HCV反向点杂交基因分型方法的建立_唐文志

·实验研究论著·[文章编号]1672-3619（2009）05-0533-04

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一种经血液传播引起慢性肝脏疾病的RNA病毒，由于病毒RNA复制酶缺乏校正功能，复制时易引起基因的突变，根据基因组序列差异，目前HCV主要划分为6种基因型，不同基因型的分布在世界范围内呈地域性差异［1，2］。据报道［3］，HCV基因型与丙型肝炎患者对干扰素（INF）的应答存在密切关系，因此，建立一种好的分型方法对HCV进行基因分型具有很高的临床实用价值。研究采用反向点杂交（RDB）技术为分型方法，并对方法的有效性进行评价，旨在建立一种适合临床应用的HCV基因分型方法。

HCV反向点杂交基因分型方法的建立

唐文志1，杨永强2*，黄小燕1，戴小波1，李宇雄1，谭星蓉1（1．广东省中医院珠海医院，珠海519015；2．中山大学达安基因诊断中心，广州510080）

【摘要】目的利用反向点杂交技术建立HCV基因分型新方法。方法在HCV5′端非编码区（5′NCR）设计引物和分型探针（1．2．3．6型），采用反向点杂交分型技术对53例HCV RNA阳性（浓度均在102～107IU／mL之间）血清进行分型，并以基因序列分析作为金标准，对新方法的敏感性、特异性和重复性进行评价。结果反向点杂交基因分型新方法检出的基因型有52例：1b型32例占60．38％，2a型4例占7．55％，6a型8例占15．09％，3b型8例占15．09％；未检出的基因型有1例，用基因序列分析也未能确定型別（失败的原因应是该HCV RNA 扩增产物浓度偏低2．24×102IU／mL）。本研究的方法敏感性为98．1％，特异性为100％，随机抽取20份标本再次检测的结果与前次检测的结果完全一致，重复性好。结论相对现有的型特异性PCR分型、基因芯片、核酸序列分析等各种方法，反向点杂交技术用于HCV基因分型是一种准确有效和简便经济的方法。

【关键词】丙型肝炎病毒；反向点杂交；基因分型

中图分类号：R512．63文献标识码：A

HCV Genotyping by Reverse Dot Blot

TANG Wen-zhi1，YANG Yong-qiang2*，HUANG Xiao-yan1，DAI Xiao-bo1，

LI Yu-xiong1，TAN Xing-rong1

（1．Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine Hospital in Zhuhai，Zhuhai

519015；2．Daan Gene Diagnosis Center，Sun Yat-sen University，Guangzhou510080，China）

【Abstract】Objective To develop a new HCV genotyping method using the reverse dot blot technique．Methods Primers and subtype probe（1．2．3．6type）specific for the UTR at the5′（5′NCR）regions were designed and used in this study．53cases of HCV RNA-positive（concentrations were between102～107IU／mL）samples were then analyzed using reverse dot blot and sequencing techniques．The sensitivity，specificity and reproducibility of this new method were then evaluated．Results Genotypes were positively identified in52samples with this new genotyping method．32samples were of1b-type（60．38％），4samples were2a-type（7．55％），8samples were6a-type（15．09％）and8samples were3b-type（15．09％）．The genotype of one of the samples was not confirmed as the concentration of the PCR products was too low（2．24×102IU／mL）．The sensitivity of this detection method was98．1％and the specificity was100％．Twenty samples were randomly selected and retested with this method，and the results were reproducible．Conclusion Compared with the type-specific PCR typing，gene chip and gene sequence analysis methods，reverse dot blot technique is accurate，simple and cost effective in the identification of HCV genotyping．【Key words】hepatitis C virus；reverse dot blot；genotyping

基金项目：广东珠海市科学技术局资助项目（No．PC20071002）。

作者简介：唐文志（1962－），男，副主任技师，主要从事微生物和

分子生物学研究。

*通讯作者：杨永强，E-mail：lanlan889889＠sina．com

1材料与方法

1．1标本来源

阳性标本：2008年1～3月收集来自广东省中医院珠海医院和达安基因诊断中心的HCV-RNA阳性血清53例，其中男29例，女24例，年龄介于16～85岁，其浓度均在102～107IU／mL之间。阴性对照标本：留取经抗－HCV和

HCV-RNA检测均阴性的正常人血清30份作对照。标本的处理：采静脉血4ml于30min内分离血清－30℃冻存备用。1．2主要仪器和试剂

1．2．1主要仪器BIO-RAD iCycler iQ荧光定量PCR仪；TGL-16G低温高速离心机；BenQ5000S扫描仪；测序仪；DNAstar分析软件等。

1．2．2主要试剂HCV-RNA定量试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司；杂交液1（2×SSC－0．1％SDS）与杂交液2（0．5×SSC－0．1％SDS）由达安基因诊断中心提供；显色液按如下的浓度和比例自配：0．1mol／L柠檬酸钠：2 mg／mL TMB（四甲基联苯胺）溶液：3％H2O2＝1900：200：1；POD溶液的配制为：2ml杂交液1：1ml POD（0．2U／mL 链酶抗生物素蛋白－辣根过氧化物酶结合物）。

1．3方法

1．3．1引物与探针的设计和膜条的制备

1．3．1．1引物与探针根据GenBank已发表的25株HCV 基因序列，以及DNADIST软件和Tree view软件中HCV的基因型特点，选择HCV5′端非编码区（5′NCR），采用Primer Premier5．0软件自行设计引物和型特异性探针（1．2．3．6型），在引物的5′端标记生物素，探针的5′端用活性氨修饰，引物和探针均由达安基因诊断中心协助合成。引物和探针序列见表1。

1．3．1．2膜条的制备用浓盐酸快速漂洗Biodynce C膜条，并在20％EDC溶液中浸泡15min，将分型探针点于膜上，室温孵育15min，再用NaOH、双蒸水漂洗，风干待用。膜条探针排列顺序见图1。

1．3．2模板的制备取灭菌的离心管（0．5ml）加入10μl RNA提取液A（充分混匀），加100μl血清，再加入200μl RNA提取液B，振荡混匀，室温放置5min，8000r／min离心1min，小心吸去上清液；加预冷的75％乙醇（DEPC水配制）400μl充分混匀，8000r／min离心1min，小心吸去上清液；再加预冷的75％乙醇400μl充分混匀；打开管盖，小心吸去上清液，65℃干燥10min，盖上管盖准备用于逆转录。阴性、阳性质控品处理（同标本处理）。

1．3．3逆转录、PCR扩增及HCV RNA定量测定向沉淀管内加入HCV-PCR反应液Ⅰ18μl以及逆转录酶2μl，震荡混匀，瞬时（3s）离心后37℃放置45min，95℃加热3 min。瞬时（3s）离心，吸取5μl逆转录产物，充分混匀，瞬时（3s）离心，将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93℃3min预变性，然后按93℃→45s，55℃→45s，72℃→45s扩增，共35个循环，最后72℃延伸7min，记录其荧光定量值，将扩增产物用反向点杂交检测。

1．3．4反向点杂交将杂交液1（2×SSC－0．1％SDS）与杂交液2（0．5×SSC－0．1％SDS）预热置56℃备用，取5ml的EP管，每管加入一张膜条，吸入2ml的杂交液1，并将PCR产物加入各管中，盖上管盖，放入水浴摇床56℃杂交50min。再将膜条放入50ml离心管中，加入30ml杂交液2。放入水浴摇床56℃洗膜3min。重复3次，倒出溶液，每管加入POD溶液20ml，置于摇摆仪上反应10min，倒出溶液，加入30ml杂交液1，放入水浴摇床常温反应2min，重复4次。倒出溶液，每管中加入柠檬酸钠溶液30ml预显色，置于摇摆仪上蔽光摇晃2～3min，倒出溶液，每管加入显色液20ml，置于摇摆仪上蔽光反应5min，取出膜条，置于纯水中漂洗2min，轻摇，弃水，并重复一次蒸馏水洗涤，将干净的膜条放于吸水纸上洗干残留的水，整齐摆放于扫描仪上扫描拍照，判断结果，阳性结果为杂交膜上出现蓝色斑点。

1．3．5对照实验用留作对照的30份正常人血清，重复上面实验。

1．3．6重复性试验从53份已分型鉴定的血清中随机挑选20份，用同样方法重复进行检测，对比前后分型结果。1．3．7PCR产物序列测定将扩增产物经醋酸钠／乙醇纯化后，以PCR引物为直接测序引物，将测得的序列输入DNAstar分析软件中，与GenBank中已知HCV各基因序列进行同源性比较及序列排列对比分析。

2结果

2．1HCV-RNA荧光定量

经HCV-RNA定量测定，53份血清标本的浓度均在

表1目的片段扩增引物序列和各型所用探针序列Tab．1The purpose of the amplified fragments primer sequence and the type used by the probe sequence

引物Primer1 Primer2 Primer1b

Primer2a

Primer6a Primer3b

序列

5′-TCT AGC CAT GGC GTT AGT RYG AGT GT-3′5′-CAC TCG CAA GCA CCC TAT CAG GCA GT-3′5′-CCG CGA GAC TGC TAG C-3′

5′-CCG CGA GAC YGC TAG C-3′

5′-TGR CCG GGC ATA T-3′

5′-CCG GGA AGA CTG GGT C-3′

5′-GGG TCC TTT CCA TTG G-3′

5′-AAT CGC CGG GAT GAC C-3′

5′-CCG CGA GAT CAC TAG C-3′

注：R代表A或G，Y代表T或C

⑧⑦⑥⑤④③②①膜条

图1膜条探针排列示意图

Fig．1Membrane probe be arranged diagram

注：1号位是染色对照；2号位是阳性对照；3、4号位是1b型探针；

5、6号位是2a型探针；7号位是3b型探针；3、5、8号位是6a型探针。

102～107IU ／mL 之间，30份阴性对照血清均为阴性。2．2

PCR-RDB 基因分型

53份浓度均在102～107IU ／mL HCV-RNA 阳性血清

进行分型，其中包括1份102的低病毒载量血清，分型结果为：1b 型32例占60．38％，2a 型4例占7．55％，6a 型8例占15．09％，3b 型8例占15．09％。有1例未确定型别（可能是扩增产物浓度偏低2．24×102IU ／mL ）。30份阴性对照血清分型结果均为阴性。膜条显色结果清晰，如图2所示。

2．3测序结果

将扩增产物进行测序，用DNAstar 分析软件与

GenBank 中已知HCV 各基因序列进行比较，RCR-RDB 基

因分型结果与测序分型结果一致，其中有1例未确定型别，故PCR-RDB 分型方法的敏感性为98．1％、特异性为

100％。1b 、2a 、6a 、3b 测序结果如下：

1b 型序列：GACCACACTACTCGGCTAGCAGTCTCGCG GGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTGATCCA AGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATCCGGTGTAGTCACCG GTTCCGCACACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGGTCCT GGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGAA

2a 型序列：GACCACACTACTCGGCTAGCAGTCTCGCG GGGGCACGCCCAAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTGATCC AAGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCAC CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGGTC CTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCATGGCTAGAA

6a 型序列：ACAGTCGCTCAGGCCCTCCTCCGGGAGAG CCATAGTGGTCGTCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATCGCC

GGGATGACCGGGTCCTTTCTTGGAACAACCCGCTCAATGCC CGGAAATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGATCACTAGCCGAGTA GTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGG

3b 型序列：ACATGCGCCGTCGGTGCTTGCGAGTGGGAG AGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATT GCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCATTGGATCAAACCCGCTC AATGCCTGGAGATTTGGGCGTCCCCCGCAAGACTGCTAGCC GAGTAGCGTTGGGTTGCGAAAGGCCTTGTCCTACTGCCT 2．4

重复性实验

对随机抽取的20份血清标本，用PCR-RDB 方法再次分型，前后结果符合率为100％。说明PCR-RDB 分型方法有很好的重复性。

讨论

HCV 基因组为一条单股正链逆转录RNA 病毒，属黄

热病毒科，HCV 颗粒外有脂质包膜，直径约30～60nm ，长约9．5kb ，主要由5′及3′端非编码区（NCR ）和一个大的单一开放读码框架（ORF ）组成［1］。由于HCV 病毒复制的多聚酶缺乏校读的功能，使HCV 呈高度的异质性，变异可产生于全基因序列的各个区域［2］。由于HCV 基因的变异性较大，客观上存在很多的型别，给临床的诊断和治疗带来一定的难度。因此，发展一种较为简单方便而又便于进行质量控制的HCV 基因分型技术，不仅是临床诊断、科学研究所必须的，也是未来基因分型试剂水平化的基础。

据报道，目前HCV 分型方法有多种［4－13］，如：Simmonds 酶切分型法、型特异性PCR 分型法、型特异性探针杂交法、限制性长度多态性分型法（RFLP ）、基因芯片法、核酸序列分析法和血清学分型法等。其中以基因序列分析法最为准确，目前仍为HCV 基因分型的“金标准”，但操作繁琐，成本较高不易推广；型特异性PCR 分型法成本较低，不需要特殊的设备，但会出现较弱的扩增条带，难以判断结果；型特异性探针杂交法以高度保守的5′NCR 区为靶基因，特异性高，但操作繁琐；RFLP 法同样以高度保守的

5′NCR 区为靶基因，敏感性高，但酶切位点易受基因变异

影响；基因芯片法和测序的结果符合率在90％以上，但只适用于大量标本的检测，而且需要专用的检测分析设备；血清学分型操作简便，污染率低，但特异性和灵敏度相对较低。本研究基于型特异性探针反向杂交原理，选择比较保守且可以区分HCV 主要基因型的5′NCR 为探针设计区域，采用Simmonds 基因分型的标准，设计我国常见的几种

HCV 基因特异性探针，点于Biodyne C 膜上，用生物素标

记引物，通过引物扩增HCV 基因组中的5′非编码区的保守序列，利用固定在膜上的型特异性探针1、2、3、6型与扩增产物杂交，互补后直接与POD 结合，再通过底物作用，相应的探针位置出现杂交信号而显色，即可进行结果判断；同时设立显色反应对照、HCV 阳性扩增对照等，进行质量控制；经阴性对照实验、重复性实验以及同测序结果的比较，该分型方法敏感性高、特异性强、准确可靠，能区分多种基因型。如果再配合快速杂交仪能使操作简便而快

阳性对照RNA-1b 型

11b

阳性对照cDNA-6a 型

1b 空白1b

1b 2a 2a 1b

1b 6a 1b 1b

1b 3b 1b 1b

1b 6a 1b

20080411——

—HCV 临检标本分型———广东省中医院珠海医院检验科标本图2空白、阳性对照和部分标本的结果

Fig．2Blank ，and some of the positive control of the results of

the specimens

速。相比之下，反向点杂交是较为理想、方便、实用的分型方法，而且简单易行，成本较低，便于临床推广。

既往的流行病学调查表明HCV基因型的分布具有一定的地域或种族特征［14－16］。采用本课题设计的方案检测，53例HCV-RNA阳性血清标本中，检出52例4种基因型的比例分别为1b型32例占60．38％，2a型4例占7．55％，6a型8例占15．09％，3b型8例占15．09％，基本符合广东地区HCV患者的基因分型［7］，未检出的基因型有1例，用基因序列分析也未能检出。未检出型的HCV RNA浓度为2．24×102IU／mL，较低的扩增产物浓度应是检测失败的原因。由于本课题所留取的标本数量有限，结果有待进一步继续研究。

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（收稿日期：2009－01－03；修回日期：2009－02－28）

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关于论文中统计结果的解释和表达

当P＜0．05（或P＜0．01）时，应说明对比组之间的差异有统计学意义，而不应说对比组之间具有显著性（或非常显著性）的差别；应写明所用统计分析方法的具体名称（如：成组设计资料的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等）、统计量的具体值（如t＝3．45，χ2＝4．68，F＝6．79等），应尽可能给出具体的P值（如P＝0．0238）；当涉及总体参数（如总体均数、总体率等）时，在给出显著性检验结果的同时，再给出95％置信区间。

本刊编辑部

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