠。 4、加入200ul体积溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可放置于75℃15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致堵塞吸附柱。 5、加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影
DNA提取方法
从动物组织提取基因组DNA 一、材料 哺乳动物新鲜组织。 二、设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 三、试剂 1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA 。 2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) ，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步骤: 1. 切取组织5g 左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml 分离缓冲液。 3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 4. 加50ul 或1mg 蛋白酶 K, 37 ℃保温1-2 小时, 直到组织完全解体。 5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm 离心数秒钟。 6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 抽提。待分层后,3000rpm 离心 5 分钟。 7. 取上层水相至干净离心管, 加2 倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20 分钟， DNA 沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出DNA 沉淀,70% 乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE 中,-20℃保存。 11. 如果DNA 溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm 短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30 分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10 重沉淀DNA。
植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析
《分子生物学》实验报告 实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssR NA 40 μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL 量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、 1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品
实验一 CTAB法提取植物基因组DNA
实验一CTAB法提取植物基因组DNA 实验目的： 学习从植物组织中（幼叶）提取基因组DNA的基本原理和方法。 实验原理： 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类），其对DNA的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热（65度），且离心温度不要低于15度。 实验步骤： 1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。 2、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。 3、吸取上层水相，重复步骤2一次。 4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。 5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA（10mg/ml），37℃保温1h以除去DNA中的RNA。 6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。 7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20℃冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70％乙醇洗涤2-3次，风干，最后将DNA溶于适量（200-500μl）TE中。
动物组织块DNA的提取
实验目的】（1 ）学习并掌握动物组织总DNA 的提取方法及其原理。 （2 ）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA 样品。 【实验原理】 DNA 是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS 作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase 降解RNA ，从而得到纯净的DNA 分子。【仪器、材料、试剂】 （一）仪器1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴锅 5．微量移液器 6．高压灭菌锅 （二）材料 1．生理盐水 2．十二烷基硫酸钠（SDS ） 3．三羟甲基氨基甲烷（Tris ）4．乙二胺四乙酸（EDTA ） 5．饱和酚 6．氯仿 7．异戊醇 8．无水乙醇 9．75% 乙醇 10．蛋白酶K 11．RNase 酶 12．手术剪刀、镊子、吸水纸 13．微量取液器 14 ．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL 离心管架、记号笔 三）试剂配制 1.Tris -HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法： 40ml 双蒸水，6.057g 固体Tris 放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH 值到8 . 0 ，转移到50ml
容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 C保存备用。 2.生理盐水: 0.85%NaCL 100ml 配制方法： 在20ml 双蒸水中溶解0.85g 固体NaCL ，加水定容至100ml ，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4C保存备用。 3.EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法： 将9.08g的EDTA Na2?2H2O 溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入） 调PH 值到8.0，用50ml 容量瓶定容，如果EDTA 难溶，先加NaOH 溶解，然后逐步加 EDTA- Na2-2H2O。 4.TES 缓冲液（释放DNA ）100ml 配制方法： 将0.5844g 的5 mol/lNaCl 溶解于80ml 双蒸水，在分别加入1ml 的0.5 mol/l EDTA 、 0.2ml 的Tris-HCl （pH=8.0），加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 C保存备用。 5.10% SDS （变性剂破细胞壁）100ml 配制方法： 将10g的十二烷基硫酸钠（SDS ）溶解于80ml双蒸水于68 C加热溶解，用浓HCI调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签， 4 C保存备用。 6.蛋白酶K （降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。 7.RNA 酶（降解RNA） 配制方法： 将胰RNA 酶（RNA 酶A）溶于10mmol/L 的Tris CL （PH7.5 ）、15mmol/LNaCL 中，配成 10mg/ml的浓度，于100 C加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于￡0 C。 8.氯仿：异戊醇=24：1 100ml 按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4C保存备用。9．TE 缓冲液（溶解DNA）PH8.0 50ml 配制方法：