蛋白质测定的原理及操作步骤

测量蛋白质三种方法测定原理

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有两种古老的经典方法，即酚试剂法和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法。其中酚试剂法和考马斯亮蓝法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍。。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。简单列表为：

1、方法灵敏度优点缺点

1、紫外吸收法

50～100mg 快速简便无损样品灵敏度低干扰物较多

2、考马斯亮蓝法 1～5ug 灵敏、简便、快速不同蛋白质测定时有较大的偏差

3、酚试剂法 20～250ug 灵敏度高干扰物质多、费时、操作严格计时

2 、考马斯亮蓝法双缩脲法和酚试剂法的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由考马斯亮蓝建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。它是一种蛋白定量法

（一）实验原理

考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm 处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λ的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。

（二）考马斯亮蓝法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比酚试剂法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这

是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比酚试剂法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像酚试剂法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰酚试剂法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

（三）此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰酚试剂法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来

测定未知蛋白质的浓度。

酚试剂法

酚试剂法包括两步反应：第一步双缩脲反应

在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

第二步酚试剂法，酚显色反应

酚试剂法-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此显色反应。即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。紫外吸收法

蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯尔比尔定律：

A=abc

“A”为溶液的吸光度值，“b”为石英比色池的厚度，“c”为蛋白质溶液的浓度。

紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

紫外-可见分光光度法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，如下所示：

由

光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池对样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。

本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫

外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。