产生人抗体的转基因和转染色体动物研究进展_孙剑华

收稿日期:2003-06-09;修回日期:2003-09-11

基金项目:上海市科技发展基金资助项目(024319105)作者简介:孙剑华(1969-),女,河北唐山人,硕士,主要从事转基因动物产生人抗体的研究。

产生人抗体的转基因和转染色体动物研究进展

孙剑华1,2,钱　日文1

　

综述　李润生2,成国祥2　审阅(1.华东师范大学生命科学院,上海　200062;2.上海转基因研究中心,上海　201203)

摘要:鼠单克隆抗体应用于临床的弊端是它具有免疫原性,可行的办法是将鼠单克隆抗体人源化。抗体人源化的过程已由鼠嵌合抗体发展到了转基因动物表达完全人抗体阶段,表达完全人抗体的转基因动物有鼠、牛等。文中介绍了这些转基因动物的构建特点及这两种动物表达的人单克隆抗体和人多隆抗体的应用意义。关键词:抗体;转基因动物;微基因;YAC ;转染色体

中图分类号:R392.11 文献标识码:A 文章编号:1001-2478(2004)02-0172-03

自1975年德国学者Kohler 和英国学者Milstein 首次建立单克隆技术以来,鼠单抗的应用广泛且意义巨大。但是鼠单克隆抗体应用于临床治疗却有致命的缺点:(1)鼠源抗体与人补体成分结合能力低,CDC 作用相应较弱,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱;(2)它与NK 等免疫细胞表面Fc 受体亲和力弱,介导的ADCC 作用较弱;(3)鼠源抗体在人血循环中的半衰期短,它发挥ADCC 与CDC 作用的时间较短;(4)鼠单克隆抗体具有免疫原性,宿主易产生抗抗体。因此鼠单抗在肿瘤治疗、器官移植等方面的应用有较大的局限,需要对它进行人源化改造。目前抗体人源化研究由人鼠嵌合抗体、重塑抗体、噬菌体抗体库发展到转基因动物产生完全人抗体的阶段。转基因动物是将外源基因导入早期胚胎细胞或体细胞,使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系。转基因动物产生的完全人抗体对人不具有免疫原性。因此,完全人抗体对临床诊断治疗具有重要意义。文中综述了转基因鼠[1,3,5,6,8,9]、牛[2]产生人抗体的研究进展。

1　产生人Ig 转基因动物的制备及特点

建立产生人Ig 的转基因动物包括两个步骤

[3]

:(1)在

动物E S 细胞中将动物Ig 轻、重链胚系基因敲除,得到Ig 轻、重链双失活的小鼠(double inactivated ,DI )。目前普遍采用两个方法得到DI 小鼠:一个是用Cre /LoxP 方法,另一个是使用同源重组;(2)将人的免疫球蛋白基因组稳定的导入动物体内。抗体基因组十分冗长、其产生及调节极为复杂,因此建立产生人Ig 转基因动物的难点是:如何完整地克隆如此巨大的基因组片断,使转基因动物不仅能产生各种特异性人抗体,还能高产生。

产生人Ig 的转基因小鼠的建立通过以下四步

[1]

获得

的:Ig 轻、重链失活小鼠的制备、载体的构建、基因的导入、转人Ig 基因小鼠的获取。建立产生人Ig 转基因动物的特点是:导入的人Ig 基因组在小鼠细胞内能进行重排、产生受体、高频突变和类别转换。产生人Ig 转染色体牛的建立仅通过三步[2]:人人工染色体的构建、染色体的导入、转人Ig 染色体牛的获取。与转基因小鼠的区别在于:至今还没有敲除牛内源性Ig 基因的报道,这是因为人们对牛基因组的研究较少,相信将牛内源性Ig 基因敲除后,牛体内产生人Ig 的量会有显著提高。导入的人Ig 基因组也能在牛细胞内能进行重排、产生受体、高频突变和类别转换。

2　产生人Ig 转基因和转染色体动物技术进展

产生人Ig 转基因动物的研究是从小鼠开始的,导入人Ig 基因的技术主要有三种:微基因技术、YAC 技术、转染色体技术。由于基因操作技术的不断成熟,导入片段的不断增大,动物表达的人Ig 量不断提高,Ig 的类别也逐渐增多。

2.1　产生人Ig 的转基因小鼠　最初,用于构建产生人Ig 转基因小鼠的载体是质粒及粘粒,由于他们的容量较小,

因此人们采用微基因技术。

2.1.1　微基因技术　该技术是将人Ig 重链V 、D 、J 、C 基因片段及轻链V 、J 、C 片段人为地衔接起来,去掉其间的内含子区域。产生人Ig 的转基因小鼠是建立在美国学者

Palmiter 构建的“超级小鼠”(supermouse )[4]

　基础上形成的,

Bruggemann 等[5]用微基因技术首次将25kb 的人IgH 基因导入小鼠受精卵内,获得一系列能产生人Ig μ链的转基因小鼠。1991年,该小组将100kb [6]的人IgH (V H 6个片段及部分D 、J H 、C μ)基因导入小鼠,发现导入片段能在异种细胞内重排,IgM 产生量为50μg /ml 。该实验奠定了转基因小鼠产生人抗体的基础。此后几项成功的实验表明[7,8]:用微基因技术构建打靶载体,建立转人Ig 基因小鼠这项技术已经成熟。但是该转基因小鼠还存在鼠Ig 基因组率先产生,

而人Ig后产生且产生量低的问题。Wagner等[1]将小鼠内源性Ig基因敲除后,将100kb的人IgH(V H6个片段及部分D、J H、Cμ)基因导入小鼠,人IgM产生量有所升高,其产生量是350μg/ml。半抗原刺激产生的特异性抗体的亲和力(Kd)为6×10-8～1.6×10-7M,表明导入片段能在异种细胞内亲和力成熟。但是表达量仍旧不能满足大规模制备的要求,究其原因是因为导入的人Ig基因片段太短,非编码区内调控元件缺失。因此,解决问题的关键在于增大载体容量。

目前科学家采用微基因技术,建立人Ig转基因小鼠的目的是用来研究D区的作用及在V-D、D-J区插入的非编码碱基的作用[9]。

2.1.2　YAC技术　YAC作为载体有以下优点:首先,酵母内能容纳长度超过1Mb的人工染色体;其次,酵母染色体及YAC能够通过同源重组而使染色体得到高效率的操作。因此,可将Ig基因位点及选择标记基因加入YAC臂,从而将基因组以人工染色体形式导入小鼠体内,这种方法目前得到广泛应用。Green等[10]利用YAC技术成功的将220kb 的人Ig基因导入内源性Ig敲除的小鼠,其IgM产生量水平是350μg/ml。由于导入的基因片断较短,重链恒定区仅包括IgM、IgD序列,不能够进行类别转换且产生量仍旧偏低。Mendez等[11]将长达1020kb人Ig重链基因组转入DI 小鼠中,其中包括66种V区、所有的D区、所有的J区及Cμ和Cγ2;转入的人κ链基因组长达800kb。这样建立的Xenomouse IgM产生量是700μg/ml,IgG2产生量是600μg/ ml。κ链的产生量为800μg/ml。在同样条件下野生型小鼠的产生量为IgM400μg/ml,IgG为2000μg/ml,κ链为2000μg/ml。免疫之后Xenomouse IgG2的产生量每毫升增加2.5～4mg,这充分说明免疫之后发生大规模的类别转换。经人IL-8EGFR TNF-α再次免疫后,其亲和力分别高达9.1×10-10 M、7.6×10-10M、8.06×10-10M。从此之后人们更加坚信导入Ig片端越大,人Ig产生量越高、产生的类别越多。有资料研究表明[10]:在内源性Ig敲除的小鼠中导入人IgH (14q32.33)大约需要1.5Mb,Igκ(2q12)需要2Mb时才能完全产生人抗原特异性Ig。1999年Nicholson等在前人的基础上将人λ链导入小鼠体内,人Ig产生量在原有水平上有所增高[12]。

2.2　产生人Ig的转染色体小鼠(转染色体技术)　不论微基因还是YAC均不能将人Ig基因全导入,因此转基因鼠产生的人Ig的种类不足(恒定区基因缺失),不能对所有抗原发生反应(V区基因片段缺失)。Tomizuka等用微细胞介导法(microcell-mediate chromosome transfer,MMCT,又称转染色技术)[13,14]形成的转染色体小鼠,则克服了上述不足。该技术导入的是人14号染色体上产生IgH的胚系片段,长度大于20Mb,2号染色体上5～50Mb的κ轻链片段。通过MM-CT方法将人染色体转染到ES细胞,经人血清白蛋白免疫之后,这种小鼠产生了抗人血清白蛋白的人Ig,再次免疫后IgM产生量为350μg/ml,IgG总产生量为300μg/ml,包括IgG四种亚类,且IgG各亚类的组成与人血清中IgG各亚类相当,说明再次免疫后能够发生类别转换,而转基因小鼠中只产生IgG的一种亚类;κ链的产生量为450μg/ml。亲和力稳定Kd在1.5×10-11～9.1×10-11M。显然转染色体小鼠导入的人Ig基因片断比较大,但是与Mendez等[11]构建的Xenomose相比,转染色体小鼠产生的人Ig量却比较低,由该小鼠形成的杂交瘤所产生的人Ig还不到正常小鼠的十分之一。进一步体内鉴定发现hChr14(human chromsome 14)在鼠细胞内的存留率为78%,hChr2(human chromsome 2)在鼠细胞内的存留率为30%,hChr22在鼠细胞内不稳定[14]。最近这一不足得到解决[15]:将转hChr14的小鼠与带有Igκ微基因的转基因鼠杂交或将转hChr14的小鼠与用YAC技术构建的带有50%hIgVκ的转基因鼠杂交,其后代鼠杂交瘤细胞产生的人Ig量明显增高。用可溶性的人CD4和人集落刺激因子(GCSF)各100μg免疫鼠,相应的完全人抗体均得到产生,产生量与正常鼠产生的鼠Ig量竟然相同:IgM400μg/ml,IgG为2000μg/ml,κ链为2000μg/ml。而且此种鼠所产生的人抗CD4抗体的亲和力为(Kd)7.7×10-9M,GCSF的亲和力为(Kd)3×10-9M,与目前上市的鼠源单抗的亲和力相当[抗CD4与GCSF的亲和力分别为(Kd)3×10-9M、1.7×10-10M]。实践证明如此得到的人抗体,它介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体介导的细胞毒作用(CDC)活性增强[15]。作者认为:如此高产生人Ig小鼠的成功建立,加速了人抗体大规模临床应用的步伐。

透过转染色体小鼠产生人Ig,我们不难想到利用此项技术人源化其他的大基因位点或基因簇,例如T细胞受体,主要组织相容性抗原,P450基因簇等。

2.3　产生人Ig的转染色体牛　人γ-球蛋白的需要量很高,而由人血清得到的人γ-球蛋白主要有两种缺点:(1)众多供者血清中来源不单一,含有大量各种感染性介质;(2)供者提供的人γ-球蛋白的效价难以控制。高质量、高效价的人γ-球蛋白可以通过转染色体牛获得。

产生人Ig转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法,将构建的含有人Ig轻重链基因片段的人人工染色体(HAC),导入牛胚胎成纤维细胞,进一步发育成转染色体牛。产生人Ig转染色体牛的构建特点在于:(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系,因此将人人工染色体导入牛胚胎成纤维细胞;(2)转染色体牛用核移植的方法来建立;(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代,含有人HAC的微细胞与牛胚胎成纤维细胞融合后,牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d,因此必须经过2次筛选,确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。进行2次筛选的目的是:首先,确认转入的染色体片段断在牛体内能够稳定遗传;其次,携带人Ig染色体片断的细胞所占比率比较高,从而使较多的B淋巴细胞中携带构建好的HAC,从而保证在牛体内能够

产生人源的Ig;最后,由于此HAC在牛细胞内的存留率比较高,具有利用牛大规模产生人源Ig的能力。人Ig位点在牛体内进行重排及各种转录,在新生转染色体牛血组织中检测到人Ig为13～258ng/ml(正常新生牛中产生的Ig很低以至于不能检测到)。

3　人Ig的应用特点及展望

产生人Ig的小鼠建立之后,我们可以通过成熟的鼠单克隆技术得到各种人单抗。用这种技术产生的鼠杂交瘤细胞较抗体人源化初期构建的人鼠杂交瘤细胞更稳定。用Xenomouse模型已经能够成功的制备IL-8、IL-6、TNF-α、EGFR、CD147的人单抗,分析表明他们都有较高的亲和力,如抗人IL-8抗体的Kd可高达9.1×1010M。且Abgenix公司用Xenomouse制备的E GFR抗体能够阻断EGF与产生EGFR 肿瘤细胞的结合并抑制后者激活,且观察到某些患者自治疗后8个月未见复发。目前,多种用于治疗自身免疫病及肿瘤的多种人抗体,即将进入临床试验。

转染色体牛可以在短时间内得到较多的血清,今后随着转染色体牛技术平台的的不断成熟,利用转染色体牛产生的人多抗可以预防以下问题:(1)传染病的流行:人多抗可以中和耐药菌的多种表位,因此能够减少耐药菌引起的流行病;疫苗是预防病毒性疾病的良方,但病毒变种如引起非典型肺炎(SAR S)的病毒则容易引起大规模的流行病,给人们的生命财产造成很大的损失。人多抗能够中和病毒,避免大规模传染病的发生;(2)防御生物武器战争:现代生物战争包括细菌战、基因战等,而转染色体牛产生人多抗,可以防御生物战争,维护社会稳定及人类的存亡。

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