BCA测蛋白的具体操作步骤

一. 原理BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25 微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1～20微升。

二. 试剂盒组份组份Cat: KGPBCA （250 assay酶标板/50assay 1mL比色杯）蛋白标准溶液（0. 5 μg/μL ）5 mL BCA试剂A 25 mL×2 BCA试剂B 1mL

三. 操作步骤

A．酶标板操作

1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（μg）0 0.5 1.0

2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；

3. 各孔加入200μL BCA工作液；

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。

B．分光光度计测定

1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（μL）0 5 10 20 40 60 80 100 去离子水（μL）100 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量（μg）0

2.5 5.0

10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；

3. 各管加入1000μL BCA工作液；

4. 各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。

四. 注意事项

1. 配制好的混合BCA工作液室温24小时内稳定。

2. 加入BCA工作液后，也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。

3. 待测样品浓度在50～2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。

4. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于1mM.不适用BCA法时建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。

5. 操作时要带手套。

五、储存

BCA 试剂A 和BCA 试剂B 室温保存，蛋白标准液-20℃冻存。