高效液相色谱-质谱法检测乳及乳制品中青霉素类残留及其代谢产物的
高效液相色谱-质谱法检测乳及乳制品中 青霉素类残留及其代谢产物的研究进展
张立佳，胡 雪，白艳梅，康 恺，段国霞，刘丽君，李翠枝*
(内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110)
摘?要：综述了近年来高效液相色谱-串联质谱、超高效液相色谱-串联质谱法、超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱法、基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱，在乳及乳制品中青霉素类残留及其主要酶解代谢产物、体内代谢产物等方面检测中的应用。从样品的提取、净化、色谱分离方式和质谱检测方式四方面进行了分析。关键词：乳制品；高效液相色谱-串联质谱；超高效液相色谱-串联质谱法；超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱法；基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱；青霉素；代谢产物
Recent Applications of High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for the Determination of
Penicillins and Their Metabolites Residues in Milk and Dairy Products
ZHANG Li-jia, HU Xue, BAI Yan-mei, KANG Kai, DUAN Guo-xia, LIU Li-jun, LI Cui-zhi*
(Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010110, China)
Abstract: In this paper we review recent applications of high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS), ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), ultra high performance liquid chromatography coupled with high-resolution time-of-flight mass spectrometry (HRTOF-MS), and matrix assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (MALDI-FTMS) to determine penicillin residues in milk and dairy products and their major enzymatic metabolites in vivo . This review describes recent progress in the development of sample extraction, purification, chromatographic separation and mass spectrometry detection methods for the determination of penicillin residues in dairy products.
Key words: dairy products; HPLC-MS/MS ；UPLC-MS/MS ；HRTOF-MS ；MALDI-FTMS ；penicillin ；metabolites 中图分类号：O658 文献标志码：A
文章编号：1671-5187（2014）06-0026-05
收稿日期：2014-08-11
基金项目： “十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAKl7800）
作者简介：张立佳（1985—），男，分析工程师，硕士，研究方向为乳制品检测。E-mail ：zhanglijia0476@https://www.360docs.net/doc/6615988622.html, *通信作者：李翠枝（1969—），女，高级工程师，硕士，研究方向食品安全风险评估。E-mail ：lczg@https://www.360docs.net/doc/6615988622.html,
近年来随着人民生活水平的提高，乳制品因具有丰富的营养价值和保健功能而越来越受欢迎，但是频发的乳制品安全事件也引起了社会的广泛关注，特别是一系列丑闻的出现，如：牛海绵状脑病、二恶英、双氰胺和三聚氰胺。因此，我国乳制品质量安全已成为广大消费者关注的社会热点问题。青霉素是目前治疗牛乳腺炎的首选药物，广泛应用于奶牛管理疾病的治疗和作为膳食补充剂，同时也是牛乳中最常见的残留抗生素[1]。青霉素可产生各种过敏反应，严重的会引发过敏性休克，同时可能导致细菌耐药，对人体健康造成严重危害[2-4]。
我国农业部2008年颁布实施了NY/T 5045—2008《无公害食品生鲜牛乳行业标准》确定了对新鲜牛乳的卫生指标即“抗生素不得检出”，2008年4月1日实施了国标GB/T 21315—2007《动物源性食品中青霉素族抗生素残
留量检测方法 液相色谱-质谱法》青霉素的检测方法，是目前现行的检测牛乳中青霉素抗生素残留量的检测方法。青霉素类抗生素在生物体内代谢，或在β-内酰胺酶的作用下，生成各自的青霉噻唑酸，而氨苄西林和阿莫西林分别还可产生氨苄西林哌嗪-2’,5’-二酮和阿莫西林哌嗪-2’,5’-二酮等，这些分解产物是青霉素类药物引起过敏反应的主要成分[5]，在牛乳加工生产过程中青霉素类抗生素也会分解产生这些化合物[6]，甚至不法商贩常使用β-内酰胺酶将牛乳中的抗生素变为酶解代谢产物从而达到掩蔽青霉素类抗生素使用的目的[7]。近年来，随着人们对青霉素的深入研究，传统的青霉素检测方法已经不能满足日益变化的现实生活，亟须建立青霉素类抗生素及其代谢产物的检测方法。
对牛乳和乳粉中青霉素类抗生素残留的分析较多的
是采用传统的青霉素残留分析方法，主要包括微生物测定法[8-13]、高效液相色谱-紫外检测法（high performance liquid chromatography with ultra violet detection，H P L C-U V）[14-15]、高效液相色谱-荧光检测（h i g h performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FLD）[16-17]、毛细管电泳法[18]、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[19-20]。微生物法灵敏度高，但操作费时，特异性差，测定结果以青霉素总量计；高效液相色谱法常常需要衍生化反应，衍生化效率难于控制，其重现性不是很好。其中LC-MS/MS法具有一定的优势，主要取决于它的质量分析检测技术，对样品中的药物残留提供明确的定性信息，基本能满足一些常规的检测，但是在精密度和准确度方面还不够理想。而高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），具有更高的精密度和准确度，同时具有高效、高通量、高特异性、不受化学基质干扰等优点[21]，在食品安全领域发挥着重要的作用，常常作为阳性样品的确证方法进行仲裁判定。除此之外，超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱（ultra high performance liquid chromatography and high resolution time of flight mass spectrometry，HPLC/HRTOF-MS）和基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱 (matrix assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，MALDI-FTMS)，具有更优秀的分离与检测技术。目前，高效液相色谱-质谱法对痕量抗生素药物的检测备受广泛的关注，众多学者对青霉素及其主要酶解、代谢产物的高效液相色谱-质谱法的检测方法不断提出新思想，以尽可能的简化操作步骤、节省操作时间、提高检测精密度。
本研究从青霉素及其主要代谢产物的高效液相色谱-质谱法检测方法的样品提取、净化、色谱分离方式、质谱检测方式的研究进展四方面进行总结，旨在为乳制品的检测提供参考。
1 样品的处理
1.1 样品的提取
对于乳及乳制品样品的提取，首先要考虑如何除去蛋白，一般常用的方法就是加入酸、碱、盐、有机溶剂等，其中有机溶剂常用的是甲醇和乙腈。但是，由于β-内酰胺环不稳定、不耐酸，在酸性条件下易分解，甲醇和青霉素易形成脂类，影响检测结果，而青霉素类药物及其酶解产物在水溶液中主要以离子状态存在，具有很好的水溶性。因此，青霉素类药物的提取一般使用乙腈，或者是水和乙腈的混合物，以达到同时脱蛋白和萃取青霉素的目的。秦峰[22]、陈伟[23]、李欣南[24]等报道了用乙腈提取除去蛋白，离心直接取上清液，这种方法对于青霉素原药取得了很好的结果。郎友等[25]报道了液态乳等液体乳制品准确称取12.5 g于三角瓶中，乳粉等固体乳制品样品，准确称取2.0 g于三角瓶中，加入12.5 mL水溶解，然后均加入12.5 mL乙腈超声辅助萃取，乙酸锌沉淀蛋白，过滤得到提取液。其中超声可以增强溶剂的穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进萃取的进行，乙酸锌是一种优秀的蛋白沉淀剂。方慧文等[26]报道了通过乙腈超声提取，稀释过滤直接上机，结果令人满意。李玮等[27]报道了样品采用乙腈水溶液提取，浓缩后净化，对于青霉素类药物及其酶解产物都取得了很好的效果。张秀尧等[28]报道了样品采用乙腈提取，超声离心，上清液转移至超滤管中，二次离心，氮吹到一定体积定容待测。冯月超等[29]报道了样品采取两次除脂过程，首先将样品直接高速低温离心（低温离心具有很好的除去脂肪和沉淀蛋白质的作用），取下层液体，加入乙腈沉淀蛋白质，取上清液，氮气吹干，用水定容，再加入正己烷除去剩余的脂肪，建立高效的同时测定牛奶中14 种青霉素及相应青霉噻唑酸残留量的UPLC-MS/MS方法。
1.2 样品的净化
通常乳及乳制品的提取液的基质特别复杂，含有许多共萃物，如果这些物质在最终的溶液中存在，不仅会损坏仪器，也会增加检测的噪音，无法准确测定痕量浓度的目标分析物[30]。为了降低共萃化合物的干扰，通常需要对复杂的基质进行净化与浓缩。目前常用的净化与浓缩的方法主要是固相萃取法，与传统的液液萃取方法相比，具有操作简便、快速、回收率高，易于实现自动化与其他分析仪器联用等优点。固相萃取的分离模式主要有反相固相萃取、正相固相萃取、离子交换和免疫亲合等。
对于牛乳和乳粉中的青霉素的净化主要采取反相固相萃取法，而HLB反相固相萃取小柱，具有高效、快速，并可以在含水系统中完成分析等特点。郎友等[25]报道了将提取液加入到固相萃取柱HLB，经固相萃取柱富集净化后，用体积分数为5%甲醇水溶液淋洗，抽至尽干后，用体积分数为80%的乙腈进行洗脱，整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min，洗脱液于42 ℃条件下用氮气吹干，牛乳的平均回收率为88.8%～92.0%。陈伟等[23]报道牛奶中2 种青霉素类药物的残留量检测方法。提取液用氮气充分吹干后，向其中加入磷酸二氢钾缓冲溶液，充分漩涡溶解后，倒入HLB固相萃取小柱，用8.0 mL 乙腈水溶液洗脱，实验表明乙腈∶水为7∶3（V/V），溶液效果最佳，收集洗脱液，定容至10 mL为不用浓缩，
直接过滤上机。仪器检出限为1.0～2.0 μg/kg，回收率为81.7%～102.8%。李玮等[27]报道了将提取液于45 ℃条件下旋转蒸发至约8 mL左右，加入2 mL 0.1 mol/L 磷酸氢二钠缓冲溶液，混匀后，转移到Oasis HLB固相萃取柱。牛乳中青霉素及其酶解产物的平均回收率为83.48%～96.97%，相对标准偏差为3.86%～10.87%；乳粉中青霉素及其酶解产物的平均回收率为82.70%～95.14%，相对标准偏差为3.02%～9.81%。固相萃取的最大的优点就是易于实现自动化与其他分析仪器联用。Kantiani等[31]报道了全自动化在线固相萃取-高效液相色谱串联质谱联用检测牛乳中的β-内酰胺化合物。仪器检出限为0.09～1.44 ng/mL；回收率为80%～116%。该方法以最小样本预处理、全自动在线SPE提供高富集分析，快速、高灵敏度和准确的得到结果。这种新开发的全自动化在线固相萃取-高效液相色谱串联质谱联用技术检测牛乳中抗生素的方法，将会在未来的食品安全领域发挥着重要的作用。
2 色谱分离方式
对于抗生素的分离，色谱柱一般都选用C18反相色谱柱，对于分离效果不好，如含有苯环结构的化合物可以考虑苯基柱，如果有极性的、也有非极性的成分，差异特别大，可以考虑用HSS T3柱等反相色谱柱。陈伟等[23]报道了采用Waters ACQUlTY UPLC BEH C18色谱柱分离，以含有体积分数为0.1%的甲酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，检出限为1.0～2.0 μg/kg，相关系数为0.999以上，回收率为81.7%～102.8%。该方法可准确快速测定牛奶中氨苄青霉素及青霉素G类药物的含量。孙雷等[32]报道了同样采用Waters ACQUlTY UPLC BEH C
18
色谱柱分离，流动相以体积分数 0.1%甲酸-乙腈溶液和体积分数0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，建立了13种β-内酰胺类药物残留的检测方法。郎友等[25]报道了采用色谱柱ACQUlTY UPLC HSS T3（2.1mm×100mm，1.7 μm），流动相：A为体积分数为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈，流速0.4 mL/min；梯度洗脱条件为：柱温30 ℃；进样体积为5 μL。结果表明，10种青霉素在1～50 ng/ mL范围呈良好线性，线性相关系数大于0.9991；牛乳的平均回收率为88.8%～91.3%，测定结果的相对标准偏差为1%～7%；乳粉的平均回收率在88.7%～91.3%之间，相对标准偏差为5%～11%。研究表明：该方法操作简便、快速、灵敏度高，适用于牛乳和乳粉中10 种青霉素类抗生素残留的同时测定。李玮等[27]报道了采用Hypersil GOLD C18色谱柱(150mm×2.1mm，5μm)， 流动相：A为体积分数0.1%乙酸铵溶液（乙酸铵为1 mmol/L），B为乙腈；青霉素原药：样品检出限为5～50 μg/kg，定量限为8～100 μg/kg，牛乳中青霉素及其酶解产物的平均回收率为83.48%～96.97%，相对标准偏差为3.86%～10.87%；乳粉中青霉素及其酶解产物的回收率为82.70%～95.14%，相对标准偏差为3.02%～9.81%。陈瑞雪等[33]报道了采用美国T h e r m o公司的苯基柱(150mm×2.1mm，0.25μm)，填料颗粒直径4.6 μm，分离物在最大程度上得到了分离，且峰对称尖锐，加之质谱的高选择性，通过多反应监测色谱图能够较好对9种分析物进行地定性定量分析。检出限为牛乳1～8 μg/kg；乳粉为8～32 μg/kg，牛乳平均回收率为77.58%～97.77%；乳粉平均回收率为85.95%～96.78%。该方法具有快速、简便、准确度高、检出限低等优点，适用于牛乳和乳粉中的青霉素类抗生素的检测。
3 质谱检测方式
青霉素药物被分离后，常用的传统的高效液相色谱检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器，由于多数青霉素化合物并没有专一的紫外发射团，而在这段波长范围内的选择性较差，因此对于青霉素的检测带来了困难。目前，随着接口技术的显著改进，质谱作为一种质量流速型检测器正广泛应用于药物残留物检测中。青霉素药物从色谱分离后，通过色谱与质谱的接口技术进入质谱。电喷雾（electron spray，ESI）质谱技术是目前应用最广泛的“软电离” 质谱技术，具有灵敏度高、专属性强、操作简便等优点。除此之外，电喷雾的离子化方式比较温和，绝大多数情况下可得到分子离子峰。李玮等[27] 报道了采用电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测模式；青霉素原药在4～200 μg/L，酶解产物在10～500 μg/L，范围呈良好线性，线性相关系数均大于0.99；样品检出限为5～50 μg/kg，定量限为8～100 μg/kg。赵维等[34]报道了青霉素分子中有一个游离羧基和酰胺侧链，极性较大，同样采取ESI离子源对青霉素进行分析，最低检测限为0.1～0.8 μg/L，定量限为0.3～2.6μg/L，方法回收率均在80%以上。肖惠贞等[35]报道了采用ESI离子源，正子模式，多反应监测方式，液体乳最低检出限为0.03～0.15 μg/kg；固体乳最低检出限为0.15～0.75 μg/kg，方法回收率为91%～102.3%，相对标准偏差为1.02%～6.13%。该方法简便、快速、准确的对乳制品中7 种青霉素类药物进行了检测。
高效/超高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用技术具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽等特点，在青霉素残留检测中应用最为广泛[22,34]。但三重四极杆串联质谱只能对目标化合物进行分析，而无法对未知的污染残留进行监控。随着质谱技术的
快速发展，超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱（ultra high performance liquid chromatography and high resolution time of flight mass spectrometry，HPLC/HRTOF-MS）方法能够采集高质量准确度、高质量分辨率的全扫描数据，单位时间扫描的化合物没有数量限制，而且具有较高的选择性和灵敏度，通过精确质量数和同位素峰形进行数据库检索比对，可以方便、快速地对目标化合物和未知化合物实现快速筛查与鉴定。张洁等[36]报道了利用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱结合数据库建立了乳制品中19 种抗生素的分析方法，检出限为3～5 μg/L，平均回收率为68.4%～96.7%。该分析方法具有前处理简变、快速、灵敏度高、质量精确度高的特点，可应用于乳制品中抗生素的快速筛查。
此外，Xu Zhe等[37]报道了基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱，可以快速、高选择性、高效的检测β-内酰胺类化合物的残留量，仪器的检出限为6×10-3 U/mL。此方法不需要繁琐的前处理，可在在复杂的基质中，无论是缓冲盐和溶剂中均可准确的检出β-内酰胺类化合物的残留量，是目前报道的最方便、最快捷，检出限最低的检测β-内酰胺类化合物的方法之一。
4 结语
青霉素的高效及超高效液相色谱-质谱法检测乳及乳制品中青霉素类残留及其主要酶解代谢产物的研究进展仍在研究探索中，而针对其样品的提取、净化、色谱分离方式和质谱检测方式等还没有统一的方法规定。当前各研究方法均有其优缺点，还需进行更深入的实验优化、验证。总之，鉴于乳制品是涉及人类健康的公共卫生问题，应重视和加强检测工作，努力研究一些简便、快速、准确、经济、绿色的，适用于企业及第三方检测机构的检测方法，发展高效、高灵敏的全自动联用技术和多残留组分确证技术，实现分析过程的自动化和智能化，提高分析效率、降低成本。
近年来，随着科技水平的发展、仪器价格的降低和检测技术的进步以及新药的不断开发和应用，相信高效液相色谱-质谱法检验技术会在抗生素残留检测领域得到越来越广泛的应用，为我国的食品安全保驾护航，为保证人类的健康而发挥越来越重要的作用。
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乳制品掺伪检验
第四章 第一节概述 90年代以来，世界奶业的产量平稳发展。发达国家牛奶产量占世界的50%，而法国的牛奶总产值已经超过其汽车工业总产值，在国民经济中占重要地位。 我国乳业在九十年代后得到快速发展，2004年，乳品的人均占有量已经达到14千克。乳品企业相继增多，竞争激烈。 乳品掺伪是乳品工业遇到的一个严峻问题，掺伪现象普遍，掺杂种类之多。 苯甲酸为无色、无味片状晶体。是食品工业中常见的一种防腐保鲜剂，但乳制品中不允许添加。一般情况下，苯甲酸被认为是安全的。但对包括婴幼儿在内的一些特殊人群而言，长期摄入苯甲酸也可能带来哮喘、荨麻疹、代谢性酸中毒等不良反应。 研究人员从广州商店和超市购买了142份乳制品，142份乳制品样本中，有109份检出苯甲酸，含量从0.51毫克/千克到110毫克/千克不等。 样品中苯甲酸含量都不高，“说明不是厂家人为添加”。乳制品中苯甲酸的来源可能与环境因素、生产过程等有关。根据检测情况，中国乳制品的苯甲酸不会对公众健康产生影响。即使是食用苯甲酸含量最高的那种婴幼儿配方奶粉，也不会超WHO推荐的每日允许摄入量。 牛乳的主要成分:水87%、脂肪4.0%、蛋白质3.3%、乳糖5%，矿物质0.7% 牛乳分为初乳、常乳、末乳、异常乳 初乳：干物质（蛋白质和盐类）含量高，其中球蛋白和白蛋白对热不稳定。富含维生素AD，免疫球蛋白。 末乳：有苦味和咸味。解脂酶较多，有油脂氧化味。不宜做乳品加工原料 异常乳：因生理或病理原因，成分性质与常乳不同。异常乳主要有：低成分乳、细菌污染乳、酒精阳性乳、混入杂质乳。 酒精阳性乳在超过100度加热时比正常乳容易凝固，用片式杀菌器杀菌时易产生乳石，乳粉喷雾干燥时影响溶解度。 第二节乳品质量评价及掺伪方式 1.感官检验：鉴定是否有异常气味（酸味、牛粪味、腥味等），搅动牛乳，观察其色泽是否带红色、绿色或明显的黄色，是否有杂质，如煤屑、豆渣、昆虫等，牛乳是否发黏或有凝块。 掺水 掺电解质为了增加密度同时掩盖酸度。如加入食盐、芒硝、亚硝酸钠、碳酸钠石灰水 掺非电解质增加密度尿素蔗糖等 掺胶体物质米汤豆浆明胶 防腐剂苯甲酸、硼酸、过氧化氢等 其它牛尿、滑石粉白陶土等 第三节乳及其制品的掺伪检验技术 一．牛乳冰点的测定 牛乳的冰点为-0.525（-0.516～-0.533）牛乳掺伪后，冰点会发生明显的变化，冰点的测定对掺伪的检验是很重要的。如果牛乳的冰点低于-0.59，说明牛乳中可能掺有电解质或蔗糖、尿素以及牛尿等物质。 二牛乳掺水的检验 （一）密度法正常牛乳的密度在1.028-1.032之间，牛乳掺水后相对密度降低，10%的水降低0.003，牛乳脱脂后密度增高。 （二）硝酸根检验法正常牛乳中完全不含硝酸根，天然水中一般都含有硝酸盐，可以通过测定样品中是否含硝酸根判断是否掺水。在浓硫酸介质中，硝酸根可以把二苯胺氧化成蓝色物质。
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测 YLNB 3.2 1、引用依据：GB/T4789.3-2003 2、术语和定义 大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。 3、仪器及器材 3.1 恒温培养箱：36±1℃； 3.2 冰箱：0-4℃； 3.3 恒温水浴锅：46±1℃； 3.4 天平； 3.5 显微镜； 3.6 均质器或乳钵； 3.7 灭菌平皿：直径90mm； 3.8 灭菌试管：18×180和20×200； 3.9 灭菌吸管：1 ml和10 ml； 3.10 灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml； 3.11 灭菌玻璃珠：直径约5mm；
3.12 载玻片； 3.13 酒精灯； 3.14 试管架； 3.15 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。 4、培养基和试剂 4.1 乳糖胆盐发酵管； 4.2 伊红美兰琼脂平板； 4.3 乳糖发酵管； 4.4 生理盐水； 4.5 革兰氏染色液。 5、检验程序 大肠菌群检验程序: 产气 大肠菌群阴性 革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢杆菌 大肠菌群阳性 不产气 大肠菌群阴性 革兰氏染色 报告 乳糖发酵管 36±1℃，24±2h 伊红美兰琼脂平板 36±1℃，18~24h 大肠菌群阴性 不产气 产气 稀释 检样 乳糖胆盐发酵管 36±1℃，24±2h
6、方法 6.1 检样稀释 6.1.1 以无菌操作将检样25ml（或g）放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量
自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体细胞重编程的随机阶段pdf
中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制 2015年05月21日08:16来源：《中国科学报》 原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制 （记者朱汉斌、丁佳通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5月18日，相关成果在线发表于《自然·细胞生物学》杂志。 据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS细胞）具有正常的多能性。 据了解，2006年，日本科学家建立的iPS细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的iPS细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。 什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。 最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。
性激素六项检查的正常参考值精编版
性激素六项检查的正常参考值 建议将检测的时间与月经周期的联系说明。女性六项激素测定的正常值及意义：1）促卵泡生成激素（FSH）：是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素，其主要功能是促进卵巢的卵泡发育和成熟。血FSH的浓度，在排卵前期为 1.5～10mIU/ml，排卵期为8～20mIU/ml，排卵后期为2～10mIU/ml。一般以5～40mIU/ml 作为正常值。FSH值低见于雌孕激素治疗期间、席汉氏综合征等。FSH高见于卵巢早衰、卵巢不敏感综合征、原发性闭经等。FSH高于40mIU/ml，则对克罗米芬之类的促排卵药无效。 2）促黄体生成素（LH）：也是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素，主要是促使排卵，在FSH的协同作用下，形成黄体并分泌孕激素。血LH的浓度，在排卵前期为2～15mIU/ml，排卵期为30～100mIU/ml，排卵后期为4～10mIU/ml。一般在非排卵期的正常值是5～25mIU/ml。低于5mIU/ml提示促性腺激素功能不足，见于席汉氏综合征，高FSH如再加高LH，则卵巢功能衰竭已十分肯定，不必再作其他检查。LH/FSH≥3则是诊断多囊卵巢综合征的依据之一。 3）催乳素（PRL）：由垂体前叶嗜酸性细胞之一的泌乳滋养细胞分泌，是一种单纯的蛋白质激素，主要功能是促进乳腺的增生、乳汁的生成和排乳。在非哺乳期，血PRL正常值为0.08～0.92nmol/L。高于1.0nmol/L即为高催乳素血症，过多的催乳素可抑制FSH及LH的分泌，抑制卵巢功能，抑制排卵。 4）雌二醇（E2）：由卵巢的卵泡分泌，主要功能是促使子宫内膜转变为增殖期和促进女性第二性征的发育。血E2的浓度在排卵前期为48～521皮摩尔/升，排卵期为70～1835皮摩尔/升，排卵后期为272～793皮摩尔/升，低值见于卵巢功能低下、卵巢功能早衰、席汉氏综合征。 5）孕酮（P）：由卵巢的黄体分泌，主要功能是促使子宫内膜从增殖期转变为分泌期。血P浓度在排卵前为0～4.8nmol/L，排卵后期为7.6～97.6nmol/L，排卵后期血P低值，见于黄体功能不全、排卵型功能失调性子宫出血等。
高效液相色谱质谱联用HPLC
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 高效液相色谱质谱联用HPLC .液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解 LC-MS 的主要构造和基本原理； 2、学习 LC-MS 的基本操作方法； 3、掌握 LC-MS 的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍液相色谱 - 质谱法（ Liquid Chromatography/Mass Spectrometry ， LCMS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC 是液相分离技术，而 MS 是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。 LC-MS 经过了约 30 年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。 现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是 1/ 13
浅谈乳制品的检测方法
浅谈乳制品的检测方法 摘要：乳制品业成为国民经济中的重要产业之一，乳制品业的发展开始受到世界各国的高度重视。发展中国家尤其是亚洲国家最近几年也把乳制品业的发展作为提高国民民族素质和营养素质、促进经济发展的重要手段来抓。乳制品的安全问题备受重视，所以要对乳制品做好检测。本文归纳总结一些乳制品的检测方法，为以后乳制品检测提供理论基础。 前言 乳制品业发展越来越迅，并且成为国民经济中的重要产业之一。乳品行业的竞争的越来越激烈，国内外各大乳业集团陆续推出了高品味、高质量、高品质的产品，来迎合现在消费者的喜爱。但是，要想生产出符合消费者要求的奶产品并不是一帆风顺的。需要企业对奶制品的很多方面做出改进。使奶制品的生产以质取胜，才能够更好的占领市场，要想很好的占领市场就注重两个方面。一方面注重生产的产品质量，另一方面检验水平也具有重要的作用。审时度势，调动员工的积极性、创造性才能更好的开展各项工作，同时要注重奶制品的质量，提高素质，严格控制奶制品的质量指标，以先进的技术来降低成本，让企业的发展的道路一片光明。下面介绍一些乳制品大检测方法： 一、对乳制品的新鲜度的快速检验 取乳样10毫升放于试管中，将试管置于沸水浴中加热5分钟，之后再进行观察，观察的过程中发现产生了絮状物，就表示被检测的乳已经不是新鲜的了，这时的酸度就大于26T。 二、提高掺伪掺杂的检验办法的速度 用酒精试验来检测，酒精试验即在试管内用等量的中性酒精和牛乳混合（一般用1～2毫升等量混合），当酸度低于18T的时候，振摇的时候不会出现絮片的牛乳，这就可以证明乳是新鲜的，当酸度高于18T的时候，试管中就会出现絮片，实验的结果就表明这样的乳是次鲜或者变质乳，说明在制作过程中已经搀入陈乳。 三、运用多种方法对乳中的掺杂物进行检验 1.牛乳中掺米汤试液变蓝色 取被检牛乳5毫升放入干净的试管之中，煮到微沸，在此过程中要加入数滴碘液（用蒸馏水溶解碘化钾4克，碘2克，移人100毫升容量瓶中，加蒸馏水至刻度制成），这利用了米汤中含有淀粉，并且淀粉在遇碘会变蓝的特性。试管中的液体变成蓝色的话，就说明检测的乳制品中含有米汤。
2015年版药典高效液相色谱法、质谱法.doc
2015 年版药典高效液相色谱法、质谱法
2015 版药典 --- 高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处 理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9 ～ 4.6mm，填充剂粒径为 3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约 2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物 等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰 基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残 留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当 提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚 合物色谱柱可耐受更广泛 pH值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外 - 可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、 蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外- 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与 其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射 检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈 线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外 - 可见分光检测器所用流动相应符合紫外 - 可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测 器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇 - 水系统和乙腈 - 水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动 相中有机溶剂一般不低于 5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
液相色谱-质谱联用(LC-MS)
液相色谱-质谱联用(LC-MS) LCMS分别的含义是：L液相C色谱M质谱S分离（友情赠送：G是气相^_^） LC-MS/MS就是液相色谱质谱/质谱联用 MS/MS是质谱-质谱联用（通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等） LC-MS/MS与LC-MS比较，M（质谱）分离的步骤是串联的，不是单一的。 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理： 由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法： 色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 从两相的状态分类：
高效液相色谱 质谱联用技术的应用
高效液相色谱质谱联用技术的应用 高效液相色谱(HPLC或LC)是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等。［1］ 高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)联用技术是近几年来发展起来的一项新的分离分析技术，将HPLC 对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、环境分析等许多领域得到了广泛的应用。［2］ 本文着重讲述液相色谱质谱联用仪在药物分析、环境分析上的应用。 1液相色谱质谱联用在药学分析上的应用 1.1LC/MS在药物代谢中的应用 Lee等［3］总结了利用LC／MS鉴定药物代谢产物的方法，主要包括以下几个步骤：测定原形药物的质谱；选择准分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行多级质谱分析；选择原形药物的主要中性丢失，测定生物样品的中性丢失谱，图谱中的离子即为原形药物和可能的代谢物的分子离子；选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。 王宁生等［4］以LC／MS联用技术及标准品对照法，分离检测健康志愿者口服复方丹参滴丸后，血清中水溶性成分及代谢产物，从一级质谱的分子离子峰推测，丹参素及原儿茶醛在体内分别与硫酸及葡萄糖醛酸结合，产生丹参素硫酸结合物及原儿茶醛的葡糖醛酸结合物。 Hsiu SL等［5］研究芍药苷在小鼠体内药代动力学，用LC／MS方法检测体内药物浓度，未检测到芍药苷原形药物；但在血浆及各种排泄物中，均可检测其代谢物，经液相色谱一质谱分析，结合核磁共振(NMR)，确定其为芍药苷的脱糖基代谢物，提示芍药苷给药后，在肠道经细菌转化为PG后，被吸收进入血液循环中发挥作用。 Chen SJ等［6］用LC／DAD／MS／MS联用技术，对山豆根碱在小鼠体内的代谢进行了研究，用ESI ／MSn技术检测山豆根碱的代谢物，并鉴定其主要代谢物为N一去甲基山豆根碱。 1.2LC/MS在药学浓度上的应用 M．Brolis等［7］采用I-IPLC—DAD—MS法从贯叶金丝桃Hyoericum performm中分离鉴定出槲皮素、异槲皮素、金丝桃苷等成分。 Gerthard Brillgma等［8］采用HPLC—NMR和HPLC—ESI—MS—MS法对Habropetalum dawei进行分析，分离鉴定出dioneopeltine、N-methyldioncophylline、N-methyl-7-epi-dioncophylline、tetralone、(1R，3R)和(1S，3R)-N-formyl-8-hydroxy-6-methoxy-l,3-dimthyltetra-hydroisoquinoline等7个已知化合物，以及5’-O-methydioncopeltine、isoquinoline phylline 2个新化合物。 徐智秀等［9］以反相高效液相色谱法分离了9种人参皂苷（I）, 利用三级四级杆质谱研究了9种I的一级质谱（主要给出相对分子质量信息）和二级质谱（提供碎片结构信息），通过它们的质谱图差异对其进行了鉴别, 并将方法用于实际样品中的9种I的定性。 郭继芬等［10］选用Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸(40:60:0.025)为流动相，经紫外检测后，在ESI- 扫描方式下，对HPLC—UV图谱中各色谱峰进行一级和二级质谱分析，与对照品比较鉴定了提取物中4个已知的黄酮类化合物，推断出3个未知黄酮苷类化合物可能的结构。 2液相色谱质谱联用在环境分析上的应用 1
国家乳制品质量监督检验中心社会责任报告-CNCA
国家乳制品质量监督检验中心社会责任报告 2014年度
一、前言 报告的时间和范围界定 2014年1月1日-2014年12月31日。本报告数据截至2014年12月 31日。 报告组织范围 国家乳制品质量监督检验中心及内部科室。为便于表述和方便阅读，“国家乳制品质量监督检验中心”在本报告中也以“检测中心”、“中心”和“我们”表 示。 发布情况 本报告是检测中心发布的第一份社会责任报告。自2014年起，计划每年发布一次社会责任报告。 报告编制的依据 《国家产品质量监督检验中心社会责任报告制度实施指导意见》 国际标准化组织《ISO26000：社会责任指南（2010）》 报告数据说明 本报告引用的全部信息数据均来自于中心正式文件、统计报告与财务报告，以及经由公司社会责任管理体系统计、汇总与审核的各科室的相关信息。图片等素材由中心员工提供，目的为了展现中心的形象，不用于任何商业用途。—2—
本机构及主要负责人对报告内容真实性的承诺 我单位承诺报告的内容真实、客观、有效，无虚假内容。 本机构的社会责任战略、方针、目标和/或价值理念 保证客观、公正地出具检验报告；以客户需求为目标，努力为客户提供诚信、优质服务；不断加强自身建设，提高技术水平，逐步成为具有国际一流先进水平的实验室。 二、社会责任管理体系和制度的建立情况 1、本机构建立的履行社会责任的措施及制度规定 2014年10月23日，中心发布了《社会责任管理制度》，要求每年1月 份对外公开上一年度中心社会责任报告。 2、体系运行和自我改进情况 《社会责任管理制度》发布2个月以来，中心认真按照制度要求，规范检测，努力提高服务水平。严格执行检验安全管理程序和环境保护程序，保证员工健康，合理处置废弃物。积极参与国家政府监管部门对乳制品行业的监测，发现食品质量安全风险问题及时上报，并积极配合政府部门开展检验人员培训工作。 3、利益相关方的识别和参与 利益相关方期望沟通与回应渠道 法人资产保值增值年终总结报告 —3—
自噬研究方法
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。 临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L; Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配; 400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存; 3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成 用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。 文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些 无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。 EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了 Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。 sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存 不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。 Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。 1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol； 2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的
810310631_乳制品质量安全控制技术_终稿
乳制品质量安全控制技术 刘静 随着近年来我国乳业的快速发展和人民生活水平的不断提高, 乳与乳制品的安全日益受到重视。人们不仅要求喝到奶, 而且要喝好奶, 喝放心奶, 食用安全乳品。乳业作为我国农业现代化发展、改善人们膳食结构和提高国民身体素质的重要产业, 对乳及其制品质量安全的有效控制, 一方面有利于保证广大消费者的健康与安全, 减少食物中毒的发生及由此带来的经济损失, 另一方面有利于乳业本身及农业的健康发展。 乳制品的质量安全涉及原料乳生产、乳品加工、贮藏、运输、销售到餐桌等整个过程的不同链条, 每个链条任何一个环节的不规范操作都易使乳受到各种生物性( 微生物、昆虫等) 、化学性( 农药、兽药等) 或物理性的污染, 最终影响乳制品的质量安全。由于原辅料处理中存在问题2011年蒙牛的液态奶黄曲霉毒素质量安全事件；由于奶源环节出现的问题；出现的三鹿婴幼儿“毒”奶粉事件；由于存在工艺不合理、原料和产品质量检验不力及管理不善等问题, 其引发的安全事故不断发生。如2004 年安徽省阜阳奶粉事件, 2008 年3 月珠海维维大亨乳业有限公司生产的高钙牛奶饮品金黄色葡萄球菌污染而引起食物中毒事件, 以及意大利的莫扎里拉奶酪二噁英含量超标事件, 还有长期困扰我国乳业发展的牛奶掺假现象, 都为我国乳品安全敲响了警钟。国产乳品质量安全问题已经打击了消费者对乳品安全的信任度, 影响了乳品的销售, 对处于成长期的中国乳业带来很大的负面影响。下面先对影响乳制品行业质量安全因素进行简单分析，然后再提出相应的控制措施和技术手段。 影响乳制品质量安全的因素主要包括环境污染、兽药和饲料添加剂残留、有害微生物以及人为因素等。这些不安全因素贯穿于整个乳业之中, 涉及从原料乳、加工过程、贮藏、运输、销售到消费者购买后至食用前的各个环节。 一、制约乳业安全的因素主要存在于以下几个方面： （一）、原料乳生产的不安全因素 在养殖环节中的奶牛乳房炎, 在原料乳收购环节, 奶站的挤奶操作不规范, 牛奶检测环节技术手段落后, 对挤奶、贮奶、运奶设备的冲洗不彻底及冷藏设施落后等均会造成牛奶质量的降低。例如：饲料中有害物质及农药的残留, 其他辅
高效液相色谱质谱联用-HPLC-MS-实验-含思考题
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索 一、实验目的 1、了解LC-MS的主要构造和基本原理； 2、学习LC-MS的基本操作方法； 3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍 液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（Q1 = 100-259m/z） （二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例：（Q1 = 259m/z） 本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：
雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤后运动功能障碍
雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤 后的运动功能障碍 摘要:哺乳动物雷帕霉素的受体(mTOR)是负向调节自噬的丝氨酸/苏氨酸激酶。雷帕霉是mTOR 信号抑制剂，可以促进自噬并在中枢神经系统 (CNS) 的几种疾病中起到神经保护作用。在本研究中，我们评估了小鼠脊髓损伤 (SCI) 后，应用雷帕霉素是否促进自噬，并降低神经组织损伤和减少运动功能障碍。我们的结果表明雷帕霉素的应用大大减少了损伤脊髓组织中p70S6K 蛋白质的磷酸化以及LC3和Beclin 1 的高表达。此外，损伤脊髓组织中，雷帕霉素组的神经元丢失和细胞死亡率明显低于溶剂对照组。并且，在大鼠后肢运动功能评分--（BMS评分）中，雷帕霉素处理组得分明显高于溶剂对照组。这些结果表明，脊髓损伤后，雷帕霉素通过抑制 mTOR 信号通路，提高自噬水平，并减少神经组织损伤和运动功能障碍。脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗可能成为一种新的治疗策略。 关键词：自噬；Beclin1；LC3；雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素；脊髓损伤 前言：雷帕霉素是一种大环内酯类药物，最初被用作抗真菌剂。雷帕霉素是一种特殊的哺乳动物雷帕霉素受体阻滞剂(Ravikumar et al., 2004; Schmelzle and Hall, 2000)。它结合于胞质的FK结合蛋白(FKBP12)。雷帕霉素-FKBP12复合物抑制mTOR，阻止p70S6K 和4EBP1的磷酸化(Vignot et al., 2005)。因此，雷帕霉素抑制mTOR 从而促进自噬(Kamada et al., 2004;Klionsky and Emr, 2000;
Schmelzle and Hall, 2000; Wang and Klionsky, 2003)。 自噬是一种细胞内的分解代谢的机制，通过自噬溶酶体途径降解细胞质成分(Mizushima, 2004)。这种机制对维持稳态起着重要的作用，在某些疾病中起到保护作用(Hara et al., 2006; Liang et al., 1999; Ru-binsztein et al., 2005; Shintani and Klionsky, 2004)。自噬在细胞生长和应激状态下清除或者再利用长寿蛋白和受损的细胞器(Levine and Klionsky, 2004;Shintani and Klionsky, 2004)。已有研究表明，自噬对正常细胞的生长，分化和存活也很重要(Reggiori and Klionsky, 2002; Schmelzle and Hall, 2000)。 新近研究表明，应用雷帕霉素能够增强自噬，在亨廷顿病和帕金森病等某些神经退行性疾病中能够保护神经细胞(Malagelada et al., 2010; Ravikumar et al.,2004)。在这些退行性疾病中，应用雷帕霉素诱导自噬能够增强对聚集蛋白的清除从而减少其毒性(Berger et al., 2006; Webb et al., 2003)。以往的研究表明，在创伤性脑损伤和脑缺血后的神经组织中自噬活动是增强的(Bigford et al., 2009; Diskin et al., 2005; Ramiet al., 2008)。应用雷帕霉素增强自噬的活性并降低脑外伤和新生儿缺氧缺血性脑损伤的神经组织损伤(Carloni et al., 2008; Erlich et al., 2007a)。一些研究也表明，自体吞噬增强可以减少受中枢神经系统（CNS）中受损神经细胞的凋亡(Carloni et al., 2008; Pan et al., 2008)。因此，使用雷帕霉素促进自噬被认为能够在中枢神经系统中起到神经保护功能。
如何看性激素六项化验单.
性激素六项的检测及其意义（第一篇文章） 一、检查性激素常识 检查基础性激素前至少一个月不能用性激素类药物（包括黄体酮、雌激素类），否则结果不可靠（治疗后需要复查性激素除外）。 月经任何时间检查性激素都可以，每个时段的正常值不同。但是诊治不孕症一定要了解基础性激素水平，首先要选择月经第2～5天检查，称为基础性激素水平，第3天测定最好。确定是来月经第3天，检查性激素5项即可，可以不查孕酮，孕酮应该在黄体期检查（月经21天或排卵后7天）；但不能肯定阴道流血是否月经，应该检查6项，以防止误诊（根据P 数据可以大概判断月经周期时段）。 月经稀发及闭经者，如尿妊娠试验阴性、阴道B超检查双侧卵巢无≥10mm卵泡，EM 厚度﹤5mm，也可做为基础状态。 基础性激素化验单应该这样看：基础LH和FSH正常值为5～10IU/L，基础E2正常值为25～50pg/ml（这3项结果不能看化验单上的参考值，要按这个标准）；PRL、T可以对照该医院化验单参考值，P正常值见后。 二、性激素检查的临床意义 （一）FSH和LH：基础值为5～10IU/L 正常月经周期中，卵泡早期(月经2~3天)血FSH、LH均维持在低水平，排卵前迅速升高，LH高达基础值的3~8倍，可达160IU/L甚更高，而FSH只有基础值的2倍左右，很少﹥30IU/L，排卵后FSH、LH迅速回到卵泡期水平。监测卵泡早期的FSH、LH水平，可以初步判断性腺轴功能。FSH在判断卵巢潜能方面比LH更有价值。 1、卵巢功能衰竭：基础FSH﹥40IU/L、LH升高或﹥40IU/L，为高促性腺激素（Gn）闭经，即卵巢功能衰竭；如发生于40岁以前，称为卵巢早衰（POF）。 2、基础FSH和LH均﹤5IU/L为低Gn闭经，提示下丘脑或垂体功能减退，而二者的区别需借助促性腺激素释放激素（GnRH）试验。 3、卵巢储备功能不良（DOR）：基础FSH/LH﹥2～3.6提示DOR（FSH可以在正常范围），是卵巢功能不良的早期表现，往往提示患者对超排卵（COH）反应不佳，应及时调整COH方案和Gn的剂量以提高卵巢的反应性，获得理想的妊娠率。因为FSH/LH升高仅仅反映了DOR，而非受孕能力下降，一旦获得排卵时期，仍能获得理想的妊娠率。 4、基础FSH﹥12IU/L，下周期复查，连续﹥12IU/L提示DOR。 5、多囊卵巢综合征（PCOS）：基础LH/FSH﹥2～3，可作为诊断PCOS的主要指标(基础LH水平﹥10IU/L即为升高，或LH维持正常水平，而基础FSH相对低水平，就形成了
性激素检查
性激素检查时间 对于女性不孕者或者月经不调者，通常医生会开出的月经来潮第2-5天的性激素六项检查，包括垂体分泌的促性腺激素——卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、催乳激素（PRL），卵巢分泌的性激素——雌激素（E）、孕激素（P）、雄激素（T）。通过检测这些血清的激素水平，可了解女性的卵巢基础功能，并对生殖内分泌疾病进行诊断。 检查内分泌最好在月经来潮的第2-3天，这一段时间属于卵泡早期，可以反应卵巢的功能状态。但对于月经长期不来潮而且又急于了解检查结果者，则随时可以检查。 查基础性激素前至少一个月不能用性激素类药物，包括黄体酮、雌激素类及避孕药类，否则结果不靠谱，当然治疗后需要复查性激素者除外。 确定是来月经第3-5天，检查性激素5项即可，可以不查孕酮，孕酮应该在黄体期检查（月经21天或排卵后7天）；但不能肯定阴道流血是否月经，应该检查6项，根据孕酮P数据可以大概判断月经周期时段。月经稀发及闭经者，如尿妊娠试验阴性、阴道B超检查双侧卵巢无≥10mm卵泡，EM厚度﹤5mm，也可做为基础状态。 卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH） 1.卵巢功能衰竭：基础FSH﹥40IU/L、LH升高或﹥40IU/L，为高促性腺激素（Gn）闭经，即卵巢功能衰竭；如发生于40岁以前，称为卵巢早衰（POF）。 2.基础FSH和LH均﹤5IU/L 为低Gn 闭经，提示下丘脑或垂体功能减退，（1）下丘脑-垂体功能低下；（2）用GnRH-a垂体抑制性药物注射后；（3）妊娠期、哺乳期、雌孕激素（避孕药）治疗期间。而二者的区别需借助促性腺激素释放激素（GnRH）试验。 3.卵巢储备功能不良（DOR）：基础FSH/LH﹥2-3.6提示DOR（FSH可以在正常范围），是卵巢功能不良的早期表现， 4.基础FSH﹥12IU/L，下周期复查，连续﹥12IU/L提示DOR。 5.多囊卵巢综合征（PCOS）：基础LH/FSH﹥2-3，可作为诊断PCOS的主要指标（基础LH水平﹥10IU/L即为升高，或LH维持正常水平，而基础FSH相对低水平，就形成了LH与FSH比值升高）。 6.检查2次基础FSH＞20IU/L，可认为是卵巢早衰隐匿期，提示1年后可能闭经。 雌二醇（E2） 雌二醇：由卵巢的卵泡分泌，主要功能是促使子宫内膜增殖，促进女性生理活动。 1、基础雌二醇E2＞165.2-293.6pmol/L(45-80pg/mL)，无论年龄与FSH如何，均提示生育力下降。基础E2≥367pmol/L(100pg/mL)时，卵巢反应更差，即使FSH﹤15IU/L，也基本无妊娠可能。 2、基础雌二醇E2水平＜73.2 pmol/L，提示卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)。 3、监测卵泡成熟和卵巢过度刺激综合征（OHSS）的指标 （1）促卵泡排出：促超排卵治疗时，当卵泡≥18mm，血E2达1100pmol/L (300pg/mL)时，停用HMG，当日或于末次注射HMG后24-36小时注射 HCG10000IU。 （2）E2﹤3670pmol/L(1000pg/mL)，一般不会发生OHSS。
液相色谱—质谱联用
液相色谱—质谱联用来进行物质分离的实验 一、实验目的 1.了解液相色谱—质谱联用的基本原理； 2.掌握液相色谱—质谱联用时的操作步骤及实验方法； 3.学习分析色谱图和质谱图。 二、实验原理 利用不同的物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对位移时，使这些物质在两相间进行反复多次分配， 使得原来微小的分配差异产生明显的分离效果，从而依先后次 序流出色谱柱，以此来达到分离多种物质的目的。然后依次流 出的物质进入质谱中被打碎成为各种离子而被检测到。以此达 到分离的目的。 三、实验仪器和材料 高效液相色谱仪及质谱仪（见下图）、甲醇、水、TADB（相对分子量516）、TAIW（相对分子量336）、色谱柱
四、实验步骤 1.将待分离的两种物质的混合物配成溶液加入到2号样瓶中去； 2.启动联机软件，在四元泵模块的空白处右键单击，在弹出的 “方法”选项中编辑好流动相和流速，点击确定，以使体系过 渡到目标状态，直到压力稳定为止； 3.进入“方法”菜单，“编辑完整方法菜单”，按照“方法参考”进行编 辑（“方法参考”中的参数编辑完成后继续进行编辑，编辑质 谱的相关参数：选择正负极及电压等），编辑完成后再次进 入“方法菜单”，选择“方法另存为”命名后点击“确定”进入“序列” 菜单，“序列表菜单”，然后编辑样品瓶位置为1号、样品名称、 使用方法、进样次数、数据文件、进样量，确定后再次进入 “序列菜单”的“序列参数”菜单，再选择文件夹，确定； 4.方法编辑完成且压力稳定后，点击进样器左上方的“序列/开 始序列”按钮，进行测试，等待测试完毕，点击停止按钮。 然后进入“脱机”软件，查看积分测试报告。 五、实验结果及分析 实验时的液相色谱条件统一为：70%的甲醇，流速0.4ml/min，进样量1ul，波长230nm，测试时间15min。在正极性条件下：
高效液相色谱-串联质谱法
附件 面膜类化妆品中氟轻松检测方法 （高效液相色谱-串联质谱法） 1范围 本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定。 2方法提要 面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散，用乙腈从分散液中提取氟轻松，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质，经固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，采用保留时间和特征离子对丰度比定性，以待测物质相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。 本方法的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.05 μg/g。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为纯化水。 3.1甲醇：色谱纯。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3冰醋酸：优级纯。 3.4饱和氯化钠溶液。 3.5 10%亚铁氰化钾溶液：称取115 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O固体，
用水溶解定容至1000 mL。 3.6 20%乙酸锌溶液：称取239 g乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O固体，用水溶解定容至1000 mL。 3.7Oasis HLB固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 3.8 标准物质：氟轻松，纯度不小于99.0%；标准物质的分子式、相对分子质量、CAS登录号、化学结构图参见附录A。 3.9 标准储备液（ρ=1g/L）：准确称取氟轻松标准物质（3.8）10mg，精确到0.01 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，于－18℃下冷冻保存。 3.10 标准工作溶液：临用时，取标准储备液（3.9）适量，用乙腈稀释成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL系列浓度的标准工作溶液。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI源）。 4.2 分析天平：感量0.0001g；0.00001g。 4.3 涡旋混合器。 4.4离心机：转速5000r/min，容量10mL；50mL。 4.5 固相萃取装置。 5分析步骤 5.1样品处理 5.1.1提取 称取样品（带有载体的面膜，去除载体后取样）0.2 g，精确至0.0001 g，置15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液（3.4），于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入2 mL乙腈，充分涡旋提取2 min，以