中国明对虾与5种虾类线粒体16SrRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步

第27卷第1期海南大学学报自然科学版Vol.27No.1 2009年3月NATURAL SC I ENCE J O URNAL O F HA I NAN UN I VERS I T Y Mar12009 文章编号:1004-1729(2009)01-0015-09

中国明对虾与5种虾类线粒体16S rRNA和

CO I基因片段的序列比较及其系统学初步研究

麦维军1,谢珍玉2,张吕平1,沈　琪1,胡超群1

(1.中国科学院南海海洋研究所,广东广州510103;2.海南大学海洋学院,海南海口570228)

摘　要:采用PCR扩增和序列测定等技术,对中国明对虾(Fennerpenaeus chinensis)线粒体DNA16S r RNA和

细胞色素氧化酶I(CO I)基因片段进行了初步研究,分别得到16S r RNA和CO I2个基因片段的碱基序列,其

中16S r RNA基因片段的大小为515bp,碱基A+T,G+C的组成分别为66.47%和33.53%;C O I基因片段

的大小为472bp,碱基A+T,G+C的组成分别为62.50%和37.29%.在2种基因片段中,AT的组成明显高

于GC的组成,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的16S r RNA和C O I基因片段的研究结果相似.通过对中

国明对虾16S r RNA和C O I2个基因片段遗传特征的研究,16S r RNA只有8处核苷酸的碱基在4个群体间表

现出差异,CO I基因片段中共检测出24个多态性核苷酸位点,其种内变异较低.另外,将本研究所得序列与

Gen Bank中对虾科5个种的16S r RNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类关系与传统分类相一致.

关键词:中国明对虾;16S r RNA基因;CO I基因;PCR;多态性

中图分类号:Q789 文献标识码:A

中国明对虾(Fennerpenaeus chinensis)广泛分布于我国黄海、渤海,东海和南海也有少量分布,是我国最重要的海水养殖虾类,年总产量创造过70万t的世界记录[1-3].与其他对虾类养殖相似,迄今为止,养殖的对虾均为未经遗传选育的野生种群,尚未形成养殖品系.加之各种人为和自然因素的影响及对虾病的猖獗,从而使得我国中国明对虾野生资源面临种质衰退的危险,因此对其遗传种质和种群遗传结构进行研究成为目前的当务之急.

在过去的几十年里,对中国对虾的研究主要集中于形态、发育、养殖、渔业捕捞和增殖放流等方面[1],关于其遗传背景的研究始于20世纪80年代,同工酶[4]、RAP D[5]等技术被应用于其遗传多样性的研究,并取得了一定的进展,但相比之下,我国对中国对虾遗传背景还缺乏深入的了解,因此,有必要对中国对虾的遗传多样性进行进一步的研究.有关南海中国明对虾群体遗传方面的研究还未见报道.为此,笔者采用PCR扩增和序列测定技术,对中国明对虾线粒体DNA16S r RNA和CO I基因片段进行了初步研究,以期为中国明对虾的种质资源的管理、遗传选育提供分子遗传学基础.

1　材料和方法

1.1　实验材料　中国明对虾标本于2005年10～12月分别采自烟台(YT)、青岛(QD)、珠海(ZH)和阳江(YJ),除阳江样品为养殖虾外,其余样品均为海捕虾.所有活体标本均浸泡于φ=80%～l00%的酒精中,并于-20℃冰箱保存备用.

1.2　实验方法

1.2.1　基因组总DNA提取　约取100mgφ=90%的酒精保存的肌肉组织,先于4℃下用蒸馏水浸泡24 h(中间更换2次蒸馏水),再尽量将其剪碎.用酚氯仿抽提法提取基因组DNA[6],经TE溶解后,于-20℃

收稿日期:2008-05-22

基金项目:“863”国家重点基础研究发展规划项目(006AA10A406),中科院知识创新工程项目

作者简介:麦维军(1978-)男,广东高要人,中国科学院南海海洋研究所博士.

下保存备用.

1.2.2　PCR 扩增　CO I 基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为:CO I L1490:5-GGTCAACAAAT CAT A 2

AAG AT ATTGG -3,CO I H2198:5-T AAACTTCAGGGTG ACCAAAAAAT CA -3[7];16S 基因片段扩增所用

引物的核苷酸序列为:16S AR:5-CGCCTGTTT ATCAAAAACAT -3,16S BR :5-CCGGTCTG AACT 2

CAG ATCACGT -3[8].PCR 扩增在PTC -100型PCR 仪上进行,25μL 反应体积内含:2.0mmol MgCl 2,0.2

mmol 每种d NTP,0.2μmol 每个引物,20ng DNA 模板,0.5U Taq 酶及10×缓冲液(购自TaKa La ).PCR 反应程序:94℃2m in,然后94℃45s,48℃l m in,72℃1m in,循环35次,最后72℃5m in 延伸.PCR 产物在w =1%的琼脂糖凝胶中电泳,EB 染色,凝胶成像系统观察、照相.

1.2.3　PCR 产物纯化测序　用上海生工公司UN I Q -10PCR 产物纯化试剂盒纯化.使用上海生工公司的AB I PR I S MT M 测序系统进行双向测序,并进行人工核对、矫正.

1.2.4　数据分析　测序后利用“GENEDOC ”软件进行对位排序.采用MEG A 4.0分子进化遗传分析软件进行数据处理及群体遗传结构分析,采用软件中的Neighbor 2Joining (邻接法)绘制分子系统树,置信度用Bootstrap 值估计.

2　结果与分析

2.1　16S r RNA 和CO I 基因序列及其多态性　经PCR 扩增,得到清晰的16S r RNA 和CO I 基因片段扩增产物,纯化后直接进行双向序列测定.从测序结果可以知道,16S r RNA 和CO I 基因片断的大小分别为515bp,472bp.其中16S r RNA 基因片段的大小为515bp,碱基A,T,G,C 的组成分别为32.95%,3

3.53%,19.71%和13.76%;CO I 基因片段的大小为472bp,碱基A ,T,G,C 的组成分别为25.85%,36.65%,17.80%和19.49%.4个群体的16Sr RNA 基因片段中,可被清楚判读的约为由515bp 组成的核苷酸链.在这515个核苷酸中,只有6处核苷酸的碱基在4个群体间表现出差异,即第242,254,303,350,358及400位的碱基,相比之下,第1～231位的碱基却相对较保守,未发现核苷酸突变位点(见图1).多态性核苷酸位点只占该DNA 片段核苷酸数的1.16%,在群体间进行两两比较,其变化就更微小.对取自不同海区的中国明对虾个体的总DNA 进行PCR 扩增,获得472bp 的CO I 基因片段,共检测出24个多态性核苷酸位点(5.08%).产生插入/缺失(inserti on /deleti on )突变的核苷酸位点共1个,发生转换(transiti on )的核苷酸位点共10个,颠换(transverti on )为13个(见图2),第327～445位碱基之间的DNA 存在高频率的多态性核苷酸位点(5

4.1%)

.

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图1　中国明对虾4个种群及5种对虾的16S r RNA 基因片段序列

(“.”表示核苷酸序列与中国明对虾相同;“-”代表核苷酸插入/缺失

)

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图2　中国明对虾4个种群及5种对虾的C O I 基因片段序列

(“.”表示核苷酸序列与中国明对虾相同;“-”代表核苷酸插入/缺失)

6种虾类16S r RNA 基因片段相同部分的长度为399bp,其同源性比为73.8%,在116个变异位点中有12个插入或缺失位点(见图1).6种对虾的CO I 基因片段有比较多的转换或颠换,同源性为57.2%(见图2).

2.2　遗传距离D 以及分子系统树分析　利用Mega 2.0软件计算各地理群间的无偏差遗传距离D 值(见表1和表2).其中,QD 和YT 间的遗传距离最近,相似性系数最高,其次是Z H 和ZJ 两地理群间,QD 及YT 与南海沿岸2个地理群的遗传距离相对较远.

表1　基于16S r RNA 基因片段计算的中国明对虾4个群体及5种对虾的遗传距离(D )

s pecies

123456789F .chinensis 2QD

F .chinensis 2YT

0.002F .chinensis 2Z H

0.0040.007F .chinensis 2YJ

0.0090.0110.004F .m erguiensis

0.0320.0340.0370.037F .penicillatus

0.0360.0390.0410.0460.014P .m onodon

0.0800.0830.0860.0910.0760.076L.vannam ei

0.1260.1290.1310.1310.1050.1100.118M.japonicus 0.1040.1070.1100.1150.0960.1020.0940.138

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表2　基于CO I 基因片段计算的中国明对虾4个群体及5种对虾的遗传距离(D )

s pecies

123456789F .chinensis 2QD

F .chinensis 2YT

0.004F .chinensis 2Z H

0.0260.031F .chinensis 2YJ

0.0140.0280.002F .m erguiensis

0.2010.1950.2270.225F .penicillatus

0.2150.2200.2120.2150.171P .m onodon

0.2340.2390.2250.2250.1960.189L.vannam ei

0.2310.2360.2220.2220.1930.1920.002M.japonicus 0.

2130.2150.2010.2010.2050.1810.0680.066

根据遗传距离值用邻接法(Neighbor 2Joining )对表1和表2数据进行处理,绘得树状图(见图3、4),比较中国明对虾4个群体间的亲缘关系,黄海和渤海沿岸群中QD 和YT 的遗传距离最小,亲缘关系最近;南海沿岸群中的Z J 和Z H 的亲缘关系较近,与QD 和YT 聚为一大类.

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3　讨　论

中国明对虾4个群体的遗传距离(D)用Ki m wa2para meter方法计算,其结果列于表1和表2.用Neigh2 bor2Joining(邻接法)对表1、2数据进行处理,绘得树状图(见图3、4),并比较中国明对虾4个群体间的亲缘关系.由表1可见,中国北方2个中国明对虾群体,即青岛群体和烟台群体之间的D值为0.002,说明北方2个群体之间的遗传差异很小.这2个群体在地理分布上非常接近,因此这一结果与预期相吻合.中国南方2个群体之间的D值为0.004,遗传差异也较小,原因在于2个群体在地理分布上也很接近.而青岛和烟台群体与珠海和阳江群体之间表现出0.007～0.011的遗传距离,表明南北海区的中国明对虾群体存在一定程度的遗传分化.根据在各种动物中得到的结果,在地理种群一级的差异水平上,遗传距离大约在0.004～0.014之间[9].中国明对虾4个群体之间的遗传距离均未超出这一水平.从生殖习性来看,北方海区中国明对虾属春季生殖,而南方海区中国明对虾属秋冬季生殖类型[2-3];从地理位置和气候来看,南海与黄海、渤海相距遥远,南北气候相差较大,南海北部沿岸属热带海洋性气候,黄海、渤海沿岸属温带海洋性气候,它们在地理条件、生态环境和繁殖习性上的较大差异直接导致了地理隔离和生殖隔离,所以在不同水域形成了遗传性能上互有差异的孟德尔繁育群体,两者明显属于相互独立的不同地方种群(或称为亚种群).

在传统的分类学中,对虾科的中国明对虾、墨吉对虾(Fernerpenaeus m erguiensis)和长毛对虾(Ferner2 penaeus pen icillatus)属于明对虾属,日本对虾(M arsupenaeus japon icus)属于日本对虾属,凡纳滨对虾(L itope2 naeus vanam ei)属于滨对虾属,斑节对虾(Penaeus m onodon)属于对虾属.利用BLAST在Gen Bank中进行同源序列查找,查得对虾科这4个属的5种线粒体DNA16S r RNA基因片段,并用Genedoc软件比较它们的相同部分.从比较的结果可以看出,这6种虾类16S r RNA基因片段相同部分的长度为399bp,其同源性比为73.8%,在116个变异位点中有12个插入或缺失位点.从图1还可以明显看出,这些插入或缺失位点主要集中在序列的中间,并且图3所显示的聚类结果与传统分类学相一致[10].但是,用同样的方法比较对虾科6种CO I基因片段,则发现CO I基因片段有比较多的转换或颠换,同源性为57.2%,这可能是因为CO I基因本身比16S r RNA基因对环境的敏感性要高的缘故[11-13].

线粒体DNA序列分析是DNA多态性分析技术中最有效的方法之一.因为不论个体还是群体,任何遗传变异或多态最终都是DNA序列的差异;DNA序列分析可以检测到碱基替换、插入和缺失等变异信息,从而在分子水平检测个体、群体及种间的多态及遗传差异;并且线粒体DNA具有进化速度快、变异性大、属母系遗传及易于扩增等优点.因此,通过线粒体DNA的多态性,可以对生物不同群体间的遗传结构变异和遗传多样性进行研究[12-16].本文对中国明对虾16S r RNA和CO I基因片段序列进行了初步的研究,分别得到515bp长度的16S r RNA和472bp的CO I基因2个基因片段的碱基序列,在这2种基因片段中,碱基AT的组成明显高于GC的组成,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的16S r RNA和CO I基因片段的研究结果相似,比如,在栉孔扇贝的16S r RNA中,AT和GC的组成分别是55.17%和44.83%,而在其CO I基因片段中,AT和GC的组成则为62.63%和37.37%[17].通过对中国明对虾16S r RNA和CO I2个基因片段遗传特征的研究,发现2者在种内的变异都比较低,但是,在不同种之间,16S r RNA基因片段则比CO I基因片段要明显保守些.另外,将本研究所得序列与GenBank中对虾科3个属的5种16S r RNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类结果与传统分类相一致.这进一步说明16S r RNA基因片段适合用于种间遗传多样性的分析(这些序列已被录入Gen Bank,登录号:DQ778650～DQ778659).

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Sequence Co mparison and Phylogeneti c Analysis of

m t DNA 16S rRNA and CO I gene Frag ments i n the Chi n ese Shri m p,

F ennerpenaeus ch inensis and Fi ve Speci es of Shri m p

MA IW ei 2jun 1,X IE Zhen 2yu 2,Z HANG L ü2p ing 1,SHE N Q i 1,HU Chao 2qun

1(1.South C hina Sea Institute of O ceanology,Science A cadem y of China ,G uangzhou 510301,China;

2.C ollege of M arine Science,H ainan U niversity,Haikou 570228,China )Abstract:M it ochondrial 16S r RNA and CO l gene frag ments of F .ch inensis were a mp lified via PCR,and then the PCR p r oducts were purified and sequenced .For 16S r RNA gene frag ments,515bp nucleotide sequences were obtained,and the A +T and G +C contents in this frag ment were res pectively 66.47%,3

3.53%.A s for the CO I gene frag ments,the size was 472bp and the A +T and G +C contents were 62.50%,37.29%res pec 2tively .Analysis of 16S r RNA and CO I gene frag ments indicated that:1)the AT content was higher than CG content,which was si m ilar t o the results of studies on dr os ophila,shri m p,crab and other invertebrates;2)f our fa m ilies fr om the test had 6variable nucleotide positi ons of 16S r RNA gene frag ments,but there were t w enty 2f our variable nucleotide positi ons about the sequence of CO I gene frag ments .I n additi on,it is f ound that the graph 2ical phyl ogenetic tree of 16S gene frag ment of five shri m p s in shri m p fa m ily is consistent with current syste matic of these s pecies .

Key words:Fennerpenaeus chinensis ;16S r RN A gene;CO I gene;PCR;poly mor phis m

3

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