氨基酸工艺学

1.什么是氨基酸发酵工业？答：氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵,由发酵所生成的产物氨基酸,都是微生物的中间代谢产物,它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢,使有用产物大量生成、积累。氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动,发酵生产氨基酸的现代工业.

2.简述氨基酸的生产方法有哪些？抽提法,化学合成法,生物法(直接发酵法和酶转化).

3.举例氨基酸的应用领域有哪些？答：临床营养制剂及氨基酸药物:①Glu治疗肝昏迷。②氨基酸大输液。医药中间体:合成手性药物。肽类：乳链菌肽,可强烈抑制食品腐败.谷胱甘肽GSH含疏基,有抗氧化和整合解毒作用,用于治疗肝脏疾病、药物和重金属中毒。食品补充剂：①调味品：味精，稀释3000倍，鲜味，阈值0.03%。Gly：蔗糖的0.8倍。Asp-phe甲酯（阿斯巴甜），蔗糖的200倍。②提高食品营养价值，强化食品.评价蛋白质营养价值的指标，看食物中蛋白质的量（含量）和质（氨基酸之间的构成比例）。饲料添加剂:农业饲料用Lys，添加0.2%，鸡每年生蛋250个，猪120天长只至180斤，鸡56天长3.5斤。工业绿色化学产品:多聚氨基酸。α-聚赖氨酸（α-PL）,作为安全食品保鲜剂；r-聚谷氨酸(r-PGA)，可降解塑料，环境友好材料；聚天冬氨酸PASP，可生物降解的高吸水材料。保健化妆品:氨基酸系表面活性剂.

4.简述淀粉的组成及特性：淀粉白色无定形结晶粉末,圆形椭圆形多角形.是一种碳水化合物,组成元素为44.4%C,6.2%H,49.4%O.淀粉分子是由许多葡萄糖脱水缩聚而成的高分子化合物(C6H10O5)n. 分直链淀粉(不分支的葡萄糖链构成, α-1,4糖苷键聚合,空间构象卷曲螺旋状.水溶液加热不产生糊精,以胶体状态溶解,遇碘反应纯蓝色)和支链淀粉(α-1,6糖苷键连接直链,只有加热加压溶于水遇碘紫红色.)两部分.特性:无还原性无甜味,不溶于冷水,酒精,醚等有机溶剂.在热水中能吸收水分而膨胀,最后淀粉粒破裂,淀粉分子溶于水中形成带有黏性的淀粉糊,即糊化.生淀粉的颗粒在偏光显微镜下观察有双折射现象,淀粉有黑色十字,将颗粒分成白色的四部分,有晶体结构.淀粉含有较多水分却不显潮湿,原因淀粉分子中羟基和水分子相互作用形成氢键.淀粉遇碘反应强烈生成蓝色碘淀粉和淀粉-碘复合物.加热蓝色消失,冷却出现.温度太高碘极易逃逸,冷却后无蓝色.

5.分析玉米淀粉生产中浸泡工序的目的。玉米子粒坚硬有胚,需浸泡才能破碎. ①可软化子粒,增加皮层和胚的韧性.有利于胚的破碎②水分通过胚和皮层向胚乳内部渗透,溶出水溶性物质.有利于分离操作.③使粘附在玉米表面上的泥沙脱落.有利于玉米的破碎和提取淀粉.(逆流浸泡,水中加入SO2(不超过0.4%)以分散和破坏玉米子粒细胞中蛋白质网状组织,促使淀粉游离出来,同时抑制微生物繁殖活动.浸泡条件:浸泡水SO2浓度0.15-0.2%,PH3.5,温度50-55℃,时间48h) 清理浸泡粗碎胚芽分离磨碎纤维分离(筛选法)蛋白质分离(利用相对密度不同)清洗脱水干燥成品整理.

6.简述淀粉水解糖生产的意义. 谷氨酸产生菌不能直接利用淀粉或糊精作为碳源.淀粉必须经水解成葡萄糖才能供发酵使用.工业上将淀粉水解为葡萄糖的过程成为糖化,所制得糖液称为淀粉水解糖,主要是葡萄糖.它是谷氨酸产生菌生长的营养物质,易被其利用.淀粉水解糖液的质量关系到谷氨酸菌的生长速度,谷氨酸的积累及分离提取.

7.谷氨酸发酵水解糖液的要求.1.严格控制淀粉质量(无霉烂变质)2.正确控制淀粉乳的浓度(浓度高低满足发酵的初糖浓度)3.糖液中不含糊精(水解完全)4.糖液清、色泽浅,有一定的透光率5.糖液新鲜6.降低糖液蛋白质的含量7.质量标准:色泽：浅黄、杏黄通明液体；糊

精反应：无；还原糖含量：18%左右；DE值：90%以上；透光率：60%以上；pH：4.6-4.8。

8.简述淀粉制葡萄糖的基本原理.淀粉在加酸高温水解或受酶的作用下,淀粉的颗粒结构被破坏,α—1,4糖苷键及α—1,6糖苷键被切断,分子量逐渐变小,首先分解为分子较小的糊精(蓝糊精、红糊精、无色糊精)；接着分解成麦芽糖；最后生成葡萄糖。9.DE值与DX值：工业上用DE值(也称葡萄糖)表示淀粉的水解程度或糖化程度.糖化液中还原性糖全部当作葡萄糖计算,占干物质的百分比称为DE值.

DX值是指糖液中的葡萄糖含量占干物质的百分率。区别:糖液中葡萄糖的实际含量稍低于葡萄糖值,因为还有少量的还原性低聚糖存在.

11.淀粉的水解方法: 酸解法：利用无机酸催化,在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖.优点是工艺简单,水解时间短,生产效率高,设备周转快.缺点是在高温高压及一定酸浓度条件下进行,要求设备耐腐蚀耐高温耐压,副产物多,淀粉转化率低,要求淀粉原料是纯度较高的精制淀粉,淀粉乳浓度不能太高。酸酶法：先将淀粉酶用酸水解成糊精或低聚糖,再用糖化酶水解为葡萄糖.酸用量少,产品颜色浅,糖液质量高.适用于玉米或小麦等谷物。酶酸法：先用a-淀粉酶液化,过滤除杂后再用酸水解为葡萄糖.适用于大米(碎米)或粗淀粉原料。双酶法：用专一性强的淀粉酶和糖化酶催化,将淀粉水解为葡萄糖。

12.双酶法制糖的特点: 优点: 以作用专一的酶制剂作为催化剂,复合反应分解少,副产物少,糖液纯度高,DE值达98%以上,使糖液得到充分利用；酶解反应条件温和,不需要耐高压耐高温耐酸的设备；可以在较高的淀粉浓度下水解,可以使用粗原料；由于酶制剂中菌体细胞的自溶,使糖液营养物质丰富,可以简化发酵培养基,少加甚至不加生物素,有利于谷氨酸发酵稳定,提高糖酸转化率,有利于后道提取；制得的糖液颜色浅较纯净无苦味质量高；适用于大米或粗淀粉原料,减少粮食消耗。缺点:酶反应时间长,生产周期长,夏天糖液容易变质；酶本身是蛋白质,引起糖液过滤困难；要求设备多。

14.双酶法制糖工艺中淀粉液化程度控制的目的：液化程度应该控制在：在碘试显本色的前提下,液化DE值越低越好（12-15%）。若液化程度太低:黏度大,难于操作；葡萄糖淀粉酶属于外酶,水解只能由淀粉分子的非还原性尾端开始,底物分子越少,水解机会越少,影响糖化速度；易老化,糖化液过滤性差。若液化程度太高,葡萄糖淀粉酶先与底物分子生成络合结构,而后发生水解催化；不利于糖化酶生成络合结构,影响催化效率,糖化液最终DE值低。

15.简述Glu生物合成途径：包括糖酵解EMP作用,戊糖磷酸途径HMP,三羧酸循环TCA,乙醛酸循环,丙酮羧化支路(CO2的固定反应)等.葡萄糖经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸;丙酮酸一部分在丙酮酸脱氢酶系作用下生成乙酰CoA,另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸;草酰乙酸和乙酰CoA在柠檬酸合酶催化下缩合成柠檬酸,进入三羧酸循环,在顺乌头酸梅作用下异柠檬酸,异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶作用下生成a-酮戊二酸;a-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸。

16. Glu合成的代谢途径包括哪些调节机制：①反馈调节:PEP羧化酶,柠檬酸合酶,异柠檬酸脱氢酶, a-酮戊二酸脱氢酶,谷氨酸脱氢酶的调节.②糖代谢的调节:能荷调节,生物素对糖代谢速率、CO2固定反应、乙醛酸循环的影响.③氮代谢的调节.

17. 简述Glu生产中乙醛酸循环的作用：由于三羧酸循环的缺陷(a-酮戊二酸脱氢酶活力微弱),为了获得能量和产生生物合成反应所需要的中间产物,在谷氨酸发酵的菌体生长期,需

要异柠檬酸裂解酶催化反应,走乙醛酸循环途径.

18.列举控制细胞膜通透性的方法和机制：①控制磷脂的合成来控制膜的通透性：通过控制发酵培养基中的化学成分,来控制磷脂的合成,从而控制细胞膜的生物合成,导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜,使谷氨酸生产菌处于异常生理状态,以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透屏障。具体方法有：生物素缺陷型（作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏。控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10μg/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换. ）添加表面活性剂(如吐温-60或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸。机制:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜。关键:控制好添加饱和脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下再次进行菌的分裂生殖,形成产酸型细胞,即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。)油酸缺陷型(作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右。控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换。)甘油缺陷型(作用机制：丧失了α-磷酸甘油脱氢酶,必须由外界供给甘油才能生长,在甘油限量供给下控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量,从而使谷氨酸得以积累。控制关键：控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物0.02%)温度敏感突变菌株(作用机制：突变位置在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上,发生碱基的转换或颠换,这样为基因所指导的酶在高温失活,导致细胞膜某些结构的改变。控制关键：温度转换30-38℃的时间,温度转换之后进行适度的剩余生长)。②控制细胞壁的合成间接控制细胞膜的通透性。机制: 在发酵对数生长期的早期,添加青霉素或头孢霉素C等,抑制细胞壁的生物合成,使细胞膜处于无保护状态,又由于膜内外渗透压差,进而导致细胞膜的物理损伤,增大了谷氨酸向胞外露出的渗透性。控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.

19.简述谷氨酸生产菌的特点：①大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量) ,引起菌种代谢失调, 使谷氨酸得到大量积累.②α-酮戊二酸氧化能力微弱: 当α-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性很低时,TCA循环才能够停止, α-酮戊二酸才得以积累,为谷氨酸的生成奠定物质基础.③谷氨酸脱氢酶活性强.④细胞膜对谷氨酸的通透性高⑤还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.⑥产生菌体内乙醛酸循环的关键酶-异柠檬酸裂酶,通过该酶酶活性的调节来实现乙醛酸循环的封闭,乙醛酸循环的封闭是实现谷氨酸发酵的首要条件.⑧具有CO2 固定反应的酶系, CO2固定能力强,能利用CO2 产生大量草酰乙酸,有利于谷氨酸的大量积累.⑨解除谷氨酸反馈抑制.不利用谷氨酸.耐高糖耐高谷氨酸.具有向胞外分泌谷氨酸的能力.

20.生物素对糖代谢速率的影响：生物素主要影响糖降解速率,而不是影响EMP或HMP途径的比率。在生物素充足时,丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高,但糖降解速率显著提高,打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡,丙酮酸趋于生成乳酸,因而引起乳酸的溢出.

21.简述生物素对乙醛酸循环的影响：乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏,为醋酸所诱导,通过控制生物素亚适量,丙酮酸氧化能力下降,醋酸生成速度慢,且因

氧化能力降低而积累的琥珀酸的反馈抑制和阻遏,使异柠檬酸裂解酶的活性丧失,乙醛酸循环基本封闭,代谢流向异柠檬酸→a-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动。

22.谷氨酸生产菌的具体育种思路：1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株

23.理想途径中1mol葡萄糖生成1mol谷氨酸,理论收率为81.7%,四碳二羧酸是100%通过CO2固定反应供给。若通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸,则理论收率仅为54.4%,实际收率处于中间值。

24.优先合成：对于一个分支合成途径来说,由于催化某一分支反应的酶活性远远大于另一分支反应的酶活性,结果先合成酶活性大的那一分支的终产物.当该终产物达到一定浓度时,就会抑制该酶,使代谢转向合成另一分支的终产物.谷氨酸比天冬氨酸优先合成,谷氨酸合成过量后,就会抑制和阻遏自身的合成途径,使代谢转向天冬氨酸.a-酮戊二酸合成后由于a-酮戊二酸脱氢酶活性微弱.谷氨酸脱氢酶的活力很强,故优先合成谷氨酸.

26. 目前所用谷氨酸生产菌有哪些类型？棒状杆菌属(细胞为直到微弯的杆菌,常呈一段膨大的棒状,折断分裂形成八字形或栅状排列.不运动,少数植物致病菌能运动.革兰氏染色阳性,但常有呈阴性反应者,菌体内常着色不均一,常有横条纹或串珠状颗粒.胞壁染色表明菌体有多细胞组成,抗酸染色阴性,好氧或厌氧.从葡萄糖发酵产酸,少数从乳糖发酵产酸)、短杆菌属(细胞为短的不分支的直杆菌,革兰氏染色阳性.大多不运动.运动的具有周生鞭毛或端生鞭毛.在普通肉汁蛋白胨培养基中生长良好.多数从葡萄糖发酵产酸,不发酵乳酸.有时产非水溶性色素,色素呈红、橙红、黄、褐色.大多数液化明胶,大多数还原石蕊并胨化牛奶,极少数能使牛奶变酸.不明显地从碳水化合物产生乳酸、丙酸、丁酸或乙醇.接触酶阳性.菌体形态较规则,非抗酸性菌,除分裂时菌体内形成隔壁外,菌体细胞内不具有隔壁)、小杆菌属(细胞为杆状,形态和排列均与棒状杆菌相似,有时呈球杆菌状.美蓝染色呈现颗粒,革兰氏染色阳性,不抗酸,无芽孢.在普通肉汁蛋白胨培养基上生长,补加牛奶或酵母膏则生长更好.产生带灰色或微黄色的菌落.发酵糖产酸弱,主要产乳酸,不产气.接触酶阳性.)及节杆菌属(在培养过程中出现细胞形态由球菌变杆菌,由杆菌变球菌,革兰氏染色由阳性变阴性,又由阴性变阳性的变化过程.有的种细胞大小大小均匀,与小球菌在形态上无明显区别;有的种大小不均一,大的球状细胞可比小的大几倍,称之为孢囊.当接种到新鲜培养基上时,球状细胞萌发出杆状细胞.若有一个以上萌发点,则形成分支状态.新形成的杆菌延长并分裂,由分裂点又向外伸长,与原来的杆菌形成角度.这时革兰氏染色成阴性或不定.杆状细胞随培养时间的延长而缩短,最后变为球状细胞,革兰氏染色转变为阳性.不运动.固体培养基上菌苔软或黏,液体培养生长旺盛.大部分的种能液化明胶,从碳水化合物产酸极少或不产酸.还原硝酸盐,不产生吲哚.好氧.大部分菌种在37℃不生长或微弱生长,20-25℃为适温,表现为典型的土壤微生物.)中的细菌。

27.简述谷氨酸生产菌的主要特征. 细胞形态为球形、棒形以至短杆形;革兰氏染色阳性,无鞭毛,无芽孢,不能运动;都是需氧型微生物;都是生物素缺陷型;脲酶强阳性;不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等;发酵中菌体发生明显形态变化,同时细胞膜渗透性改变;CO2固定反应酶系活力强;异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,乙醛酸循环弱;α-酮戊二酸氧化能

力微弱;还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱;柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活性强;具有向环境泄漏谷氨酸的能力;不分解利用谷氨酸,并能耐高谷氨酸,产谷氨酸5%以上。

28.国内谷氨酸生产菌有哪些类型:①天津短杆菌（T613）及其突变株： TG-961、FM-415、S9114、CMTC6282、FM-8209、TG-866、D85②钝齿棒杆菌（AS1.542）及其突变株： B9、B9-17-36、F-263③北京棒杆菌（AS1.299）及其突变株：7338、D110、WTH-1.

29.谷氨酸发酵不同阶段菌体形态有哪些变化？(种子的菌体形态：斜面培养的菌体较细小,

一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及"V"字形,也有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为(0.7～0.9)* (1.0～3.4)μm。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。)不同发酵阶段的形态：

长菌期:发酵0-8h或0-10h, 长菌型细胞.多为短杆至棒杆,有的微呈弯曲状,细胞排列呈单个、成对及“V”字形;转移期:发酵8-18h或10-20h,转移期细胞.细胞形态急剧变化,细胞开始伸长、膨大,在生物素贫乏条件下通过再度倍增,从谷氨酸非积累型细胞转变为谷氨酸积累型细胞.此时期也有长菌型和产酸型细胞.产酸速度加快.;产酸期:16-20h以后,产酸型细胞.细胞含磷脂不足,形态异常,呈现伸长、膨大,不规则状,缺乏“V”字形排列.细胞较长为有明显横隔的多节细胞,产酸高.

30.谷氨酸发酵不同时期感染噬菌体后菌体形态的不同变化：发酵前期感染噬菌体:菌体细胞明显减少,形态不规则,发圆、发胖,缺乏V字排列,有明显细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起.生产上表现为排气口CO2迅速下降,OD值下跌,PH上升或不上升,耗糖缓慢.措施：立即停止发酵,进行补救。发酵中后期感染:形态不规则,边缘不整齐,有毛刺,有细胞碎片.OD值下降同时伴有泡沫多,黏度大,耗糖缓慢,但及时补加适量营养物,仍可完成发酵,产酸4%.需及时采取措施加以防治。

31.简述可用于选育Glu生产菌的代谢控制策略：（1）日常菌种工作:定期分纯;小剂量诱变刺激激发溶原性噬菌体;高产菌制作安瓿管.（2）选育耐高渗透压菌种:耐高糖(20-30%)突变株;耐高谷氨酸(15-20%味精)突变株;耐高糖、高谷氨酸(20%葡萄糖和15%味精)突变株.（3）选育不分解利用谷氨酸的突变株:以谷氨酸为唯一碳源菌体不能生长或微弱（4）选育细胞膜渗透性好的突变株: 抗VP类衍生物：香豆素、芦丁;溶菌酶敏感性突变株;二氨基庚二酸缺陷型突变株;选育温度敏感突变株.（5）选育强化CO2固定反应的菌株:以琥珀酸为唯一碳源生长快的菌株;氟丙酮酸敏感性突变株;丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突变株;克隆丙酮酸羧化酶基因.（6）选育强化TCA中柠檬酸到α-酮戊二酸代谢的突变株:柠檬酸合成酶强的突变株;抗氟化钠、氟乙酸菌株.（7）选育减弱乙醛酸循环的突变株:琥珀酸敏感型;不利用乙酸突变株;利用基因工程技术使异柠檬酸裂解酶活力降低.（8）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株:抗谷氨酸结构类似物;耐高谷氨酸;谷氨酰胺抗性菌株;酮基丙二酸抗性菌株.（9）选育强化能量代谢的突变株:呼吸抑制剂抗性菌株如抗丙二酸、氰化钾抗性菌株;选育ADP磷酸化抑制剂抗性菌株如2，4二硝基酚、砷抗性菌株;寡霉素抗性菌株.（10）选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株:选育抗嘌呤、嘧啶类似物的突变株。

32.谷氨酸生产菌选育的方法有哪些,并简述各自的实验步骤：①应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌:标记菌株的筛选,原生质体的制备,原生质体的再生,原生质体的融合,融合子的选择,实用性菌株的筛选.②应用转化法选育谷氨酸生产菌:制备对DNA转化有感受能力的原生质体,细胞对DNA的吸收,转化子的选择与再生.③应用转导法选育谷氨酸生产菌:供菌体与转导噬菌体混合制备供菌裂解液,受菌体中加入供菌裂解液培养转导子,筛选产酸高的转导子.④应用重组DNA技术构建谷氨酸工程菌:工具酶和载体的选择,目的基因的制备,DNA体外重组和外源基因的无性繁殖与表达,重组DNA导入受体菌,重组体的筛选.

33.为什么要进行种子扩大培养？菌种扩大培养为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子.因为发酵时间的长短和接种量的大小有关,接种量大,发酵时间则短.将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中,有利于缩短发酵时间,提高发酵罐的利用率,减少染菌的机会。

34.种子扩大培养的一般流程：斜面菌种的培养→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐。

35.写出一级种子摇瓶培养的简要步骤：a.培养基组成：葡萄糖 2.5%,尿素 0.5%,硫酸镁0.04%,磷酸氢二钾 0.1%,玉米浆 2.5~3.5%(按质增减), 硫酸亚铁2mg/kg,硫酸锰2mg/kg, pH7.0。b.培养条件:用1000ml三角瓶装入培养基200ml,灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h,培养温度7338和B9类菌30-32℃,T6-13类菌33-34℃,采用恒温控制。

36.种子扩大培养的级数取决于哪些因素：一级种子质量要求：种龄:12h.pH值:6.4±0.1.光密度:OD值净增0.5以上.残糖:0.5％以下.无菌检查:(-).噬菌体检查:(-)(双层平板法、划线法、液体培养法）.镜检:菌体生长均匀、粗壮,排列整齐.革兰氏染色:阳性反应。二级种子的质量要求：种龄:7~8h.pH:7.2左右.光密度:OD值净增0.5左右.无菌检查(-).噬菌体检查(-).镜检:菌体生长旺盛,排列整齐.革兰氏染色:阳性反应。

37.影响种子质量的主要因素有哪些? 培养基构成：接近发酵培养基,氮源丰富、生物素充足、碳源较少。温度：幼龄菌对温度变化敏感,避免温度过高和波动较大。pH：影响酶活,初始时不宜过高,培养结束不易过低。溶解氧：前期需氧少,后期较多.溶氧水平不易过高。接种量：即移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例.1%-2%.大接种量时种子进入发酵罐后易适应,且种子液含有大量水解酶有利于对发酵培养基的利用,还可缩短发酵罐中菌体繁殖至高峰所需时间。种龄：即种子培养时间,对数生长期菌种,7-8小时,菌体量达最高峰前移种。

38.简述Glu发酵C源、N源作用,CN比为多少?碳源是供给菌体生命活动所需能量和构成菌体细胞以及合成谷氨酸的基础；氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成谷氨酸氨基的来源,同时,在发酵过程中一部分氨用于调节pH,形成谷氨酸铵盐.一般发酵工业碳氮比为100:(0.2~2.0),谷氨酸发酵的碳氮比为100:(15~30),当碳氮比在100:11以上时才开始积累谷氨酸.实际生产中采用尿素或液氨作为氮源时,当培养基中糖浓度为140g/L时,碳氮比为100:32.8.一般在菌体生长期碳氮比应大一些(氮低）,在产酸期,碳氮比应小些(氮高）.在碳氮比为3∶1时,谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸,但当碳氮比为4∶1时,谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。

39.淀粉水解糖质量对Glu发酵的影响：淀粉水解糖质量对谷氨酸发酵的影响很大.如果淀粉

水解不完全,有糊精存在,既造成浪费,还会使发酵过程产生很多泡沫,影响发酵的正常进行;若淀粉水解过分,葡萄糖发生复合反应生成龙胆二糖、异麦芽糖等非发酵性糖,同时葡萄糖发生分解反应,生成5-羟甲基糠醛,并进一步分解生成有机酸等物质,这些物质不仅造成浪费,而且这些物质对菌体生长和谷氨酸形成均有抑制作用.另外,淀粉原料不同,制造加工工艺不同,糖化工艺条件不同,使水解糖液中生物素含量不同,影响谷氨酸培养基中生物素含量的控制。

41.温度对谷氨酸发酵的影响：首先,温度影响酶的活性.在最适温度范围,随温度的升高,菌体生长和代谢加快,发酵反应的速率加快.当超过最适温度范围以后,随温度的升高,酶很快失活,菌体衰老,发酵周期缩短,产量降低.其次,温度也能影响生物的合成途径.此外,温度还会影响发酵液的物理性质,以及菌种对营养物质的分解吸收等.谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即30～34℃.温度过低,菌体生长繁殖慢;若温度过高,菌体易衰老,生产中表现为DO值增长慢,耗糖慢,pH值高,最终发酵周期长,产酸少.发酵中、后期菌体生长基本停止,为积累大量谷氨酸,应适当提高发酵温度,最适温度为35～37℃.温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。

42.pH 对谷氨酸发酵的影响：谷氨酸产生菌像其它微生物一样,有最适生长pH值范围,当高于或低于这个值时:①影响酶活性.pH的高或低能抑制菌体内的酶的活性,菌体新陈代谢受阻,生长停滞.②影响细胞膜所带电荷.菌体细胞膜的带电荷状况若发生变化,细胞膜的渗透性也会改变,从而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的分泌.③影响培养基某些营养物质和中间代谢产物的离解,从而影响菌体对这些物质的利用.④ pH的改变往往引起菌体代谢途径的改变,使代谢产物发生变化.因此,应严格控制发酵的pH。(发酵前期控制在7.3左右,中期7.2左右,后期7.0,在将近放罐时为了后工序提取谷氨酸6.5-6.8)谷氨酸发酵调节pH 常用的方法：pH的变化是谷氨酸发酵的重要指标, 其变化取决于菌体的特性、培养基的组成(营养成分的利用和代谢产物的积累)和工艺条件.①添加碳酸钙法②尿素流加法:若菌体生长缓慢,耗糖慢,采取少量多次流加,维持pH稍低些,以利长菌.若长菌快,耗糖快,流加量应多些,pH偏高些.③液氨添加法:液氨作用快,对pH影响大,采取连续流加,该方法是目前氨基酸发酵普遍采用的方法。

43.供养对谷氨酸发酵的影响：①在菌体生长期：供氧必须满足菌体呼吸的需氧量,使糖的消耗最大限度地用于合成菌体.当p L

44.从微生物生理学角度考察谷氨酸发酵需氧的原因：谷氨酸发酵中,需氧是菌体代谢的需要.

①经过好气性的能量代谢可以有效地获得菌体生长和氨基酸生物合成所需的ATP,以完成生物氧化作用②氨基酸生物合成过程中产生的NAD(P)H2需要在氧存在下被氧化成NAD(P).

45.生产中泡沫的危害:由于通气和搅拌,产生少量泡沫是空气溶解于发酵液中的结果,少量

泡沫是正常的,但泡沫过多会引起发酵液大量溢出而造成浪费和污染;泡沫上升到罐顶,可以从轴封渗漏,造成杂菌的污染;泡沫过多就必须减少发酵罐的装填系数,降低了设备的利用率;泡沫过多影响氧的传递,影响通气搅拌效果;当泡沫稳定时,代谢气体不能及时排出,影响菌体的正常呼吸作用,甚至使菌体自溶.因此,在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。发酵中泡沫形成的相关因素:泡沫形成的必要条件:气液两相共存；有能降低液体表面张力的物质存在。培养基中大量蛋白质是起泡的主要原因;高浓度的糖类增加了培养基的黏度,增强了泡沫的稳定性;淀粉水解不彻底,造成大量糊精的存在,导致泡沫增多;与菌体繁殖有关,生长对数期时,由于菌体迅速生长繁殖,放出大量CO2,使泡沫大量上升;感染杂菌或噬菌体,使发酵液黏度增大,产生大量泡沫。生产上消泡的方法:①机械消泡：借助机械力或压力变化使泡沫破裂.优点:不需要在发酵液中加入其它物质,节省原料,减少加入消泡剂所引起的污染机会.缺点:不能从根本上消除引起泡沫稳定的因素,需要一定设备和消耗动力,不迅速可靠.②化学消泡：在发酵液中加入消泡剂.优点:是消泡效果好,作用快.缺点:消泡剂选择不当会影响菌体生长或代谢产物生成;操作上增加染菌机会;添加过量影响菌体代谢. 大都采用机械消泡器消泡与化学消泡剂消泡相结合的办法。(发酵工业常用消泡剂:天然油脂类;高碳醇、脂肪酸和脂类;聚醚类;硅酮类.味精厂常用消泡剂：BAPE、PPE.消泡剂消泡的机理:起泡,抑泡.消泡剂的添加方法：一次加入和中间流加结合.)

46.谷氨酸发酵过程中菌体有哪些主要的变化时期？列出各时期的特点:①适应期：发酵初期种子刚接入发酵罐,菌体处于适应期,细胞进行呼吸作用,利用储存物质合成大分子物质和所需能量,菌体个体长大,但没有分裂,此时糖基本不耗或很少消耗,由于初尿分解放出氨pH稍微上升.适应期的长短取决于菌种活力、种子量、发酵培养基和发酵条件等。②对数生长期：菌体大量繁殖,个体生长和群体繁殖循环交替进行.OD值直线增长,菌体形态与二级种子相同,绝大多数为V形分裂.耗糖速度加快,对碳源氮源的利用加快.尿素被分解放出氨,氨又被菌体利用使pH上升后下降.菌体代谢活动放热,温度开始上升,排气中CO2浓度显著增加.耗氧量增加,溶液中溶解氧下降,排气中氧气浓度下降。对数生长期末期要加大风量,供给足量的氧,并及时流加液氮,供给充足的氮源,促进增殖型菌体向生产型菌体转化。③转化期：生物素含量有丰富转向贫乏,部分菌体停止繁殖,在条件适宜时开始伸长、膨胀,形成生产型细胞,开始积累谷氨酸.这时菌体数量达最大,代谢最旺盛,耗糖加快,谷氨酸生成迅速增加，耗氧速率加快并接近最大值,放热也达最大值,且泡沫显著增加。④产酸期:菌体完成向积累性的转化,菌体形态发生变化几乎都伸长、膨大,边缘不完整,大量积累谷氨酸;耗糖与产酸相适应,产酸达最大值。

47.谷氨酸生产接种量的多少造成的影响: 接种量少,菌体增殖缓慢,吐温添加时间延长,发酵周期拉长；接种量过多,菌体迅速繁殖,营养消耗过快,产酸期缩短,后期产酸速度不高。

48.提高发酵产率的措施:①选育高产菌种,改良菌种性能.②改进发酵工艺:一次高浓度糖发酵;降低发酵初糖浓度,连续流加糖发酵;混合碳源发酵;应用电子计算机控制和管理发酵,使发酵工艺最佳化;固定化活细胞连续发酵生产谷氨酸。附：①采用温度敏感突变株发酵工艺仅需通过物理方式(转换培养温度)就可以完成谷氨酸生产菌由长菌型细胞向产酸型细胞的转变.②低糖流加工艺特点:初糖浓度低、总投糖量多、产酸高。糖流加方式:连续流加、分段加入。③糖蜜原料强制发酵工艺：表面活性剂的添加:0.2%吐温-60.青霉素的添加:3-5单位/mL发酵液.工艺特点：大接种量（5-10%）高生物素（100μg/L）高通风量（1：0.3）。

④二氧化碳对谷氨酸发酵的影响:1.间接控制通风量:排风中二氧化碳控制在13%.2.提前发

现噬菌体感染.3.帮助发现杂菌感染。⑤葡萄糖氧化的需氧量：彻底氧化1:6,合成代谢产物：1:1.9。⑥无机盐：1.磷酸盐磷酸氢二钾：0.1-0.15% 过高：代谢转向合成缬氨酸。过低：菌体生长缓慢。2. 硫酸镁0.04-0.06% .酶的激活剂。3. 钾盐：酶的激活剂.钾含量低长菌体，多产谷氨酸。4. 微量元素：生长因子(1)生物素 (2)维生素B1（3）谷氨酸发酵提供生长因子常用原料:玉米浆、麸皮水解液、糖蜜和酵母等。

49.谷氨酸发酵生产受噬菌体污染的异常现象：由于污染时间和感染量不同,以及噬菌体毒力和菌株敏感性差异,表症不一样,一般出现三高三低：即pH高、残糖高,OD值低、温度低、谷氨酸产量低。简述：①二级种子污染噬菌体:OD值不长、PH上升、泡沫大、耗糖慢、不产酸.②发酵前期污染噬菌体:吸光度不升或回降、或先升后降,OD值甚至下降到零以下；PH 逐渐上升到8.0以上不再下降,排气CO2一反常态,CO2迅速下降,OD值下跌、pH上升、耗糖慢等异常现象；耗糖缓慢或停止，有时出现睡眠病现象,发酵缓慢,周期长,提取困难；产生大量泡沫,发酵液黏度大,发红或灰；谷氨酸产量甚少,或增长极为缓慢,或不产酸,或产酸偏高,或忽好忽坏现象；菌体数量明显减少,菌体不规则,缺乏八字形排列,发圆,细胞核染色且部分消失,革兰氏染色呈红色碎片；平板检查有菌斑,摇瓶检查发酵液清稀,快速检测法检查OD420>>OD650；二级种子营养要求逐渐加多,种龄延长,发酵周期逐罐延长,对生物素要求越来越大,产酸缓慢或下降；送往提取车间的发酵液发红发灰、残糖高、有刺激性臭味,泡沫大、黏度大、难中和,中和时出现b型结晶、打浆子,过滤困难,收率低,结晶出的谷氨酸晶体质量差、黏、色素深；精制中和时,过滤困难,加碱困难,成品色重、透光差.③发酵后期污染噬菌体:对产酸影响不大,甚至有时提高产酸量,但仍需进行必要的善后处理.

50.烈性噬菌体，温和噬菌体：根据噬菌体与宿主细胞的关系,可将其分为烈性噬菌体和温和噬菌体.烈性噬菌体：侵染宿主细胞后,使细胞裂解的成为烈性（或毒性）噬菌体.温和噬菌体：不裂解寄主细胞,并随寄主细胞的分裂而传递其DNA的噬菌体。

51.谷氨酸噬菌体的主要特性：1）具有专一的寄生性2）一般在25-35℃、pH5-9时较为稳定,易受热变性（60-70℃,10-15min),对氧化物敏感,可被酸碱致死3）嗜氧性.在低溶氧条件下其活性被抑制4）不耐药性.噬菌体对药物很敏感凡能引起蛋白质变性的化学药品都可以使噬菌体失活。

52.防治噬菌体应采取的措施：①合理使用抗性菌株②利用药物防治噬菌体③采取以环境净化为中心的综合防治措施: 定期检查噬菌体;严禁活菌体任意排放;杀灭环境中的噬菌体;杀灭压缩空气中的噬菌体; 严格无菌操作避免噬菌体侵袭菌种;避免噬菌体侵入设备。

53.谷氨酸发酵感染噬菌体后的挽救措施：并罐法(噬菌体只能在生长繁殖细胞中增殖,不能侵染产酸期细胞.)；菌种轮换或使用抗性菌株(不交叉感染)；放罐重消法(高温灭菌)；罐内灭噬菌体法(低温灭菌)。54.发酵过程中杂菌污染的可能原因：种子带菌、空气带菌、灭菌不彻底、设备渗漏、无菌操作不当等。

55.怎样判断杂菌污染产生的因素？①从染菌时间分析：染菌若发生在发酵早期,原因可能是培养基灭菌不彻底;若发生在发酵中后期,原因可能是移种管路或净化空气带入少量杂菌,发酵罐有隐患,消沫剂或补料灭菌不彻底以及有关管路存在杂菌。②从染菌类型分析：若污染的杂菌是芽孢杆菌,则应先考虑培养基或设备灭菌不彻底,净化空气带菌,设备渗漏；若污染

的杂菌无芽孢的细菌或其他不耐热的杂菌,则应考虑污染来自净化空气带菌、设备渗漏；若污染的杂菌与种子罐的污染菌一致,则可以肯定污染来自种子带菌。③从染菌幅度分析：若各发酵罐都染菌,原因可能是公用的种子、净化空气、补料、消沫剂带菌,或公共设备存在染菌；若部分或个别发酵罐、种子罐染菌,可能是料液或设备灭菌不彻底,净化空气带菌，移种管路或发酵罐密封部件渗漏或存在死角。④此外,还要进一步进行全面的染菌检查：检查净化空气；检查培养基和培养物；检查发酵罐；检查管道的污染隐患；检查无法直接观察的设备部件染菌隐患。

56.谷氨酸发酵杂菌污染的处理措施：根据发酵过程中,染菌时期的不同,对发酵液采取不同的补救措施。(补加种子,补加糖,直接放罐)①前期出现轻度染菌：降温培养;降低PH;补加适量的菌种培养液或加入分割的主发酵液,确立生产菌的生长优势,从而抑制杂菌的生长繁殖,使发酵转入正常;补加培养液,并进行实罐灭菌,于100℃维持15min,待发酵液温度降至发酵温度时重新接种或分割主发酵液发酵。②发酵前期出现严重染菌且发酵液糖分较高：若发酵液糖分较高,先实罐灭菌,待降温至发酵温度重新接种或分割主发酵液发酵;若糖分较低,则补加培养液,进行实罐灭菌,重新接种或分割主发酵液发酵;若糖分很低,无法补救则倒罐。

③中期染菌：降低发酵温度;降低通风量;停止搅拌;少量补糖;提前放罐。④发酵后期轻度染菌：加强发酵管理,让其发酵完毕,适当提前防罐;补充一定量的菌种扩培液,增强生产菌的生长优势,抑制杂菌繁殖。⑤发酵后期严重染菌：若发酵液中残余糖分不多,应立即放罐,并对空罐进行彻底的清洗、灭菌;倒罐时应将发酵液于120℃灭菌30min方可放弃。

57.杂菌污染的预防措施：①空气的净化：减少滤前空气的尘粒;减少滤前空气的油水含量;保证压缩空气的温度;妥善装填过滤介质;选用高效滤材;保持一定的气流速度。②培养基和设备的灭菌：合理调配培养基;保证灭菌温度和时间;保证设备无积污染和渗漏;保证流动蒸汽质量;尽量减少泡沫;正确进行空气保压。③发酵设备的安装：防止轴封渗漏;合理安装罐内装置（避免积污和渗漏）;合理安装管路(管道与管道、管道与法兰的连接);阀门的连接;管路的布置;管路的试漏;管路的吹洗。④培养物的移接：严格进行斜面和摇瓶菌种的无菌操作;严格进行种子罐的无菌操作。

谷氨酸的提取: 将谷氨酸生产菌在发酵过程中积累的L-谷氨酸从发酵液中提取出来,再进一步中和、除铁、脱色、加工精制成谷氨酸单钠盐的过程称为谷氨酸提炼。分为提取和精制两阶段。分别在提取车间和精制车间完成。谷氨酸是发酵的目的物,它溶解在发酵液中,而在发酵液中还存在菌体、残糖、色素、胶体物质以及其他发酵副产物。提取工艺的选择原则:

工艺简单,操作方便,提取收率高,产品纯度高,劳动强度小,设备简单,造价低,使用的原材料、药品价廉,来源容易。

1.常用提取Glu的方法有哪些？说明每种方法的原理

①等电点法：利用Glu是两性电解质，将发酵液加硫酸调节PH至Glu等电点，使之析出②离子交换法：先将发酵液稀释到一定浓度，用盐酸调节PH，采用阳离子交换树脂吸附Glu，然后用洗脱液将Glu从树脂上洗脱③金属盐法：利用含有与Zn2+、Ca2+、Co2+等金属离子作用生成难容于水的Glu金属盐沉淀析出④离子交换膜电渗析法：根据渗透膜对各种离子物质的选择透性不同而将Glu分离⑤盐酸水解——等电点法。

2.简述离子交换提取Glu的工艺流程

1单柱法2双柱法

3.简述水解提取Glu的原理

将发酵液适当浓缩后加入盐酸，使发酵液中的菌体蛋白发生水解，发酵液中的残糖等有机杂质遭到破坏，过滤除杂质，得到的滤液经脱色浓缩，用碱液或发酵液中和到Glu等电点，低温下放置，让Glu析出

4.低温浓缩提取Glu的原理

将发酵液在低于45℃下减压蒸发，使Glu含量提高到12%~14%采用一步低温直接等电点提取

5.简述离子交换提取Glu的上柱方式及各自特点①正上柱：~属多级交换，总交换量比较大，一般为1.0~1.2kmol/m3湿树脂。采用正上柱法时发酵液必须事先出去菌体，否则会造成离子交换柱堵塞，以至于交换无法进行

②反上柱：~为一级交换，总交换量比正交换上柱法低，一般为0.9~1.0kmol/m3湿树脂，但是因为发酵液不需事先除去就能上柱交换。其操作方法为在室温下将带菌体的发酵液不断从交换柱下部送入，谷氨酸等阳离子被交换到阳离子交换树脂上，菌体及非电解质等杂质则由柱顶部流出。在上柱结束以前，应常用茚三酮试剂检查离子交换柱的流出液中是否有氨基酸出现，防止因树脂漏吸造成的Glu流失

6.离子交换双柱法提取Glu的特点和优点

母液通过H+型弱酸性阳离子交换树脂，一些交换能力强的离子先被交换到树脂上，而Glu 阳离子交换能力弱而不被交换，从弱酸阳离子柱中流出，将收集的含Glu的流出液通过H+型强酸性阳离子交换树脂柱，由于妨碍Glu交换的铵根及金属离子已基本被除去，因此过流液中Glu阳离子就能充分与树脂进行交换。因此大大提高了强酸性阳离子交换树脂对Glu 的交换效率，可以用碱液将被交换到树脂上的Glu洗脱下来，由于Glu集中，含量可高达16%

7.分析强酸性阳离子交换树脂提取Glu时上柱液PH为何不调到等电点3.2一下而是PH5~6

发酵液中含有一定量的NH4+、Na+等阳离子，这些阳离子的交换能力比Glu强，先与树脂进行交换，将树脂上活性基团的H+交换下来从而使上柱液的PH5~6降至3.2以下，此时Glu 即成为阳离子，就能与树脂进行交换①减少调节上柱液PH的用量节约成本②若调节到3.2以下上柱，则上柱液中总H+浓度很高，影响Glu上柱交换

8.分析离子交换方法提取Glu发生结柱的原因

①上柱液的Glu含量太高②洗脱剂的浓度太高③由于树脂破碎或菌体等杂质干扰堵塞而影响上柱液或洗脱液的流速，结果引起Glu结晶析出

9.离子交换法提取Glu时，树脂再生方式如何选择

正上柱时，用顺流方式再生则被发酵液中NH4+、Na+交换出来的H+可将柱底部未被再生的树脂进行再生，再生的树脂能与柱上部流下的发酵液进行交换，提高了柱的利用率，若采用逆流方式再生，则未被再生的树脂处于柱顶部，柱的利用率受影响，而不可取，反交换上柱时，用逆流方式再生，原因同上，因此：正交换上柱用顺流方式再生，反交换方式上柱，用逆流方式再生

1.味精，味精的化学性质

味精：谷氨酸钠的商品名，化学名：L-谷氨酸单钠一水化合物或L-α-氨基戊二酸单钠一水化合物，她是以碳水化合物（淀粉、大米、糖蜜等）为原料经过微生物发酵、提取、中和、结晶制成的具有特殊鲜味的白色结晶或粉末

性质：①与Hcl作用生成Glu或谷氨酸盐酸盐②与碱作用生成谷氨酸二钠盐，加酸后又生出谷氨酸一钠盐③在水溶液中长时间加热可部分脱水生成吡咯烷酮羧酸钠（焦谷氨酸钠）它在酸或碱作用下能生成Glu或谷氨酸钠④在水溶液中的解离

2.简述Glu制取味精的工艺流程

Glu溶解>中和>除铁>脱色>浓缩结晶>干燥>过筛>包装>成品

Glu加水溶解，用碳酸钠或氢氧化钠中和，经脱色、除铁、钙、镁等离子，再经蒸发、浓缩结晶、分离、干燥、筛选等单元操作，得到高纯晶体或粉体味精

3.由Glu制味精中和的原理

Glu与其他氨基酸一样，在水溶液中以两性离子GA±的形式存在，先把Glu加入水中，形成饱和溶液，再加碱中和，此时Glu大部分以GA±形式存在。随着碱的不断加入，PH升高，GA±逐渐减少，GA-增多，当绝大部分Glu以Glu一价负离子形式存在时即为中和生成Glu 一钠的等电点。当中和PH在Glu第二等电点6.96时Glu一钠离子在溶液中约占总离子的99.59%

4.分析Glu制味精中和液PH理论上控制在6.96的原因

当中和液PH在Glu第二等电点PH6.96时，谷氨酸一钠例子在溶液中占总离子的99.59%若PH超过7，随着PH的升高GA2-含量升高，即中和PH越高谷氨酸二钠越多，谷氨酸二钠是没有鲜味的，因此防止生成谷氨酸二钠使中和的关键。

5.简述Glu制味精中和液除铁的方法和原理

①硫化钠除铁：利用硫化钠使溶液中的少量铁变为硫化亚铁，硫化亚铁是一种难容盐，他的溶解度极小，几乎不容，可以完全沉淀，硫化钠在水中可变为硫化氢或氢氧化钠，硫化氢与二价铁离子反应生成硫化亚铁沉淀，反应中游离出的H+与氢氧化钠中和②树脂除铁：中和

液中的铁是以Glu螯合形成的络合物形式存在，利用带有酚氧基团的树脂（表面具有较强的配位基团）使络合铁与树脂螯合成新的更稳定的络合物，以达到除铁的目的

6简述Glu制味精中和液脱色的方法及原理

①活性炭脱色：活性炭的脱色除杂作用主要是由于活性炭表面的吸附作用。其吸附过程中同时包含物理吸附和化学吸附，物理吸附作用的机理为：吸附过程由吸附剂表面与被吸附物质分子至今范德华力引起，其选择性很差甚至没有选择性，但吸附过程快，在低温下吸附量大，吸附过程能量变动小，因而容易解吸。化学吸附机理：吸附剂表面存在不饱和价键，可以与被吸附分子的极性基团形成某些副价键，从而产生吸附作用，化学吸附有一定的选择性，而且适当升高温度可以加快吸附速度，吸附过程发生能量变化，解吸较困难②离子交换树脂脱色：主要靠树脂的基团与色素的某些基团形成共价键，因而对杂质起到吸附与交换作用

7.简述Glu制味精中和液特性与饱和系数的关系

①过饱和系数小于1时，即稳定区，晶体只能溶解，不能长大②过饱和系数在1.0~1.2时，即养晶区，不能自然形成晶核，但可使已有晶体长大③过饱和系数在1.2~1.3时，即刺激起晶区，已有晶核能长大，受外界刺激影响也能产生新的晶核④过饱和系数大于1.3时，即不稳定区，在此范围内能自动产生大量晶核，自然起晶时控制在此范围

8.工业生产味精有哪些起晶方法？

①自然起晶法：在一定温度下，使溶液蒸发进入不稳定区析出晶核②刺激起晶法：将溶液蒸发至亚稳区从而生成一定量的晶核③晶种起晶法：将溶液蒸发至亚稳区的较低浓度，投入一定量一定大小的晶种，使溶液中的过饱和溶质在所加的晶种表面长大

9.味精结晶工艺流程P191

结晶味精的操作过程主要可分为：浓缩、起晶、整晶、育晶，养晶等几个阶段。但是浓缩、整晶、育晶的过程往往穿插进行①浓缩：将脱色除铁的中和液或结晶母液按一定的量加入到结晶罐中为底料，加入的量一般为罐体积的60%左右。②起晶：将料液浓缩到29.5~30.5°B é时加晶种进行起晶，要控制好晶种的质量、投晶种的数量和投晶种时的浓度（1.晶种的质量：由于晶种质量将直接影响产品的好坏，所以晶种要求整齐、大小均匀，不夹带碎粒和粉末2.投晶种数目和投晶种浓度的控制：晶种的用量是根据晶种颗粒大小而定的。一般投晶种浓度控制在亚稳区为好，按常规操作以控制在29.5~30.5°Bé为好，若投晶种浓度太小，晶种会溶解，若浓度太高容易出现伪晶）③整晶：一种方法是先关掉蒸汽，把真空控制在66.66kPa左右，让晶种下沉，加入蒸馏水，减少晶体被水冲击的损伤（但控制加水量较难，容易损伤晶种，设备容易出事故）另一种是在晶种运动状态下，按平时操作控制条件加入蒸馏水，直至伪晶基本融化后停止加水。④育晶：通过补料而促使晶粒长大的过程称为育晶，加料方式有间隙加料和连续加料。间隙加料控制不当会使锅内浓度波动较大，微晶核出现较多，而连续加料比较稳定。⑤养晶：当结晶成长到大小符合要求，准备放罐之前，需要加入适量蒸馏水进行养晶，养晶的作用一方面是溶解伪晶，另一方面其调节浓度的作用。

10.味精生产的异常现象及其处理方法P195

①味精浑浊：谷氨酸中和、结晶过程要符合工艺规定；硫化钠质量要控制，用量要适宜；控制原料质量②味精中含有白片：控制好结晶时的液面高度，要高于隔层加热面③味精中含有焦谷氨酸钠：处理方法控制好味精精制过程中各个工艺过程时的温度和PH④味精光泽度差：1,控制好结晶的温度和浓度2,调整好分离浓度，分离液要甩净3,控制好干燥温度和时间4,调整好震动频率，缩短物料停留时间⑤味精带有颜色：1,加强脱色操作2,加强结晶操作，合理控制工艺参数，减少伪晶生成3,加强分离操作4,尽量采用振动式干燥机5,最好采用树脂除铁法，使铁离子量降至最低6,提高谷氨酸质量7,硫化钠的加入量要适宜⑥味精发臭：搞好环境卫生；母液和湿谷氨酸及时处理；设备要及时刷洗清理⑦味精大小头或细长：1,处理伪晶用水要适当，料液浓度不能太低，用水要均匀；2,分离时注意水量和水温，要分布均匀3,提高晶种质量，加强晶种的分级筛选⑧并晶：1,放罐时浓度应控制在29.5~30.5°B é2,及时分离，不停搅拌，防止表面遇冷干皮3,加强分离脱水，且分离时间要保证水分尽量甩净⑨结晶味精发脆：1,结晶温度65~70℃，浓度控制在亚稳区的养晶区2,提高料液纯度，调节PH在6.6~6.8；3,最好采用振动式干燥机，控制好干燥时间和干燥温度4,提高谷氨酸质量5,控制母液循环次数

1.简述Glu生产工艺中污染的来源

①淀粉水解糖的制取；基本不产生高浓度的有机废水，仅外排冷却水和冲洗水

②Glu发酵：Glu是Glu生产菌的代谢调节异常化的产物，这种代谢异常化的菌种对外界环境条件十分敏感，不同条件下，会产生不同量的菌体或得到不同的代谢产物，形成的废水成分有较大的变化

③Glu的提取与分离：离子交换尾液，离子交换树脂的洗涤及再生的废液，包含高浓度COD、硫酸根、铵根

④由Glu精制味精：（①原料处理所剩废渣②发酵液经提取后废母液或离子交换母液③生产过程中各种设备的洗涤水④离子交换树脂洗涤与再生废水⑤液化（95℃）至糖化（60℃），糖化至发酵（30℃）等各阶段冷却水⑥各种冷凝水）

2.Glu废母液提取菌体蛋白的方法有哪些？P205

高速离心分离法，絮凝沉降法，膜分离法

3.谈谈对于Glu发酵废母液的处理方法有哪些？谈谈你的看法

①发酵废液提取菌体蛋白②发酵废液生产饲料酵母，③发酵废液浓缩生产复合有机肥

看法：①综合利用后再以生物法处理②与造纸业中碱法制浆蒸煮黑液混合后再处理③用清水与高浓度硫酸盐废水混合④对综合利用后的二次废水采用“好氧+厌氧”主体处理工艺⑤综合技术路线应考虑味精废水的特点，同时经济可行，实现资源化要求

第九章

1.微生物代谢过程中酶活性的调节有哪些调节方式

①变构调节（变构效应，序变模型和齐变模型）②共价修饰调节③寡聚酶的解聚和聚合对酶活性的调节④蛋白酶水解的激活作用⑤调节类型（1,协同反馈抑制2,合作反馈抑制3,积累反馈抑制4,顺序反馈抑制5,假反馈抑制6,同工酶）

4.反馈抑制与反馈阻遏的比较

二者都是影响同一个酶但，反馈抑制决定现有酶的活性的高低，但最高产量是有限度的，其效果更直接快速，不涉及蛋白质的合成，物质基础是变构酶；反馈阻遏由终产物的需求量决定是否合成酶，但没停止合成以后，酶的活性不丧失，她是基因作用的结果，对环境改变的反应较迟缓，但可节约原料

6.氨基酸生物合成的基本调节机制有哪些？

①反馈控制与优先合成（反馈控制：由催化合成途径最初反应的初始酶受终产物氨基酸的反馈抑制和合成途径上各种酶受终产物氨基酸的反馈阻遏。分支合成途径的调解中，因为在分支点处的优先合成与反馈控制一起完成重要的功能，所以优先合成会引起一种终产物的过剩生成）②其他特殊的控制机制（平衡合成、代谢互锁）

1.分析氨基酸生产中代谢拮抗物的作用机制P252

①作为假反馈调节剂，由于结构类似物与对应氨基酸结构类似，就能像对应氨基酸一样与变构酶的变构部位不可逆的结合，抑制变构酶活性（因为类似物不被用来合成蛋白质）。若变构酶的结构基因发生突变，使变构酶的变构部位不与类似物结合而活性中心不变，这种突变型就是一个抗反馈抑制突变株②作为假反馈阻遏剂，能像对应氨基酸一样作为辅阻遏物，阻遏酶的合成。若调节基因发生变化，使阻遏物不再能与结构类似物相结合，就是一个抗阻遏突变型，在这一突变中，正常的中间代谢产物或终产物氨基酸也不再与结构类似物相结合，

所以中间产物或终产物过剩时，仍能不断合成有关酶③抑制与对应氨基酸有关的氨酰基—tRNA合成酶的活性④抑制对应氨基酸向细胞内的摄取。

2.分析一个野生型氨基酸生产菌如何会形成代谢拮抗物的抗性菌株。P252

在含有结构类似物的培养基上选择性地生长能在细胞内生成对应氨基酸的突变株，可以得到解除反馈调节的突变株

3.如何选育苏氨酸的结构类似物AHV的抗性突变株P253

在含有AHV的培养基上选择性地生长能在细胞内生成对应氨基酸的突变株，就可以得到AHV 的抗性突变株。增强结构类似物敏感株的方法：①改变培养基的碳源或氮源，减弱目的氨基酸生物合成的代谢流②添加目的氨基酸生物合成途径上某反应的抑制剂③使用目的氨基酸生物合成途径上有渗漏缺陷的突变株④添加抑制某一酶合成的物质⑤设法增强前体物质向其他途径的代谢流⑥设法增大结构类似物的细胞膜渗透性

4.如何利用酶专一性宽的育种策略，利用异亮氨酸的营养缺陷型的回复突变株，选育亮氨酸生产菌？P254

在异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的生物合成途径中，亮氨酸生物合成的初始酶α-异丙基苹果酸合成酶的底物专一性宽，也能以丙酮酸为底物，催化丙酮酸生成柠苹酸的反应，该酶受亮氨酸的反馈抑制，柠苹酸在解除了阻遏的亮氨酸合成酶系的作用下就能生成α-酮丁酸。因此，解除了亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制，利用该酶底物专一性宽的特性，就能从丙酮酸生成α-酮丁酸，α-酮丁酸可通过异亮氨酸，缬氨酸合成酶系转为异亮氨酸，尽管细菌失去L-苏氨酸脱氨酶，但是也能生长，因此，我们能从异亮氨酸营养缺陷型的回复突变株中，获得α-异丙基苹果酸合成酶对亮氨酸反馈抑制脱敏的突变株，即选育异亮氨酸缺陷型的回复突变株能选育出亮氨酸生产菌。

7.利用增加前体物质积累的策略选育黄色短杆菌的异亮氨酸生产菌P257

选育异亮氨酸生产菌时，苏氨酸是异亮氨酸的前体物质，为了积累异亮氨酸，除了设法解除对异亮氨酸生物合成的反馈调节外，还应设法解除对其前体物苏氨酸生物合成的反馈控制，增强苏氨酸的生物合成，就会提高异亮氨酸的积累，已知苏氨酸和异亮氨酸生物合成途径的关键酶高丝氨酸脱氢酶受苏氨酸的反馈抑制，为了解除苏氨酸对HD的反馈调节，研究选育AHV r突变株

8.利用胞内基因重组选育氨基酸生产菌有哪些方法？P262

①利用原生质体融合技术选育氨基酸生产菌②利用转导法选育氨基酸生产菌③利用原生质体转化法选育氨基酸生产菌

9.简述利用重组DNA技术构选氨基酸生产菌的步骤

①提取某种生物的DNA②离体条件下切割③与载体DNA分子连接④导入到某一受体细胞中使

之复制繁殖并表达，从而使受体细胞获得新性状。

10.有哪些措施可防止氨基酸生产菌回复突变株的产生

①定向选育增加遗传标记的产生菌②选育遗传性状稳定的菌株③改良培养基的组成④添加药剂抑制回复突变株的产生与增殖⑤生产管理；定期做纯化，并做遗传标记检查，尽量减少传代次数，生产上尽量减少种子扩大培养的级数。

11.描述图10-16（氧满足率r AB/KrM）不同氨基酸的氧满足率与产率的关系及原因P282

由于Glu，谷氨酰胺，脯氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸和苏氨酸等发酵P L>P L临界使通风搅拌的最适条件，所以生产上可用氧电极把通风搅拌的程度控制在PL>1.013kPa，对于苯丙氨酸、亮氨酸及缬氨酸发酵，由于P L

12.发酵液预处理及液固分离的目的P284

分离菌体、细胞碎片、未用完的培养基、核酸和蛋白质等。除去部分可溶性杂质、改变滤液的性质以利于后步提取与精制过程的顺利进行。

14.氨基酸提取液中，液团分离的方法有哪些P287

常规过滤、错流过滤、离心分离、金属膜过滤

15.生物法生产氨基酸提取氨基酸的方法有哪些？

①发酵液的预处理和液固分离②离子交换③沉淀法④吸附法⑤溶剂萃取法⑥电渗析法⑦氨基酸的精制

16.氨基酸生产中常用的陈低昂方法有哪些？

等电点沉淀法、特殊试剂沉淀法、有机溶剂沉淀法

17.简述活性炭的分类及活性炭对不同氨基酸的吸附规律P295

分类：粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭

规律：是非极性的吸附剂，因此在水溶液中吸附能力最大，在有机溶剂中吸附力极弱，一定条件下对不同物质的吸附能力也不同

①对极性基团的化合物吸附力大于极性基团少的化合物②对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物③活性炭对相对分子质量大的吸附能力大于相对分子质量小的化合物④发酵液的PH与活性炭的吸附效率有关，一般碱性氨基酸在中性条件下吸附，酸性条件下解吸，

酸性氨基酸在中性条件下吸附在碱性条件下解吸⑤活性炭吸附溶质的两在未达到平衡前一般随温度的提高而增加

B_变构酶：通过酶分子构象的变化来改变酶活性的一类酶

B_变构效应：调节因子与变构酶的变构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶的反应速率及代谢过程，此效应称为变构效应

B_变构酶脱敏效应：变构酶经特定处理后可以在不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性，这种现象称为脱敏效应。

D_代谢互锁：从生物合成途径来看，似乎是一种完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下采发生，而且这种抑制作用是部分性的，不完全的。Eg：脯氨酸发酵中，黄色短杆菌的异亮氨酸缺陷型，即丧失苏氨酸脱氨酶的突变株，在限量供给异亮氨酸的条件下，可积累13g/L脯氨酸，原因：苏氨酸合成量大，苏氨酸与赖氨酸协同反馈抑制天冬氨酸激酶，致使天冬氨酸增多，ATP过剩，又由于添加了过量的生物素，Glu不易渗漏，而被高浓度地保留在细胞内，结果促使了Glu激酶所催化的反应，导致易于透过细胞膜的脯氨酸的积累

D_多价阻遏：通过几个终产物共同协调活动，阻遏某一个酶的生物合成

F_发酵转换：在最适宜的培养条件下,谷氨酸产生菌可将60%以上的葡萄糖转化为谷氨酸,而只有极少量的副产物.与此相反,若培养条件不适宜,几乎不产生谷氨酸,而得到大量菌体或者由谷氨酸发酵转换为累积乳酸、琥珀酸、a-酮戊二酸、缬氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰谷氨酰胺的现象。

G_甘油缺陷型：丧失a-磷酸甘油脱氢酶自身不能合成a-磷酸甘油和磷脂,必须由外界供给甘油才能生长的突变型菌种,该菌种细胞膜对谷氨酸的渗透障碍被破坏,使谷氨酸能大量积累。

H_糊化：淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊。过程:第一阶段:预糊化.淀粉颗粒缓慢地可逆地吸收水分,体积膨胀很少,淀粉乳的黏度增加也少,若冷却干燥所得淀粉颗粒性质与原来无区别。第二阶段:糊化.当温度升到大约65 ℃时,淀粉颗粒经过不可逆地突然很快地吸收大量水分后,体积膨胀几到几十倍,失去偏十字,淀粉乳黏度和透明度提高,小部分淀粉溶于水中,淀粉乳变为淀粉糊。第三阶段:溶解.当温度继续升高,淀粉颗粒变成无形空囊,可溶性淀粉浸出溶解于水中,成为半透明的均质胶体。

H_合作反馈抑制：当任何一个终产物单独过量时，只能部分的反馈抑制第一个酶的活性

J_假反馈抑制：指结构类似物引起的反馈抑制

J_积累阻遏：每个分支途径的终产物仅部分的阻遏初始酶的合成

L_老化：分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列成新氢键的复结晶的过程.直链淀粉易老化,DE越小越易老化,碱性条件抑制老化,高温、快速升温快速降温不易老化,淀粉糊浓度过高极易老化.

L_临界氧分压：谷氨酸产生菌和其它好气性微生物一样,对培养液中的溶解氧浓度有一个最低要求,在此溶解氧浓度以下,微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降,此一溶解氧浓度称为临界溶解氧浓度,以c临界表示,或以临界溶氧分压PL临界表示. PL ≥PL临界 ,rab ＝ Qo2 , X 细胞呼吸速率不受影响;PL ＜PL临界 ,rab ＞ Qo2 ,X 细胞呼吸受抑制。

L_累积反馈抑制：每一个最终产物只单独地、部分地抑制共同步骤的第一个酶，并且最终产物的抑制作用互相不影响。

N_凝聚作用：指在某些由电解质作用下，使扩散双层电层的排斥电位降低，破坏胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程

P_10.葡萄糖的复合反应：葡糖糖复合反应生成龙胆二糖、异麦芽糖

P_平衡合成：底物A经过分支途径生成两种终产物E和G，由于a酶的活性远大于b酶活性，结果优先合成E，E过量后就会抑制a酶活性，使代谢转向合成G，G过量后就会拮抗或逆转E的反馈抑制作用，结果使代谢流又转向合成E，如此反复。Eg：黄色短杆菌中，天冬氨酸的生物合成与另一分支的分解途径的中间产物——乙酰辅酶A的生成，形成平衡合成，因此在丧失乙酰辅酶A代谢的主要酶——柠檬酸合成酶的突变株或其回复突变株，积累于细胞内的乙酰辅酶A能逆转天冬氨酸对其自身生物合成的控制，使天冬氨酸积累。

S_渗漏突变株：指遗传性障碍，不完全的营养缺陷性，这种突变使他的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能少量合成某一种代谢最终产物，能在基本培养基上少量合成。

S_生物素缺陷型：通过控制细胞膜的生物素亚适量,使发酵菌体由谷氨酸非积累性细胞转变为谷氨酸积累型细胞,形成磷脂合成不完全的细胞膜,使谷氨酸高产。

S_生长因子：从广义来说,凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质,如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子.不是所有微生物都必需的,只对那些自身不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。

S_生物素：是B族维生素的一种,又称维生素H或辅酶R,弱一元羧酸.在谷氨酸发酵中，生物素的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞膜的谷氨酸通透性,同时也影响菌体的代谢途径。(生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸, 同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,耗氧快,pH低,液氨消耗多,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成, 使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%;生物素亚适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累, 发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸92%左右。因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量)。

S_顺序反馈抑制：任何一个终产物过剩时，都会引起分支点的底物，即分支酸或预甲苯积累，作为两次作用的结果。又转而抑制整个合成途径初始酶。

T_同工酶：酶Ⅰ和酶Ⅱ都催化A到B的反应，G过量时酶Ⅱ停止活动，与此同时酶Ⅰ的活性不受影响，A可以顺利地到E从而使G过量但并不干扰E的合成

W_温度敏感突变株：低温下生长,高温下不能生长繁殖的突变菌种,该菌种在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因发生突变,这样所合成释出的酶在高温时失活,致使细胞膜某些结构的改变。

X_协同反馈抑制：当代谢途径中有两个以上终产物时，任何一个终产物都不能单独抑制途径第一个共同的酶促反应，但当二者同时过量时，它们协同抑制第一个酶的活性

X_协调阻遏：终产物的过剩同时阻遏几种酶的合成

X_絮凝作用：指在某些高分子絮凝剂存在下，悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大絮凝团的过程。

Y_营养缺陷型：野生菌株由于发生基因突变,致使合成途径中某一步骤发生缺陷,从而丧失了合成某些物质的能力,必须在培养中外源添加该营养物质才能生成长的突变型菌种。

Y_营养突变株：野生菌株由于发生了基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中额外添加这种物质才能生长的菌株。

Y_油酸缺陷型：通过控制培养基中油酸亚适量,使菌体细胞在再度倍增时变性,除去谷氨酸向膜外分泌的渗透性屏障,能高产谷氨酸的突变菌种。

Y_淀粉液化：利用液化酶使淀粉糊化，粘度降低，并水解到糊精和低聚糖的程度。间歇液化:85-90 ℃保温30-60min。碘液检查合格（呈棕红色）。经常使用中温酶。半连续液化法:喷射液化: