16SrRNA基因序列分析在非典型菌株鉴定中的应用_张守印

[基金项目] 国家科技攻关计划课题(2003BA712A02)

[作者简介] 张守印(1968-),男,博士,助理研究员,主要从事

细菌性传染病分子诊断和新发性传染病研究。

张守印,李振军共同第一作者

论著

16S r RNA 基因序列分析在非典型菌株鉴定中的应用

张守印1

,李振军1

,张集1

,朱勇2

,庞慧1

,郑宵1

,贺金荣1

,海荣

1

(1 传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 102206;

2 D epar t m ent of Pathology ,T he U n i versity o f T exas M ed ica l Branch ,TX 77550)

[摘要] 目的:建立16S r RNA 基因序列分析鉴定细菌的方法,评价其对常规方法不能鉴定菌株的鉴定效果。方法:选择

细菌的16S rRNA 基因为靶序列,在两端保守区设计引物,对三株生化、形态不典型菌株提取模板进行PCR 扩增,PCR 产物纯化后进行克隆,测序。结果:三株细菌的16S rRNA 基因序列与G enbank 比较,YC1序列与大肠杆菌相似性>99%,Y C2序列与肺炎克雷伯菌相似性>99%,YC3序列与缓症链球菌相似性>98%。结论:16S r RNA 基因序列分析的方法可以较好地鉴定常规方法难以鉴定的不典型菌株。[关键词] 16S r RNA 基因;序列分析;非典型菌株

[中图分类号] Q 93-33 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2008)04-0616-03

Application of identification of atypical strains wit h 16S rRNA gene sequence analysis

Zhang Shou yin 1,L i Zhen jun 1,Zhang J i 1,Zhu Yong 2,Pang H ui 1,Zheng X iao 1,H e J i n rong 1,H ai Rong 1

(1 Sta te K ey Lab fo r Infecti ous D iseases P reventi on and Contro ,l Chi na CDC N ati onal Institute for Communicab le D i seases Pre venti on and Contro ,l Chi na CDC,Beiji ng 102206,Ch i na ;2 D epart m ent o f P atho logy,T he U niversity o f T ex asM ed i ca l B ranch ,TX 77550)

[Abstract] O bjective :T o develop a techn i que for bacter i a lm olecu lar i den tificati on and ev al ua te its effect on i dentifica ti on of a typica l stra i ns M ethods :O ne se t of pr i m e rs targeti ng 16S r RNA g ene conserved reg i on w ere chosen to a m plif y certai n fragm ents ,DNA ex tracti on ,PCR reacti on ,cloni ng and sequenci ng Resu lts :N uc leo ti de sequences w ere compared w ith G enBank data base T he BLAST analysis and phy l ogene ti c ana l y si s ind i cated tha t Y C1w as the m ost si m il a r w ith reported 16S r RNA g ene of E scher ichia coli and t he si m ilar it y >99%,Y C2w as the m ost si m ilar to reported 16S r RNA g ene of K lebsiella pneu m oniae and the si m ilarity>99%,YC3w as the m ost si m il ar w ith reported 16S rRNA gene o f Strep tococc u s m itis and t he si m ilarity >98%.Con clusi on :T he 16S rRNA gene sequences techno l ogy m akes it possible to identif y bacte rial atypica l stra i ns [K ey words] 16S rRNA gene ;Sequence analysis ;A typica l strains 传统的菌株鉴定方法主要是通过表型特征来鉴定,通过分离培养、形态观察、生化反应、血清凝集鉴定到种型。但是某些菌株由于表型特征不典型,在非参比实验室难以进行准确鉴定。随着分子生物学技术的发展,利用分子技术对细菌进行鉴定的优势日益明显,在这一领域,16S rRNA 序列分析技术取得了骄人的成绩,已成为细菌种属鉴定和分类的标准方法[1]。我们利用该技术对三株形态和生化反应不典型的菌株进行了鉴定,下面将实验结果报告如下。1 材料与方法

1 1 菌株

1 1 1 菌株来源 本次试验的三株细菌编号为YC1,YC2,YC3,分离自江苏盐城某中学的三名发热中学生,年龄分别为14岁、14岁、16岁,性别男、男、女,症状均为发热38 以上,细菌从咽拭子标本的血平板培养中检出。

1 1

2 以上三株细菌在血平板上培养20h ,涂片,革兰染色,

镜检。

1 1 3 生化鉴定 用AP I 生化鉴定系统20N E 和20Strep 对以上三株细菌进行鉴定,操作步骤按说明书进行。

1 2 16S r RNA 基因序列分析

1 2 1 核酸提取 上述三株菌接种脑心琼脂培养基,37 培养24h ,刮取两接种环于盛有1m l 无菌生理盐水的离心管中,洗涤一次,用天根公司基因组提取试剂盒提取核酸。1 2 2 PCR 反应 引物来自文献[2]

27F 5 -AGAGTTTGATC M TGG CTCAG -3 1492R 5 -TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3 PCR 反应体系:

试剂20( l)终浓度

bu ffer 2M gC l 222 5mm ol/L dNTP 1 60 2mm ol/L 引物27F 0 50 5 m ol/L 引物1492R

0 50 5 m ol/L Taq 酶0 2模板1去离子水10 2

反应条件:95 预变性12m i n后进入循环,95 50s、52 50s、72 90s、25个循环,72 延伸10m i n。

1 2 3 纯化 取PCR产物各100 l用W izard PCR P reps DNA Purifica ti on syste m树脂回收法,操作按试剂盒说明进行。

1 2 4 连接 使用P rom ega pGE M R-T Easy V ector Syste m连接试剂盒,反应体系如下:

试剂标准反应阳性对照阴性对照Bu ffer5 l5 l5 l

T-载体(50ng)1 l1 l1 l

PCR产物3 l--

Contro l i nsert DNA-2 l-

T4连接酶1 l1 l1 l

加超纯水至终体积10 l10 l10 l

混匀,室温1h或4 过夜。

1 2 5 克隆 用天根公司的感受态细胞,转化操作步骤如下: (1)取连接产物5 l加入感受态细胞中;(2)冰上放置5~ 30m in;(3)42 热击60s;(4)立即将小管转到冰上放置2~ 3m i n;(5)加250 l平衡到室温的SOC培养液;(6)盖紧盖子,在37 摇床中培养45m i n,水平转速200转/分;(7)涂布100 l转化物于预先孵育的几个选择平板上,37 培养16~ 20h;(8)随机挑取白色菌落接种分区做好标记的选择平板上,37 培养16~20h。

1 2 6 测序 使用A BI3730序列测定仪器,原理是使用San ger双脱氧链终止法,测序的引物使用载体上带有的引物序列SP6进行,交由大连宝生物公司完成。

1 2 7 序列分析 测序结果通过B last比对进行分析。

2 结果

2 1 形态

Y C1和Y C2为革兰阴性杆菌,有鞭毛,能运动,无芽孢; YC3为革兰阳性球杆菌,部分梭状,像是两种菌混合在一起。

2 2 生化鉴定结果

2 2 1 YC1生化鉴定结果 ON PG -半乳糖苷酶+,ADH 精氨酸双水解酶-,LDC赖氨酸脱羧酶+,ODC鸟氨酸脱羧酶

+,CIT柠檬酸钠利用-,H

2S H

2

S产生-,U RE脲酶+,TDA

色氨酸脱氨酶-,LND吲哚产生+,VP羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇-,GEL明胶酶-,G LU葡萄糖发酵/氧化+,M AN甘露醇发酵/氧化+,I NO肌醇发酵/氧化-,SOR山梨醇发酵/氧化+,RHA鼠李糖发酵/氧化+,S A C蔗糖发酵/氧化-, M EL密二糖发酵/氧化+,AMY苦杏仁苷发酵/氧化-,ARA 阿拉伯糖发酵/氧化+,OX氧化酶-。鉴定编码为:5154552。

2 2 2 YC2生化鉴定结果 ON PG -半乳糖苷酶+,ADH 精氨酸双水解酶-,LDC赖氨酸脱羧酶+,ODC鸟氨酸脱羧

酶-,C I T柠檬酸钠利用+,H

2S H

2

S产生+,UR E脲酶-,

TDA色氨酸脱氨酶-,LND吲哚产生-,VP羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇-,GEL明胶酶-,GLU葡萄糖发酵/氧化+, M AN甘露醇发酵/氧化+,I NO肌醇发酵/氧化+,SOR山梨醇发酵/氧化+,RHA鼠李糖发酵/氧化+,SAC蔗糖发酵/氧化+,M EL密二糖发酵/氧化+,AMY苦杏仁苷发酵/氧化+,ARA阿拉伯糖发酵/氧化+,OX氧化酶-。鉴定编码为: 5604773。

2 2

3 YC3生化鉴定结果 V P羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇-,H IP马尿酸盐水解-,ESC七叶灵-,PYRA吡咯烷酮-, GAL -半乳糖甙酶+, GU R -葡萄糖醛酸酶-, GAL -半乳糖甙酶-,PAL碱性磷酸酶+,LA P亮氨酸+,ADH 精氨酸双水解-,R IB核糖产酸-,ARA阿拉伯糖产酸-, M AN甘露醇产酸-,SOR山梨醇产酸-,LAC乳糖产酸+, TRE海藻糖产酸-,I NU菊糖产酸-,RA F棉子糖产酸-, AM D淀粉产酸+,G LYG糖原产酸-,OX氧化酶-。鉴定编码为:0260401。

2 2 4 Y C3革兰染色形态特点 首次对YC3的血平板上20h培养物涂片染色镜检,像是两种菌混合在一起,一种是梭状菌,一种是球杆状,怀疑被污染了,挑单菌落再传代培养,染色镜检,结果同前次,

该株菌形态上有多态性。

2 3 16Sr RNA测序结果

YC1与G enBank比对结果显示,序列与大肠埃希菌的同源性最高,与G enBank登陆号为X80725相似性>99%,为大肠埃希菌。

YC2与G enBank比对结果显示,序列与肺炎克雷伯菌的同源性最高,与G enBank登陆号为X87276相似性>99%,为肺炎克雷伯菌。

YC3与G enBank比对结果显示,序列与缓症链球菌的同源性最高,与G enBank登陆号为D38482相似性>98%,为缓症链球菌。

3 讨论

快速准确地鉴定细菌是临床微生物学的一项主要任务,以前主要依赖形态学和生化特征作为细菌分类鉴定的基础,基本满足大部分常见菌株鉴定的要求;但细菌作为单细胞生物具有多态性,易变异,造成某些生化反应不稳定,仅依靠形态和生化特性难以准确鉴定一些特殊菌株。医院和公共卫生实验室的细菌工作者利用生化反应经常遇到一些不能鉴定到种的菌株,而这些菌株经常有重要的生物学意义,有明确种属信息的必要,因此需要更先进的方法对细菌进行鉴定。

分子生物学的应用大大提升了细菌鉴定水平,DNA作为生命的物质基础同时也是基因的载体可对细菌做出更准确的鉴定。16S r RNA具有如下的特点[1]:首先16S rRNA在细菌中普遍存在;其次是可变区与保守区交错排列,因而适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究;再次,大小适中,约1500个核苷酸,既能体现不同细菌种属之间的差异,又能利用测序技术来较容易地得到其序列,便于序列分析。近年来对

(下转第726页)

以下,过量的氧化剂可分解氰化物,产生负干扰。

2 6 比色杯的选择

在工作场所空气中氰化物测定标准中没有明确指出测定用比色杯的厚度,笔者根据标准系列的吸光度和样品最终定容体积,建议选用2c m的比色杯。

2 7 方法的线性关系及检出限

在选定的测定条件下,CN-浓度在0~2 00 g/L范围内,具有良好的线性关系,标准曲线的回归方程为:Y=0 00385+ 0 134X,r=0 9993。按规定的要求[2],对空白溶液连续测定20次,得到方法的检出限为0 02m g/L。

2 8 精密度试验

要求采样人员在现场采样时,每个采样点在重复性条件下,采集6个样品进行精密度试验,结果见表1。

表1 精密度测定结果

采样地点

测定值(mg/L)

123456

平均值

(mg/L)

s

RSD

(%)

1 2 3 40 16

0 33

0 25

0 17

0 15

0 32

0 27

0 18

0 15

0 33

0 26

0 18

0 16

0 31

0 26

0 17

0 16

0 31

0 27

0 19

0 16

0 32

0 27

0 18

0 157

0 320

0 263

0 178

0 0047

0 0082

0 0075

0 0069

3 0

2 6

2 9

3 9

2 9 准确度试验

在上述的样品中,分别加入0 50 g的C N-标准溶液,进行加标回收试验,加标回收率为91 2%~103 5%。

2 10 吸光度的比较

以含CN-0 10 g的标准管进行比较,发现用异菸酸钠-巴比妥酸钠法测定时,其吸光度只有0 005,而改用异菸酸-吡唑酮法测定后,吸光度提高到0 018,灵敏度得到很大的提高。

2 11 干扰试验

改用异菸酸-吡唑酮作为显色剂后,进行一系列的干扰试验发现,大量的S2-、S O2-

4

、C l-、NO-

3

、Cu2+、Zn2+、丙烯醛、乙腈与氰化物共存时不干扰测定,而比氰化氢浓度高20倍的甲醛可使氰化物的测定结果显著降低,痕量CN S-对氰化物的测定干扰明显,使结果显著增高,与异菸酸钠-巴比妥酸钠法测定的结果进行比较,基本上没有差别。

3 小结

改用异菸酸-吡唑酮作为显色剂进行工作场所空气中氰化物的测定,其灵敏度得到很大的提高,并具有良好的线性关系,方法的检出限为0 02mg/L,RSD值为2 6%~3 9%,加标回收率为91 2%~103 5%,能够满足工作场所空气中氰化物的测定需要,达到预期目的。

[参考文献]

[1]GBZ/T160 29-2004 工作场所空气有毒物质测定-无机含氮化

合物[S]

[2]GB/T5009 1-2003 食品卫生检验方法理化部分-总则[S]

(收稿日期:2007-12-17)

(上接第617页)

不同种属16S rRNA基因序列的大量测定,为鉴定细菌提供了丰富的数据库;因此16S r RNA基因已逐渐成为细菌鉴别和分类的 金标准 ,并被细菌学家及分类学家所接受[3]。

不仅从理论上说16S r RNA基因可用于细菌的分类鉴定,是分子鉴定的一个理想靶标,也被许多菌株鉴定结果所证实。Y i-W e iT ang等[4]临床分离的72株常规方法不能鉴定的细菌,用16S r RNA基因序列进行鉴定,70株鉴定到属的水平,65株鉴定到种的水平。目前,国外许多临床实验室已将16S r RNA基因序列鉴定作为细菌的常规鉴定方法[5],国内在这方面的工作积累还比较少,但一些有条件的实验室。

本次实验鉴定的三株菌是常见菌属的细菌。作为肠杆菌科细菌鉴定的重要生化鉴定指标,尿素酶阳性的大肠杆菌少见,尤其是人源分离的大肠杆菌尿素酶阳性者更少,本次实验菌株虽然尿素酶阳性,生化编码是符合大肠杆菌的,在工作中筛查大肠杆菌时,对于尿素酶阳性的菌株可补充试验准确鉴定;产H

2

S的肺炎克雷伯菌未见文献报道,因此根据生化结果容易得出错误的结果;细胞形态学也在细菌鉴定中起着重要作用,对许多菌属鉴定起着导引鉴定方向的作用,菌株YC3的镜下形态像是梭状菌和球杆状的混合体,很难判断为链球菌,而用基因鉴定的方法得到准确可靠的结论。16S rRNA基因可鉴定非典型菌株是由它自身特性决定的,许多细菌虽然生化变化较大,但其核酸是稳定的,此时基因特性便能准确反应种属信息。

本次实验证实,16S r RNA基因在非典型菌株鉴定中有独特的优势,利用16S r RNA基因鉴定细菌不但可以克服传统方法的不确定性,而且具有客观、准确等优点。随着测序技术的发展,测序准确性不断提高,价格越来越便宜,16S rRNA基因鉴定细菌可以发展为常规检测方法。

[参考文献]

[1]W oese CR Bacteri a l E vol u tion[J] M i crob i o l Rev,1987,51:221-

271

[2]GC Baker,J J Sm i th,DA C o w an R evi ew and re-an al ysis of do m ai n-

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dentification of bacteria on cli n i ca lm i crob i ology and i n f ecti ou s d i seases [J] C li n M icro Rev,2004,(17):840-862

(收稿日期:2008-01-17)