微载体

微载体microcarrier定义：细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、通常是透明的小颗粒。能使依赖贴壁的细胞在悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。

原理与操作1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。

2. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。

3.细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。

三个方面

●在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。●在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。

●在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、DC以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。

5. 微载体培养操作要点

●培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。

●贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。

●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随意细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。

●收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。

●微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。

生物反应器系统

此技术大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性因素包括：细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。而研制的各种类型生

物反应器系统则可针对上述限制性因素，为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递

效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。已较多使用的微载体培养系统生物反应器，可以实

行计算机控制操作，培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、PH稳定及溶氧供应（O2、

N2、CO2、空气四种纯化气体按比例调节）、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自

动控制。因此，应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势，目前国外相

继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系

统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。

搅拌式生物反应器系统拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史，但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力，从而限制了其应用范围。尽

管如此，由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点，国内外仍有不少应用该系统成功进

行细胞大规模扩增的研究报道。例如，Werner A（2000年）成功地在该系统内进行了肝细

胞大规模扩增的研究。

灌注式生物反应器系统流培养是目前研究热点之一。它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内

增殖，即省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，且可以提高细胞密度10倍以上。

旋转生物反应器近年来，旋转生物反应器系统（RCCS）已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微

重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其内

培育细胞与支架形成的三维空间复合体。至今，近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大

规模扩增。

微载体培养优点

●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；●把悬浮培养和贴壁培

养融合在一起，兼有两者的优点；●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；●

简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；●培养基利用率较高；●放大容

易；●细胞收获过程不复杂；●劳动强度小；●培养系统占地面积和空间小。

一．微载体规模化培养MDCK 细胞增殖H9N2 亚型禽流感病毒的研究*

（1）MDCK 细胞在3 个浓度微载体( 2g/ L, 5g/ L, 10g/ L) 上的生长曲线。结果见图2. 3 个浓度的微载体上生长的细胞在接种5d 后数量达到最高, 密度分别为4. 07 @105 个/ mL, 3 @106 个/mL, 2. 58 @106 个/ mL。其中投放低浓度微载体( 2g/ L) 的转瓶由于微载体数量少, 生长的细胞总数较少; 投放中浓度( 5g/ L) 微载体的转瓶中微载体上生长的细胞数量最多, 生长速度也最快; 投放高浓度( 10g/ L) 微载体的转瓶中由于微载体数量过多、培养过程中相互聚集、碰撞, 导致死细胞数量增加。

（2）微载体是指直径在60- 250Lm, 适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。微载体能成为迄今最常用最有效的动物细胞培养载体, 是因为它具有以下优点:比表面积大; 兼具单层培养和悬浮培养的优势; 易于检测和控制培养系统环境因素和微珠上细胞的生长情况; 培养基利用率高, 易于培养放大; 提供了更近于体内环境的三维立体环境。MDCK 细胞是贴壁生长细胞, 可应用于微载体大规模培养, 进行定量研究。

（3）利用微载体培养细胞, 所用培养瓶需要加入一定浓度的硅化剂进行硅化, 以保证微载体悬浮在培养液中。试验中发现若培养瓶硅化不彻底, 微载体便会贴附在未被硅化处, 使该处细胞无法附着; 另外大量微载体紧密贴附在未

被硅化部位, 微载体表面的细胞也会由于接触抑制发生脱落。本试验利用50%甲基硅油乙酸乙酯溶液, 均匀硅化30min, 即可达到很好的硅化效果。本研究发现当微载体使用浓度为2g/ L 时, 由于其浓度过小会增加传代次数, 不符合生产经济性;但当微载体浓度增加到10g/ L 时, 由于微载体数量过多, 培养过程中微载体相互聚集、碰撞, 使死细胞数量增加, 同时为维持细胞高密度生长, 避免培养液营养消耗过快, 代谢产物累积过大, 就必须频繁更换培养液。因此本研究选择的最佳微载体浓度为5g/ L 。

二．猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145 细胞微载体上培养条件的研究

（1）玻璃器皿的硅化备用的玻璃器皿先用自来水冲洗干净，烘干后再放入清洁液中浸泡24h，取出后用自来水冲净，再用双蒸水洗 3 次后置烘箱中干燥；将干燥后的玻璃器皿放入通风厨中，取少量的硅化液（二甲基二氯硅烷的氯仿溶液）加入到干净的玻璃器皿中，润湿所有可能接触到微载体的表面，将多余的硅化液从器皿中倒出，然后将其晾干。玻璃器皿用蒸馏水彻底地冲洗（至少2次）并高压蒸汽灭菌。

（2）微载体Cytodex-3 预处理预处理好的CT-3 如图1 所示，外表光滑，呈悬浮状态。

图1 Cytodex-3 载体

细胞接种密度测定各组细胞接种密度分别为：A 组-4.28×105cells/mL；B 组-1.70×

105cells/mL；C 组-2.31×104cells/mL；C 组补偿接种细胞密度-1.72 ×105cells/mL。

具体方法：1.玻璃器皿的硅化 2. Cyt odex- 3 微载体预处理 3. 微载体细胞培养--接种细胞;细胞培养：

A 组，

B 组

接种细胞：克氏瓶中细胞经ET 消化后，营养液悬浮细胞，细胞计数后，将细胞加入微载体中，补加营养液至终体积的1/3。微载体培养终体积为400 mL，将接种了细胞的Celstir 双侧臂细胞生物反应器放至37℃温箱中的Micro-Stir 低速磁力搅拌器上。

（3）Marc-145 细胞在微载体Cytode×-3 上的生长情况接种Marc-145 细胞24 h 后，显微镜下可见，A 组中微载体上已全部长满Marc-145 细胞（图2）；B 组中部分微载体上已长满Marc-145细胞，但仍有部分微载体上未长满或仅有几个细胞贴壁，甚至出现空球（图3）；C 组中微载体上仅有个别细胞贴壁，且空球较多（图4），但在补接种细胞后24 h，C 组中大部分微载体上已长满细胞，但仍有部分微载体上细胞未长满（图5）。

图2 A 组接种后24 小时Marc-145 细胞的生长状态图3 B 组接种后24 小时Marc-145 细胞的生长状态

图4 C 组接种后24 小时Marc-145 细胞的生长状态图5 C 组补偿接种后24 小时Marc-145 细胞的生长状态

细胞的微载体技术是动物细胞培养中最先进的技术之一，为细胞的大量生产提供了可能，即可从小的培养体积得到高产量的细胞。本实验在3 mg/mL微载体浓度条件下，研究4.28×105cells/mL，1.70×105cells/mL，2.31×104cells/mL 和1.72×105cells/mL 的细胞接种密度对细胞在微载体上生长的影响，结果表明在微载体浓度相同条件下，细胞接种密度不宜过低，否则细胞很难贴满微载体，导致空球率较高，最终会影响病毒液滴度。

三．微载体cytodex 3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

我们通过微载体cytodex 3 培养和普通单层TCPS培养的比较发现, hMSCs在cy todex 3表面能良好的黏附、贴壁和保持活跃的生长状态, 同普通TCPS单层培养时相同。MTT 检测表明hMSCs 常规的TCPS单层培养时, 在接种后第6天后进入衰退期, 而cy todex 3表面的在第9 天时仍处于对数生长期,FCM 检测两者的细胞表面表型和细胞周期分布无明显差异, 表明hMSC s在微载体cytodex 3表面保持着较高的增殖活性且不影响其正常表面表型。这是因为cy todex 3培养是一种悬浮状态培养, 培养的细胞混合更加均匀, 细胞生长状况均一, 同时cytodex 3提

供了较大的比表面积, 从而能够有助于减少传统单层培养时的接触抑制。普通25 cm % 25 cm细胞培养瓶hMSC s 细胞数约为4 % 105, 而我们在同样容量的细胞培养瓶中通过cy todex 3获得了5 % 106细胞, 提高了10倍, 如果增加微载体的数量和结合旋转培养瓶将能获得更大数量级的hMSC s。

在hMSC s普通的单层贴壁培养体系中, 由于细胞间的接触性抑制, 细胞生长速度变慢, 需要频繁消化传代, 大量培养时不仅工作量巨大, 而且难以避免出现污染, 难以实现肝细胞移植和生物人工肝的治疗所需得的1 % 1010级细胞

数。在实验中, 普通的TCPS培养瓶细胞的传代需要胰酶和EDTA 消化传代, 对细胞有较大的损伤, 从而有较长的适应期, 而微载体cytodex 3表面培养时, hMSCs的传代, 可以简单地加入新的cy todex 3辅以轻微地机械吹打即可完成, 避免了细胞普通消化传代时trypsin和EDTA 对细胞的损伤, 使传代细胞的潜伏期缩短, 有助于细胞的快速生长, 同时细胞的收获也变得简洁。综上所述, 我们认为微载体cytodex 3培养技术可以很好地用来大量扩增hMSC s, 并能保持其良好的增殖活性, 为hMSC s的大规模培养在组织工程学和细胞治疗中的研究提供了实验基础。

四．生物反应器培养Vero 细胞的生长代谢与限制因素研究

（1）其中Vero 细胞在微载体表面的Vero 贴壁过程是细胞生长的关键细胞贴附至微载体的表面受到许多因素的影响,这些因素包括微载体表面特性,培养及组成以及pH、细胞生理特性和培养环境混合强度等。微载体在正常的生理状态下,细胞表面带有不均匀的负电荷,因此它贴附到带有负电荷表面时需要二价阳离子或吸附蛋白作为桥梁在细胞与微载体之间形成“细胞—桥—微载体”的结构模式。当细胞贴到带有正电荷的载体表面时则无需这种桥的结构,此时,在培养基中添加血清反而会降低细胞的贴附速度。细胞贴壁速度的快与慢直接影响到细胞能否快速进入生长期,在培养过程中表现为细胞贴壁慢延滞期长,贴壁快延滞期短,因此有必要对选定培养系统的生长过程进行详细的研究。

对于生物反应器的培养系统(细胞微载体培养基组成等) 影响细胞贴壁速率的因素主要包括细胞的接种密度、微载体浓度、搅拌转速、细胞的生理状态等。以前,大部分细胞贴壁研究主要集中于研究微载体的表面性能和培养基的构成成份对细胞贴壁速率的影响,而没有对上述工程因素进行系统的研究,因此未能有效地指导大规模工业化培养过程。我们的主要目的便是系统地研究细胞接种密度、微载体浓度、搅拌转速及细胞生理状态对Vero 在微载体表面贴壁速率的影响,以从工程学的角度考察细胞贴壁动态过程,揭示优化操作策略,指导工业化过程开发。

（2）A.细胞代谢周期细胞接种后,通常第一天的细胞处于停滞期,这是细胞分裂繁殖前期的准备,以及

细胞贴壁所需的时间。一方面,细胞逐渐适应新的环境。另一方面,又要不断合成所需的前体,积累细胞分裂繁殖所需的活性物质,并使之达到一定的浓度,第二天,细胞进入对数生长期,第三、四天达到最高峰,并处于平衡期,随着细胞密度的增加,葡萄糖不断被消耗,乳液和氨也不断积累,到反应后期细胞死亡脱落。

B.细胞生长代谢细胞生长状态和普通方瓶和转瓶培养类似,当细胞贴壁微载体上后,进入对数生长期,在72h 左右,细胞生长出现一个延缓期,在方瓶和转瓶培养时也都出现这种情况,这可能由于当细胞长满微载体表面后开始多层生长的一个适应期,营养成分在细胞内外扩散和交换的微环境发生了变化而导致这一现象。这一现象也表明Vero 细胞并没有严格的接触抑制现象。而是在微载体边面和微载体之间形成多层生长。

五．微载体培养技术的研究进展郭燕华郭勇罗立新

1967 年V an Wezel 首先开发微载体培养动物细胞。30 多年来,微载体技术的研究随着动物细胞培养广泛的应用而深入,并得到了越来越多的应用。

1 微载体培养动物细胞的特点微载体是指直径在60 —250μm ,适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。微载体能成为迄今最常用最有效的动物细胞培养载体,除了由于许多病毒疫苗和重组蛋白仅可在贴壁依赖型细胞系生产的限制外,还因各类微载体共同具有的优点[1 ,

2 ] :比表面积大;易于检测和控制培养系统环境因素和微珠上细胞的生长情况;培养基利用率高; 可实现无细胞过滤,优化下游工程;培养放大易,劳动强度大,可系统化,自动化,减少污染;提供了更近于体内环境的三维立体环境,细胞在微载体上可克服接触抑制,形成多层生长。目前,在实际中应用广泛的是固体微载体,包括实心球体微载体和大孔微载体。实心微载体易于细胞在微珠表面的贴壁、铺展和病毒生产时的细胞感染[

3 ] ,放大过程中球转球接种工艺[

4 ] 。其中Cytodex系列目前用途最广。但实心微珠相对于利用微珠内部来培养细胞的大孔微载体比表面积和可获得的细胞浓度较小,细胞易受搅拌、珠间碰撞、流动剪切力等动力学因素破坏[

5 ] 。大孔微载体可广泛用于填充床、流化床、搅拌釜生化反应器,且在灌流反应器中可保持数月的良好生产力,能在降低培养基血清含量的同时保证细胞和目的产物的产量[

6 ,

7 ] ;但它在空间上阻碍了氧等营养成分的传递和病毒的感染细胞,积累代谢废物[

8 。鉴于固体微载体的不足,Charies 等开发了氟碳化合物液膜微载体。这种液体微载体的微珠形成、细胞贴壁、培养均在搅拌下进行,当达到培养目的时停止搅拌即可通过混合物的离心分相使细胞游离地悬浮于有机相和培养基相之间,用移液管即可方便移出[

9 ] ,克服了固体微载体吸附血清、易于变性而仅可一次性使用,培养后的分离过程损失细胞等缺点。

2 过程优化载体的广泛应用促进了细胞贴壁过程、培养中新的监测方法和培养放大工艺等的研究,它们关系

到生产整体可操作性、经济性,是微载体培养模式优化的重点。

2. 1 贴壁于细胞生产与贴壁分别属于生物和物理两个性质不同的过程,影响这两个过程的因素就有了很大的差异。

2. 1. 1 微载体性质1) 微载体的基质和修饰:任何时候vero 细胞Cultispher2G表面的相互作用都比与Cytodex21 表面的相互作用低,因此对前者贴壁时要求血清补料[3 ] ;肝细胞在血清或纤连蛋白存在时可吸附于Cytodex21上,对Biosilon 则要求载体被纤连蛋白包被,对Cyto2dex23 则在血清是否存在时均可贴壁[10 ] 。

(2) 微载体表面的电荷密度和表面基因的疏水性:由于细胞膜是与微载体表面的带电基因作用而贴壁的,部分微载体经DEAE 修饰提高表面正电荷密度可提高细胞贴壁速率[11 ] 。但电荷密度过高是会危害细胞的,如改良前的Cytodex21 正是由于电荷密度过高产生了损失接种细胞的“毒性效应”[1 ] 。Grinnell 则发现增加微珠表面一级氨基荷电基因疏水性可提高细胞贴壁率[12 ] 。

(3) 微载体浓度:一定微载体接种一定细胞有其最优珠荷载。微载体浓度过小则不符合生产经济性,增加传代次数;浓度过大则造成一定接种细胞数量下载体的浪费或培养后期细胞生长营养不足[12 ] 。

(4) 接种过程中,胞珠间的吸附与胞间的凝集是同时存在而又可比的,对于大孔微载体,胞间凝集比实心微载体更明显。为此,应针对不同微载体进行预温育等不同预处理[6 ] ,以使细胞贴壁率最大化,胞间相互吸附作用最小化。

2. 1. 2 接种水平种水平就是指接种阶段加入的细胞数与载体微珠量的比率,其优化目的是使已加入而未利用的微珠最少,可利用于细胞生长的总表面积最大,细胞均匀分布在微珠上,目的产物最大化。一定细胞的可用接种范围很大,但存在最佳值,且使用较优培养基可使接种水平较小,这表明了除可利用表面积外,环境因素也影响接种水平[6 ,12 ] 。此外,保持恒定微载体量,连续改变加入的细胞数的实验表明贴壁细胞数存在一饱和点,之后再增加加入细胞数不会增加贴壁细胞。饱和点上贴壁细胞占总加进细胞50 %～80 % ,被涂布的微载体表面为50 %～100 %。可见,接种水平与贴壁率或与最终细胞浓度的关系均是非线性的[10 ] 。

2. 1. 3 搅拌方式

实心微载体接种时连续的低速搅拌是有效的,而且可以使细胞贴壁更均匀;但大孔微载体要求间歇搅拌。这是由于当细胞与微珠表质的相互作用较弱时贴壁过程采用连续搅拌利于凝集,导致细胞在微珠上的低分布,而间歇搅拌中的静止状态使细胞能靠近微珠表面,保证了最佳的细胞贴壁分布[6 ] 。但大规模培养生产缺少搅拌(即使仅在初期或仅是间歇停止搅拌) 会产生温度控制和对细胞供氧不足等问题,因此实际大规模生产中大孔微载体接种采用传统的沉降2混合操作并非最优[12 ] ,最优的搅拌方式仍有待进一步探讨。

2. 1. 4 培养基中的血清固体微载体对培养基,尤其是血清的吸收,引起血清蛋白与细胞对微珠表面竞争吸附,即血清在细胞贴壁时的存在会影响接种过程,使细胞对微珠贴壁率下降,促使细胞凝集。采用血清补料可解决这一问题[6 ] 。

2. 1. 5 pH 值于培养基的pH 影响着微珠表面的电荷密度,综合前文可知较低pH 利于细胞贴壁。研究也表明细胞贴壁的最优pH 较其生长时的最优pH 低很多,因此微载体上培养细胞总要求从接种到培养阶段的pH 程序上升[6 ,12 ] 。

2. 1. 6 氧微生物相较,动物细胞在培养中对氧的要求已大为下降,但仍需供给充足的氧以满足细胞在微珠表面生长和扩展的需要。由于贴壁主要是物理过程,有些细胞(如Hep G) 对氧几乎无要求,而另一些细胞的贴壁则受供氧情况的影响,甚至必需氧(如肝细胞) 。研究表明氧与细胞的固有性质无关,因此贴壁时氧分压的提高可促进细胞与微珠表面的相互作用或修复细胞曾受的破坏的同时,不影响细胞[10 ] 。此外,液体深度、微载体浓度、细胞浓度、搅拌间隔等参数对细胞表面的氧分压均有影响,从而影响贴壁。已建立了以上参数对细胞表面氧分压影响的模型。影响细胞贴壁的参数还有很多,且它们之间是相互联系的:如贴壁时细胞与微珠间的相互作用会引起两相界面张力、贴壁微环境中pH 值等的变化;接种效率与微载体利用率相互制约,不可同时达到最优等。此外由于细胞贴壁时的官能度和生存力等随时间下降,因此要求降低贴壁过程总需时,加速细胞贴壁。

2. 2 新的细胞培养生长监测法

已有文献[9 ] 归纳常用于微载体培养细胞过程中细胞生长监测的各种方法,这里仅介绍定量影像分析法[13 ] 。该法需配备扫描电子显微镜,样品须经无Cu2 + 或Mg2 + 的PBS 洗涤沉降,低温固定,梯度甲醇PPBS 程序脱水,真空喷金等预处理。样品处理后在扫描电子显微镜观察分析。该法主要用于研究微载体的移植、微载体团聚的形成、培

养后期细胞形态大小的变化等。主要缺点:二维的影像不能准确表达细胞和微载体三维的情况;个体细胞的孤立分析不符合细胞间相互联系的实际;样品经脱水使测得细胞或微载体团聚的大小小于实际;设备昂贵,处理分析过程复杂而费时。但定量影像分析不依赖细胞形状,可同时获得微组织的数量、大小、形态等生物质数据,且是目前可得到全部生物质准确定量数据的唯一方法,其应用正越来越广泛。

2. 3 培养放大过程的再接种工艺

人用病毒疫苗等物质的需求越来越大,且其生产要求生产菌株在感染、分泌前有一定的浓度和数量,因此要求深入研究微载体培养放大过程,发展再接种工艺。初期的微载体技术的培养放大须经过培养细胞的剥落、分离和已分离细胞作为放大培养菌种的再接种三步。细胞剥脱时常破坏了大量细胞,阻碍了大规模生产中微载体的应用。使用液体微载体或选用球转球放大工艺可解决这一问题。前文已介绍了液体微载体;球转球放大工艺是直接加入新的微载体,调节培养条件,通过微珠间的接触碰撞实现细胞在微珠间的转移,延长细胞寿命,提高细胞分泌物的产量。这一工艺条件已初步定量,并建立了动力学模型[4 ] 。球转球放大工艺虽然操作步骤简单、污染机会少、细胞活性高、微载体损失少而可连续使用,但受细胞运动性的限制使该放大工艺仅在实心微载体上较易实现,制约了在大孔微载体上的应用。另一个问题是在微载体上进行细胞连续传代时,每一次微珠间的细胞传递均表现细胞增殖能力的下降,但在T 瓶进行相同规模的培养时却不出现这种现象。Sean[14 ] 发现以Cytodex21 连续继代培养MRC25 细胞系统中每代细胞增殖能力下降的加速缘于培养基中高浓度的血清。他进而发展了PPRF92培养基补加混合物。在MRC25 细胞连续继代培养时加入PPRF92 可保持细胞生长能力;培养基血清水平低至 1 %时仍能使细胞生长良好; 使用补加PPRF92 和1 %ABS 的DMEMPF12 培养基可使MRC25在微珠上成功连续传代13 次至细胞衰老,最终倍增水平为68。

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六．应用微载体Cytode x 3 高密度培养L-02 人肝细胞系

形态观察( 1) 倒置显微镜下观察: L-02 肝细胞悬液和微载体一起加到限制贴壁培养瓶, 静置4h 后, 所有的细胞均附着于微载体上并开始铺展; 第4 天时, > 70%的微载体上长满了细胞, 且可见细胞包裹的微载体间互相粘连, 培养第6 天时, 所有的微载体均包满细胞, 多个细胞包裹的微载体间相互粘连, 片状或成团聚集生长( 图1) 。培养第8 天时, 已可见细胞脱落, 第10 天脱落死亡细胞明显增多( 图2) 。( 2) 透射电镜下观察: 肝细胞均具有正常的超微结构, 包膜完整、清晰, 可见微绒毛; 与微载体连接紧密, 粗面内质网和线粒体等细胞器十分发达, 糖原丰富( 图3) 。

微载体培养技术作为生物工程学大量扩增细胞的一种手段正日益发挥着重要作用, 研究人员已可利用其生产单克隆抗体、激素、疫苗或细胞生长因子等[ 2] , 在临床方面, 主要是用于培养各类肝细胞作为生物人工肝系统的生物活性材料[ 1, 3]。在生物人工肝系统中, 所采用的肝细胞不管是何类型, 都应满足两个条件: ( 1) 细胞数量应达

到109 以上且易取用; ( 2)肝细胞应形成聚集体, 因为肝细胞的功能表达有赖于细胞间和细胞与基质间接触。微载体培养的肝细胞正好同时满足了这两点。

目前市面上最常用的微载体有Cytodex 1、2、3型, 由于1 型和2 型均带阳性电荷, 不利于肝细胞的粘贴。Cytodex 3 因其不带电荷且表面为胶原包被,具有良好的粘附特性, 这样Cytodex 3 作为肝细胞聚集的核心, 形成微载体诱导的肝细胞聚集体(MILCA) [ 4]。由于Cytodex 3 水化后极易粘着于各类瓶壁, 因此微载体培养细胞必然伴随综合利用限制细胞贴壁技术, 如采用硅油、聚羟乙基异丁烯酸等材料。笔者通过比较发现, 聚羟乙基异丁烯酸的限制贴壁能力要大大优于硅油, 可减少微载体的浪费, 在用培养瓶的限制贴壁处理上还是选用Poly-HEMA为佳。在已应用于临床生物人工肝系统的肝细胞仅两大类三种: 肝肿瘤细胞中的Heptix C3A、Hep G2 细胞和原代培养的猪肝细胞。肝细胞系在体外培养时可无限增殖, 易达到足够数量和活力, 高分化的肝细胞更保持正常肝细胞的许多特性, 具备肝的特异功能。L-02 人肝细胞组织学来源为人的正常肝组织,已永生化。就本研究的结果看, 其反映生物合成功能的白蛋白含量、反映氨基酸代谢的尿素含量均达到一定水平, 显示良好的生物学活性, 表明如果应用于体外生物人工肝支持系统, 可用培养至第6 天的细胞-微载体培养体系作为生物反应材料。

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七．微载体培养动物细胞技术的研究进展过琴媛,王辉综述;沈心亮审校

摘要:微载体是一种新兴的大规模细胞培养技术,是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。它具有均相培养兼具平板培养和悬浮培养的优势,培养条件(温度、pH值、二氧化碳浓度等)容易控制,并且培养过程系统化、自动化,不易被污染。本文简要介绍了近几年来常用的几种制备微载体的天然聚合材料,比较了固体微载体和液体微载体各自特点,列举了微载体培养技术的几种生物反应器系统。

关键词:微载体; 细胞培养

1微载体培养动物细胞的特点

微载体是指直径在6O～250μm,适用于贴壁依赖型细胞在其表面贴壁生长的微珠。微载体能成为迄今常用而有效的动物细胞培养载体,除了由于许多病毒疫苗和重组蛋白依赖贴壁细胞系生产的限制外,还因微载体具有以下的优点: ①兼具单层培养和悬浮培养的优势,且是均相培养; ②细胞所处环境均一; ③环境条件(温度、pH、C02等)容易测量与监控;④具有较高的比表面; ⑤培养操作可系统化、自动化,降低了污染发生的机会。

（1）固体微载体

目前,实际广泛应用的是固体微载体,包括实心球体微载体和大孔微载体。实心微载体利于细胞在微珠表面贴壁、铺展和病毒对细胞的感染〔5〕,放大过程中球转球接种工艺〔6〕等,以Cytodex系列应用最广。其中Cytodex1、Cytodex2 为了便于细胞吸附和生长其表面都具有特殊的小电荷分子; Cytodex3在微载体的表面覆盖一层胶原蛋白以更接近机体内环境。这种微载体细胞贴壁快、生长快,且能长时间培养。但实心微珠相对于利用微珠内部来培养细胞的大孔微载体,其比表面积和可获得的细胞浓度皆较小,细胞易受搅拌、珠间碰撞、流动剪切力等动力学因素破坏。大孔微载体Cytopore则克服了上述弊端,这种微载体以纤维素为基质,内部有许多网状的相互连通的小孔通向载体表面,细胞在接种后,容易进入^微载体内部生长分裂,从而避免剪切力或气泡的影响, 既使大部分细胞免受机械损伤,又为细

胞提供了充分的生长空间。这种微载体可广泛用于填充床、流化床、搅拌釜生化反应器,且在灌流反应器中可保持数月的良好生产力,能在降低培养基血清含量的同时保证细胞和目的产物的产量〔7〕,但它在空间上阻碍了氧等营养成分的传递和病毒对细胞的感染,并使代谢废物在其中累积〔8〕。

（2）微载体大规模细胞培养的生物反应器系统

针对微载体细胞培养的限制性因素,为提供低剪切力、高效率氧传递、易于细胞传代等适宜的外部环境,应用生物反应器系统进行微载体大规模细胞扩增具有明显优势。目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统,如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统及灌注式生物反应器系统等。

4.1搅拌式生物反应器系统

最简单的生物反应器系统即为搅拌式生物反应器系统。该系统在旋转培养瓶的瓶底放置磁力搅拌棒,通过磁力搅拌,使微载体在培养基中基本上达到均匀分布。搅拌式生物反应器系统在微载体大规模细胞扩增研究领域的应用中已有较长的历史,但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力,从而限制了其应用范围。尽管如此,由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点,应用该系统进行组织工程种子细胞大规模扩增国内外仍有不少成功的研究报道。例如,Wetller 2000年就成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。

4. 2灌注式生物反应器系统

搅拌式生物反应器系统尽管存在很多优点,但机械搅拌会带来不需要的剪切力。为了消除这种不利因素,国外常采用灌注式生物反应器系统来进行微载体大规模细胞培养研究。灌注培养是目前细胞工程领域研究热点之一,它的特点是不断地加入新鲜培养基,以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基,使细胞在一个相对稳定的生长环境内增殖,既省时省力,又减少了细胞被污染的机会,且可以提高细胞密度10倍以上。目前,采用灌注培养的细胞密度已达到1 ×108 Cells/ml,而人体细胞密度是( 2～3) ×108 Cells/ml〔10〕,因而应用该系统进行微载体大规模细胞扩增仍有巨大的开发潜力。

4. 3旋转生物反应器

近年来,旋转生物反应器系统(RCCS)已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养,又能在又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体〔11〕。该反应器是将细胞种植到微载体后, 将其移入RCCS圆柱状的培养容器内,加满培养液。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转,细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道,并随容器一起旋转且不与容器壁和其它物体相撞。由于系统无推进器、气泡或搅拌器, 使破坏性应力减到最小。在RCCS中的细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出CO2。因该系统可提供破坏性应力很低的细胞生存环境,因此,近年来已经广泛应用于微载体系统大规模细胞培养研究,至今已有近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增〔12〕。

5 微载体培养细胞用于生物医药制品的生产

动物细胞的大规模培养,始于制造口蹄疫疫苗。经过30多年的发展,该技术已日臻成熟。利用动物细胞大规模培养技术已经生产出了一些生物制品及具有重要实用价值的细胞产品,如病毒疫苗、干扰素、激素、单克隆抗体等。商品化的微载体虽然很多,但至今没有哪一种微载体适用于培养各种类型的细胞。选择何种类型的微载体要从以下几个方面考虑:微载体的价格;特殊细胞对微载体表面的特殊要求;收集细胞的方式,是否希望将微载体溶解, 比如用胰蛋白酶/EDTA溶解明胶微载体、用胶原酶溶解胶原微载体,从而得到高质量的细胞悬浮液。经验表明,对于每种特定的细胞系,在大规模培养之前,有必要使用几种不同的微载体先进行小规模培养,认清不同的微载体在细胞产量、蛋白质表达和培养寿命等方面所存在的差别。

6展望

理想的微载体应有利于细胞的快速附着和扩增,有利于细胞高密度生长,不干涉代谢产物的合成和分泌。展望未来,今后微载体系统大规模细胞培养技术发展的总方向是: ①研制细胞生长性能优良、吸附细胞容易并能重复使用的新型微载体; ②研制规模化生物反应器和剪切力小、混合性能好的新型细胞培养系统; ③设计新的适合于各个体细胞株(系)的无血清、无蛋白培养基; ④将生物力学和材料科学的相关成果移植于细胞工程领域,提高细胞大规模培养的仿生化、自动化和精巧化水平。

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八．动物细胞培养及微载体技术研究进展

4 微载体培养研究进展

4. 1 微载体培养的发明和发展

微载体培养首先是由A1 L1 Van Wezel 于1967 年提出, 其方法在培养动物细胞时, 将制备好的细胞悬液和事先在血清中浸泡并消毒过( 可加快细胞与微载体的贴附速度) 的微载体混合孵育一段时间, 待细胞贴附于微载体上后, 再转移至培养液中培养, 并借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中[15218] 。它所采用的微载体通常是直径为60~ 250 Lm的固体小珠, 材料大致有纤维素、塑料、明胶、玻璃和葡聚糖五大类, 近年来国外又相继开发出多种材料的微载体, 如液体微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA 微载体、甲壳质微载体、藻酸盐凝胶微载体等。微载体技术经过30 余年的发展逐渐完善和成熟, 并已广泛应用于细胞工程领域。目前, 利用微载体系统进行组织工程细胞的大规模培养受到医学科研人员青睐, 而且其研究发展非常迅速, 已成功利用该技术进行了肝细胞、成纤维细胞、生肌细胞、软骨细胞等细胞系的大规模培养[ 19220] 。

4. 2 微载体培养的优点

微载体培养一定程度上克服了最初的转瓶培养的不足, 具有很多优点[21222] : ( 1) 兼具单层培养和悬浮培养的优势, 且是均相培养; ( 2) 细胞所处环境均一; ( 3) 环境条件( 温度、pH 和CO2 等) 容易测量与监控; ( 4) 具有较高的比表面积; ( 5) 培养操作可系统化、自动化, 降低了污染发生的机会。

4. 3 微载体培养步骤

1) 选择合适的微载体类型。为了获得最高产量的细胞, 先用少量几种微载体做细胞培养试验,在一定时间内计算细胞贴壁率和细胞数, 并绘制成曲线, 比较细胞容纳量、微载体用量、搅拌速度,由此选出适当的微载体。

2) 浸泡水化及消毒。在玻璃容器内加入适量的微载体, 按一定的比例加入无Ca2+ 、Mg2+ 的磷酸缓冲液( PBS) 浸泡3 h 以上, 轻轻搅动, 然后加入1/ 2 的新鲜PBS 再洗1 次。微载体的浓度一般按3 mg/ 100 mL 配制, 搅拌速度控制在50~70 r/ min。3) 接种。根据细胞类型决定接种浓度。4) 培养观察与细胞计数。在显微镜下直接观察微载体上细胞的生长情况, 将微载体上的细胞消化后计数并计算其浓度。5) 消化。传代培养或收获细胞均需使细胞脱离微载体, 通常采用酶消化法。6) 分离细胞。对于回收率要求不高的细胞种类分组沉降简单易行, 而若要求高回收率, 则可用过滤方法, 采用100 Lm孔径的尼龙网、不锈钢网、多孔玻璃滤器等将细胞与微载体分离开。

7) 传代培养。微载体上分离后的细胞可进一步做微载体传代培养。如果进行放大、培养, 可在细胞脱离微载体后加入一些新的微载体以增加培养体积, 提高培养液的利用率, 但此法比全部用新微载体的细胞得率低。

4. 4 微载体培养存在的问题

微载体培养技术经过几十年的发展, 在很多技术方面取得了较大的进展。尽管如此, 在目前的大规模细胞生产中还存在一定的问题。

(1) 采用微载体培养技术进行培养时对微载体的要求较高。随着细胞的黏附和生长, 微载体的浓度要逐渐增加, 应及时提供细胞生长所要求的越来越多的表面。但是在培养系统及培养方式确定的情况下, 微载体的浓度不能无限增加, 细胞的生长代谢会由于微载体浓度达到临界值而受到抑制。

(2) 采用微载体法进行组织工程种子细胞大规模培养时, 细胞扩增的效率会受到诸多因素的影响和限制, 主要包括种子细胞对剪切力的敏感性、细胞达到高密度后的营养供给、代谢产物的堆积以及传代和扩大培养等, 特别是由于细胞的凋亡造成了细胞的大面积死亡, 可严重影响细胞高活性和高密度的维持。

( 3) 培养用微载体颇为昂贵, 限制了细胞培养工程在发展中国家的发展。

( 4) 有些载体无法降解, 从而限制了其临床应用, 采用可降解的材料制备微载体, 不仅可增加细胞的黏附, 而且必将具有更大的临床应用潜能。

4. 5 微载体培养的展望

在过去的30 年里, 微载体系统细胞大规模培养技术主要用于生产一些具有重要实用和商业价值的产品, 如疫苗、基因工程产品等, 且已积累了大量的实践经验和关键的实验数据。随着科研方法的不断改进, 微载体系统细胞大规模培养技术必将有较为广阔的应用前景。由于微载体系统细胞大规模培养还存在一定的限制因素, 今后可从以下几方面进行发展。

( 1)目前的微载体虽在某些方面进行了改善, 但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济合理、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求。应研制满足上述要求、细胞生长性能优良、吸附细胞容易并能重复使用的新型微载体。

( 2) 在培养过程中, 人们往往忽略了微载体对细胞的生物学作用。可尝试结合当今最新的纳米技术, 在载体表面附着一些生物功能性分子, 对培养过程进行一定的调节, 同时通过不同的生物以及选择不同的加入时间, 从而实现培养过程的阶段性调控。( 3) 研制规模化生物反应器和剪切力小、混合性能好的新型细胞培养系统。( 4) 设计新的适合于各个体细胞株( 系) 的无血清和无蛋白培养基。( 5) 将生物力学和材料科学的相关成果移植于细胞工程领域, 提高细胞大规模培养的仿生化、自动化和精巧化水平。

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九．聚合物微载体及其在细胞培养方面的应用

4 应用

4 1 微载体培养细胞用于生物医药制品的生产动物细胞的大规模培养, 源于制造FDM ( 口

蹄疫) 疫苗。经过30 多年的发展, 该技术已日臻成熟。利用动物细胞大规模培养技术已经生产了一些具有重要实用和生产价值的细胞产品, 如病毒疫苗、干扰素、激素、单克隆抗体及其它高疗效的生物制品。商品化的微载体虽然很多, 但至今没有一种微载体适用于培养各种类型的细胞。选择何种类型的微载体要从以下几个方面考虑: 微载体的价格; 特殊细胞对微载体表面的特殊要求; 收集细胞的方式: 是否希望将微载体溶解, 比如用胰蛋白酶EDTA 溶解明胶微载体、用胶原酶溶解胶原微载体, 从而得到高质量的细胞悬浮液。经验表明, 对于每种特定的细胞系, 在大规模培养之前, 有必要使用几种不同的微载体先进行小规模培养, 认清不同的微载体在细胞产量、蛋白质表达和培养寿命上所存在差别。首先微载体的基质和表面性能对细胞在其上的粘附和铺展有重要影响。Kiremitci 等人[ 16] 研究了聚合物材料的表面性能与成纤细胞的附着之间的关系。实验表明, 微载体表面可供细胞附着的位点是有限的, 其数目取决于微载体表面的电荷数目和表面可湿性, 作者同时也提出, 借助于合适的改性方法可以得到理想的细胞附着率和生长速度。微载体的大小也会影响细胞在其表面的分布进而影响最终产品的产量。Kennard 等人[17] 在交联明胶微载体上培养CHO 细胞生产黑瘤抗原p97, 研究发现, 与培养在Cultispher GH 微载体( 直径为320 m) 上的细胞相比, 培养在Cult ispher G 微载体( 直径为200 m) 上的细胞生存能力更强, 并能生产出更多的细胞特异蛋白p97。Hu 等人[ 18] 也曾研究过细胞在微载体上的分布情况与微载体直径的关系, 结果表明, 细胞在微载体上生长的动力学受其在微载体上分布情况的影响。对于FS 4 细胞, 每个微载体上能够激发细胞生长的临界细胞数目是

4; 合理地选择微载体的直径可以改善细胞生长的动力学, 已有实验表明, 选用恰当的微载体直径并配以改进的培养液组成, 可以使所培养的FS 4 细胞的增殖比( 最终所得细胞密度与接种密度的比值) 增加到15~ 16 倍, 而一般的批式培养中, 细胞的增殖比仅为3~ 4 倍。

4 2 微载体培养细胞用于组织工程

组织工程是应用工程科学和生命科学的原理,开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物。其基本方法是: 将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的具有良好生物相容性和可降解的聚合物支架上,形成细胞支架复合物, 然后将这复合物移植到动物体内组织缺损部位, 最后形成一个与基体本身在组织学和生化组成上完全相同的组织, 从而完成组织缺损的修复与再造。组织工程治疗模式属于新兴的基于细胞的治疗模式。组织工程技术的产生源于早期的细胞培养工作, 它不仅需要合适的种子细胞, 还需要合适的载体来携带种子细胞。培养载体上的细胞在新的血管形成之前通过扩散作用交换营养物质, 但由于营养物质和代谢废物的扩散限制, 即使体积适中的载体也会产生中心处细胞坏死的现象。而多孔细胞微载体与常用的三维支架材料相比, 对营养物质和代谢废物流的扩散限制较小, 更利于新血管的形成。并且, 这些微球载体可通过注射的方式进入机体受损部位, 无需移植手术, 操作更便捷, 使病人减少痛苦和节省费用。用于组织工程的微载体必须具有良好的生物相容性和完全可降解性, 并且降解产物对细胞无毒。Fink[19] 等将软骨细胞培养在一种可降解的微载体上, 待细胞生长一段时间开始团聚时, 将微载体连同细胞直接注射入体内。Senuma 等[ 10] 用聚乳酸制备了可注射的带孔微载体, 实验结果预示了该微载体在组织工程上的应用潜力。Domb 等[20] 将壳聚糖微载体培养细胞用于组织工程。

目前关于组织工程用微载体的报道不多, 但鉴于微载体在培养细胞方面的种种优越性, 可以预见, 随着材料科学和微载体制作工艺的不断发展以及对材料- 细胞相互作用研究的不断深入, 微载体在组织工程的应用必将展示出喜人的前景。

5 展望

从现有微载体的特点及其实际应用情况来看,开发生长性能优良的新型廉价微载体是今后细胞培养微载体的发展方向, 大孔微载体因其具有支持细胞三维生长的独特优势将越来越发挥其独到作用,而用天然生物可降解材料制备的微载体有望在组织工程领域得到应用。

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十．采用微载体技术大规模培养组织工程种子细胞

摘要:如何获得大规模、具有再生活力的种子细胞已经成为当前组织工程研究面临的最关键的限制性因素;针对这一限制性因素,研究人员对多个细胞培养系统进行了研究,其中包括微载体细胞培养系统,该系统最初主要用于细菌的大规模培养研究,但近年来的研究发现,微载体细胞培养系统也有助于种子细胞的体外大规模扩增;本文对应用微载体技术大规模培养组织工程种子细胞进行了简要综述。

关键词:微载体;组织工程;生物反应器

Ven Wezel 于1967 年最先使用微载体系统进行动物细胞大规模培养。微载体系统培养细胞具有显著的优点〔2～4〕: (1) 兼具单层培养和悬浮培养的优势,且是均相培养; (2) 细胞所处环境均一; (3) 环境条件(温度、pH、CO2 等) 容易测量与监控; (4) 具有较高的比表面; (5) 培养操作可系统化、自动化,降低了污染发生的机会。经过三十年的发展,该技术目前已渐日趋完善和成熟,并广泛应用于细胞工程领域以生产一些具有重要实用和商业价值的细胞产品,如疫苗、基因工程产品等。近年来,应用微载体系统进行组织工程种子细胞大规模培养受到科研人员青睐,研究进展很快。今后有望采用该技术解决组织工程种子细胞来源难题。本文针对这一领域研究进展作一简要综述。112 细胞在微载体表面的贴附和铺展组织工程种子细胞主要为贴壁依赖性细胞,该类细胞只有粘附在固体基质表面才能增殖,故细

胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。在传统的细胞培养中,影响细胞贴附和铺展的主要因素有两种:一是二价阳离子(DC) ;二是吸附糖蛋白(AGP) 。这两种因素在细胞和微载体的相互作用中扮演一种类似“桥”的角色,这是因为:在正常生理pH下,真核细胞表面带有不均匀的负电荷,而传统的培养基质(如塑料、玻璃) 表面也带有负电荷,在这样的相互作用模式下,细胞显然无法贴附到微载体上,但在这个系统中引入“桥”后,“负电荷- 桥- 负电荷”相互作用模式是可行的;另一类微载体表面带正电荷(如DEAE - 葡萄糖类微载体) ,于是有“正电核-负电荷”相互作用模式;实质上,这两类相互作用模式存在于每一个微载体,只是其中一种占优势而已。细胞和微载体相互作用的强弱不取决于电荷的极性,而是由电荷的密度决定的。细胞培养用的微载体应具有合适的电荷密度,因为电荷密度过低时,细胞吸附到微载体表面开始生长,然而它们又很快脱附,并聚集成团;电荷密度过高时,细胞吸附到微载体表面并铺展,然而却不生长。Maroudas 报道对biosilon 微载体而言, (20～100) ×103mel/ cm2 的负电荷对细胞铺展是最合适的。

113 细胞在微载体表面的生长

影响细胞在微载体表面生长的因素很多,可以分为细胞、微载体和环境三个方面。在细胞方面,如细胞群体、状态和类型;在微载体方面,如微载体表面状态、吸附的大分子和离子;在培养环境中,如培养基组成、温度、pH、DC 及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。

2 微载体大规模细胞培养的生物反应器系统

采用微载体技术进行种子细胞大规模培养,细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制,其中主要的限制性因素包括:种子细胞对剪切力的敏感性、氧的传递及传代和扩大培养等。而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素,为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。因此,应用生物反反应器大规模细胞培养的生物反应器系统,如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统及灌注式生物反应器系统等。

211 搅拌式生物反应器系统

生物反应器系统有利于微载体在培养液中均一分布并可精确控制换液频率。其中,最简单的生物反应器系统即为搅拌式生物反应器系统,该系统在旋转培养瓶的瓶底放置了磁力搅拌棒,通过磁力搅拌,使微载体在培养基内基本上达到均匀分布。搅拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史,但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力,从而限制了其应用范围。尽管如此,由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点,国内外仍有不少应用该系统进行组织工程种子细胞大规模扩增成功的研究报道。例如,Werner A(2000 年) 成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。

212 灌注式生物反应器系统

搅拌式生物反应器系统尽管存在很多优点,但机械搅拌会带来不需要的剪切力。为消除这种不利

因素,国外常采用灌注式生物反应器系统来进行微载体大规模细胞培养研究。灌注培养是目前细胞工程领域研究热点之一。它的特点是不断地加入新鲜培养基,以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基,使细胞在一个相对稳定的生长环境内增殖,既省时省力,又减少了细胞被污染的机会,且可以提高细胞密度10 倍以上。目前,采用灌注培养的细胞密度已达到100 ×106cells/ ml ,而人体细胞密度是(2～3) ×109 cells/ ml ,因而应用该系统进行微载体大规模扩增仍有巨大的开发潜力。以往灌注式生物反应器主要用于细胞工程领域的工程化细胞株的大规模培养。近年来,随着国内外组织工程研究的不断深入,已经有研究人员用该系统培养软骨细胞与支架材料的复合体。研究结果表明,软骨细胞与支架培养复合体在灌注培养系统内培养50 天,再造软骨的组织学和力学特征均与天然软骨相似。尽管目前应用该系统进行组织工程种子细胞的大规模扩增研究尚少,但随着研究的不断深入,该系统在组织工程种子细胞微载体扩增研究领域具有广阔应用前景。

213 旋转生物反应器

近年来,旋转生物反应器系统(RCCS) 已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养,又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体〔6〕。当将细胞种植到微载体上以后, 将其移入到RCCS 圆柱状的培养容器内,并加满培养液。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转。细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道,并随容器一起旋转且不与容器壁和它物相撞。由于系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器,使破坏性应力减到最小。在RCCS 中的细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出CO2 。因该系统能够提供破坏性

应力很低的细胞生存环境,因此,在近年来,已经广泛应用于微载体系统细胞大规模培养研究中,至今,近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增〔7〕。展望未来,今后微载体系统细胞大规模培养技发展的总方向是: (1) 研制细胞生长性能优良、吸附细胞容易并能重复使用的新型微载体; (2) 研制规模化生物反应器和剪切力小、混合性能好的新型细胞培养系统; (3) 设计新的适合于各个体细胞株(系)的无血清、无蛋白培养基; (4) 将生物力学和材料科学的相关成果移植于细胞工程领域,提高细胞大规模培养的仿生化、自动化和精巧化水平。

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尽管动物细胞的培养技术近10年已有飞速进展, 但正如欧洲动物细胞技术协会在一次国际会议上指出, 当今在动物细胞培养技术方面仍有三个重要问题要解决细胞的高密度培养低血清和无血清培基配方生物反应器的改进和提高效率。这些问题若不解决, 造成当前采用动物细胞生产技术产品的产量低、成本高、生产效率不及工程菌的主

要障碍就无法克服。许多工程细胞, 如CHO细胞、Vero细胞等都需贴壁才能更好地生长和分泌产品,因此要达到细胞高密度培养, 就必须增加单位体积内的比表面积, 微载体就是增加细胞贴壁面积的最好方法。因此选择和研制最适用的微载体是细胞高密度培养的关键之一。

一、细胞及培养

1．Marc145细胞

上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。

2．生长培养基

DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋

５％～10％新生牛血清+ 1％双抗（青霉素和链霉素）的培养液。

3．冻存液

生长培养基＋10％DMSO

4．细胞健康生长的几项注意事项

1）细胞没有支原体等外源因子的感染。

2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。

3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。

4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。

5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。

6）细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。

二、病毒感染、维持和收获

转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。

维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。

细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。

第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。

三、细胞病变（CPE）

细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图1是长成单层的marc 145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。

四、PRRS病毒在细胞中增殖规律（Virology Journal, 2006, 3: 90）

PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20－22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5％的细胞呈PRRSV阳性（PRRSV-positive）。第二阶段：感染后的2－3天（也称为病毒的对数感染期），病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出现了感染细胞群。

对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。BHK细胞(baby hamster kidney cell,BHK cell)，幼地鼠肾细胞，是1961年从5天生长1天的地鼠获得的转化细胞。1963年进行了单细胞克隆。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。但后来经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。BHK-21细胞来源：叙利亚仓鼠肾细胞形态：纤维原细胞生长特性：贴壁注释：这个细胞来自于一只出生一天的新生仓鼠，随后被改造成一个易于作表达的宿主细胞株。培养液：MEM（含2 mM L-谷氨酰胺和Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠）+ 10%胎牛血清

传代：吸去培养液。用0.25%（w/v）Trypsin-0.03 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶活性）。加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2到1：10为宜，每周传代1-2次）

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。