不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定_郭涛

Science of Sericulture

蚕业科学

收稿日期:2011-06-21接受日期:2011-07-20

资助项目:重庆市科技攻关计划项目(No.CSTC ,

2009AA1022)。作者简介:郭涛(1978-),男,山东,副教授,博士。

E-mail :guotaosd@swu.edu.cn

通信作者:申鸿,博士,副教授,硕士生导师。

E-mail :shenhong@swu.edu.cn 2011,37(6):1117-1122

ISSN 0257-4799;CN 32-1115/S E-mail :CYKE@chinajournal.net.cn

不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定

郭涛张龙王兵申鸿

(西南大学资源环境学院,重庆400716)

摘要虫草素和腺苷是蛹虫草的重要活性成分,通过高效液相色谱(HPLC )法测定不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺

苷含量,

筛选能生产高品质蛹虫草的培养基。测定结果表明,用不同培养基培育的蛹虫草子实体中,其虫草素和腺苷含量存在显著差异,总体表现为粳米+家蚕蛹浸提液培养基>糯米+家蚕蛹浸提液培养基>粳米培养基>糯米培养基,其中用粳米+家蚕蛹浸提液培养基培育蛹虫草子实体中的虫草素和腺苷质量比分别高达15.37mg /g 和39.96mg /g 。此外,相同培养基培育的蛹虫草子实体、菌丝体和培养基质中的虫草素与腺苷含量存在极显著差异,总体表现为子实体>菌丝体>基质。试验结果表明,粳米培养基中添加家蚕蛹浸提液可显著提高蛹虫草中的虫草素和腺苷含量。关键词

蛹虫草;培养基;家蚕蛹浸提液;虫草素;腺苷;高效液相色谱法

中图分类号

S886.9

文献标识码

B

文章编号0257-4799(2011)06-1117-06

Contents of Cordycepin and Adenosine in Cordyceps militaris Cul-tured on Different Culture Media

GUO Tao

ZHANG Long

WANG Bing

SHEN Hong *

(College of Resources and Environment ,Southwest University ,Chongqing 400716,China )Abstract

Cordycepin and adenosine are important active ingredients in Cordyceps militaris.In order to find culture me-

dium for producing high quality Cordyceps militaris ,high performance liquid chromatography (HPLC )was employed to measure the contents of cordycepin and adenosine in Cordyceps militaris cultured on different media.The results indica-ted that the contents of cordycepin and adenosine were significantly different in Cordyceps militaris fruit bodies growing on different media.Generally ,the contents were in the order of :culture medium with non-glutinous rice plus silkworm pu-pa extract >culture medium with sticky rice plus silkworm pupa extract >culture medium with non-glutinous rice >culture medium with sticky rice.The highest contents of cordycepin and adenosine were obtained from culture medium with non-glutinous rice plus silkworm pupa extract ,with mass ratio as high as 15.37mg /g and 39.96mg /g ,respectively.Fur-thermore ,the contents of cordycepin and adenosine in fruit body ,mycelium and culture medium from the same culture had extremely significant difference ,which was in the order of fruit body >mycelium >medium.These results indicate that the culture medium with non-glutinous rice plus silkworm pupa extract can significantly increase the contents of cordycepin and adenosine in Cordyceps militaris .Key words

Cordyceps militaris ;Culture medium ;Silkworm pupa extract ;Cordycepin ;Adenosine ;HPLC

蛹虫草(Cordyceps militaris )又名北冬虫夏草,为麦角菌科的虫草属真菌。野生蛹虫草主要寄生于针

叶林、阔叶林或混交林地表土层中的鳞翅目昆虫的蛹体上,也有发现寄生于鞘翅目和双翅目等昆虫的蛹、成虫或幼虫体上。近年来大规模人工培育蛹虫

草的技术得到了较快发展,

其产品的药效成分及药理作用与冬虫夏草极为相似,主要药效成分为虫草素和腺苷等,其中虫草素含量较冬虫夏草高数倍甚

至数十倍[1]

。蛹虫草中的虫草素和腺苷具有抗菌、

DOI:10.13441/https://www.360docs.net/doc/7b1037687.html,ki.cykx.2011.06.010

1118蚕业科学2011;37(6)

消炎、抗肿瘤、调节人体内分泌和增强免疫功能等显

著作用[2]。

我国是蚕茧生产大国,每年都会产生大量的蚕

桑副产物,如何有效、合理地变废为宝,是蚕桑学科

产研结合的一大课题。有报道用干蚕蛹培育蛹虫草

获得成功[3],并以家蚕蛹为寄主,进行家蚕蛹虫草

的人工栽培[4]。检测分析表明人工培育家蚕蛹虫

草的化学成分与冬虫夏草类似,且主要功效成分虫

草素高于冬虫夏草[5]。

培养基是影响微生物生长及代谢的重要因素之

一,不同培养基培育蛹虫草中的活性物质有较大差

别[6]。高效液相色谱(HPLC)法已广泛应用于食品

和药品质量监测,并有用HPLC法测定蛹虫草中虫

草素和腺苷含量,建立蛹虫草质量控制标准的报

道[7-10]。本项研究采用HPLC法,分别测定不同培

养基培育蛹虫草子实体、菌丝体以及培养基质中的

虫草素和腺苷含量,分析不同培养基对蛹虫草品质

的影响,以期优化蛹虫草培育条件,为生产实践提供

技术参考。

1材料与方法

1.1供试菌种

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.erFr.)Link,

YCC-XD-2],由西南大学资源环境学院微生物研究

室分离、保存。

1.2主要试剂和仪器

虫草素标样、腺苷标样均购自上海源叶生物科

技有限公司;四氢呋喃(色谱纯)购自Sigma-Aldrich

公司;甲醇(色谱纯)购自武汉思仪科技有限公司;

KH

2PO

4

、K

2

HPO

4

、NaCl均为分析纯,购自国药集团

药业股份有限公司;试验用水为自制双蒸水。Wa-ters高效液相色谱仪、Waters1525高压泵、Waters 2487紫外检测器、Part No.wato45905C

18

(4.6mm?150mm)色谱柱(Waters,USA);0.22μm水相微孔滤膜(Merck Millipore,USA)。

1.3培养基的制备及培养条件

1.3.1家蚕蛹浸提液制备称取干家蚕蛹100g,中火煮沸约30min,过滤,取滤液定容至1L,制得家蚕蛹浸提液。

1.3.2一级菌种培养基配制及培养方法配方:葡

萄糖20g,KH

2PO

4

3g,MgSO

4

1.5g,维生素B

2

10mg,蛋白胨3g,牛肉膏5g。配制完成后于121?下灭菌30min。将供试菌种接种于500mL 三角瓶液体培养基中,25?暗培养7 10d。待培养基中充满菌丝体,且清晰透明,即可作为蛹虫草培育用菌种。

1.3.34种蛹虫草培养基的配制糯米培养基(NM-MM):糯米30g,水42mL;碳氮比(C/N)为4.2。粳米培养基(JM-MM):粳米30g,水42mL;C/N 为3.6。糯米+家蚕蛹浸提液培养基(NM-EM):糯米30g,家蚕蛹浸提液15mL,水适量;C/N为2.9。粳米+家蚕蛹浸提液培养基(JM-EM):粳米30g,家蚕蛹浸提液15mL,水适量;C/N为2.8。上述4种培养基配制完成后,于121?下灭菌30min。

1.3.4菌种培养从一级菌种培养基上选取菌丝生长活力强,黄豆粒大小的蛹虫草菌种,转接至500 mL三角瓶,内含150mL液体培养基。置于25?恒温、避光环境下静置培养3d后,在130 140r/min 旋转式摇床上培养5d。

1.3.5菌丝培养4种蛹虫草培养基灭菌后在常温下冷却,分装于500mL广口瓶,接入成熟且无污染的液体菌种,每瓶接种3mL,每一种培养基设置5个平行处理。接种后于24?下恒温培养,相对湿度控制在65%,暗培养3d。菌丝萌发并恢复生长后,温度调低1 2?。

1.3.6出草调控待蛹虫草菌丝吃透培养基,即可进行出草培养。若培养基表面气生菌丝过多,可进行搔菌。参照文献[11]的方法,在蛹虫草子实体生长期的前3 5d补加约200lx光照刺激菌丝转色。保持约5?的昼夜温差(昼20 23?;夜15 18?),诱导蛹虫草子实体原基形成。蛹虫草子实体长至2 3cm,可在封口膜上刺几个孔,加大通风量,整个生育期间保持相对湿度在85% 90%之间。当蛹虫草子实体长至10cm左右开始采收。

1.4虫草素和腺苷含量的测定

1.4.1样品液的制备将培养于不同培养基上的蛹虫草,以子实体、菌丝体和营养基质随机取样,50?烘干,粉碎,过100目筛。精密称取0.1g样品粉末放入样品瓶中,加9g/L NaCl溶液10mL,摇匀,用微波中火处理2min,5000r/min离心5min,上清液经0.22μm水相微孔滤膜压滤,得到待测样品液。

第6期郭涛等:不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定1119

1.4.2标准品溶液的配制虫草素标准品溶液:精

密称取虫草素标样0.0100g,超纯水、超声波振荡溶解,定容成0.1g/L标准储备液,4?保存备用。腺苷标准品溶液:精密称取腺苷标样0.0200g,超纯水、超声波振荡溶解,定容成0.2g/L标准储备液,4?保存备用。

1.4.3色谱条件用于虫草素含量测定的色谱条件:色谱柱为Part No.wato45905C

18

(4.6mm?150mm),流动相为四氢呋喃-0.1%甲醇-硫酸盐缓冲液(体积比1?2?97)[12],流速1.0mL/min,检测波长259nm,柱温30?,进样量10μL。用于腺苷含量

测定的色谱条件:色谱柱为Part No.wato45905C

18(4.6mm?150mm),流动相为水-甲醇(体积比92?8)[6],流速1.0mL/min,检测波长259nm,柱温30?,进样量10μL。

1.5数据分析

数据收集与分析采用Empower PDA软件(Wa-ters公司);应用SAS统计软件对试验数据进行统计分析,用LSD检验样本平均数的差异显著性,显著水平设为5%。

2结果与分析

2.1不同培养基中的蛹虫草生长情况

不同培养基质上的蛹虫草菌丝生长情况如表1所示。试验数据表明,糯米培养基和粳米培养基培育蛹虫草之间、糯米+家蚕蛹浸提液培养基和粳米+家蚕蛹浸提液培养基培育蛹虫草之间,菌丝生长情况较一致。然而,4种培养基中,在含家蚕蛹浸提液的培养基上生长的蛹虫草菌丝,无论是生长速度、转色时间,还是采收期等明显较快。该结果与张显科等[12]的结论不太一致,分析其原因有二:其一,选用的蛹虫草菌种不同;其二,对蚕蛹的处理方法不同,本试验采用的家蚕蛹浸提液中含有的某些活性物质,能够诱导或促进蛹虫草菌丝生长和子实体形成,并有效地缩短蛹虫草的生长周期。

表1蛹虫草在不同培养基上的生长情况

Table1Growth data of Cordyceps militaris on different culture media

培养基Culture medium 菌丝布满培养基的时间/d

Time for mycelia to

cover all the medium

菌丝转色时间/d

Time for mycelia to

change color

子实体成熟的时间/d

Time for fruit

bodies to mature

糯米培养基

Culture medium with sticky rice

8 10540 50

粳米培养基

Culture medium with non-glutinous rice

8 10540 50

糯米+家蚕蛹浸提液培养基

Culture medium with sticky rice plus silkworm pupa extract

7 8335 40

粳米+家蚕蛹浸提液培养基

Culture medium with non-glutinous rice plus silkworm pupa extract

7 8335 40

2.2虫草素和腺苷含量检测的标准曲线绘制配制质量浓度为 3.75、7.5、15、30、60μg/mL的腺苷标准溶液和质量浓度为6.25、12.5、25、50、100μg/mL的虫草素标准溶液,分别进行高效液相色谱分析,在选定的色谱条件下腺苷和虫草素分离效果好,其出峰时间如图1 2所示。以标准品溶液质量浓度为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)作图,进行回归分析,得回归方程为:Y(腺苷)=17219X-16424(R= 0.999);Y(虫草素)=30915X+32648(R= 0.998)

图1腺苷标准品的高效液相色谱图Fig.1HPLC chromatogram of the standard adenosine

1120蚕业科学2011;37(6

图2虫草素标准品的高效液相色谱图

Fig.2HPLC chromatogram of the standard cordycepin

2.3不同培养基培育蛹虫草中的虫草素含量比较在选定的色谱条件下,以标准品的保留时间定性,外标法定量,虫草素提取液样品的出峰时间见图3。按回归方程Y(虫草素)=30915X+32648计算样品液中虫草素的含量(表2)。不同培养基上生长蛹虫草中的虫草素含量差异显著,以子实体中的虫草素含量为例:粳米+家蚕蛹浸提液培养基>糯米+家蚕蛹浸提液培养基>粳米培养基>糯米培养基。用粳米+家蚕蛹浸提液培养基培育的蛹虫草子实体、菌丝体中的虫草素含量,较糯米培养基培育的分别提高4倍和5倍左右。该结果与Huang 等[6]、温鲁等[14]的研究结果基本一致

图3蛹虫草子实体提取虫草素样品的高效液相色谱图

Fig.3HPLC chromatogram of the cordycepin sample extracted from fruit body of Cordyceps militaris

第6期郭涛等:不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定1121

表2不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量比较

Table2A comparison on contents of cordycepin and adenosine under the different media in Cordyceps militaris

(mg·g-1)

培养基Culture medium

虫草素Cordycepin腺苷Adenosine

子实体

Fruit body

菌丝体

Mycelium

基质

Medium

子实体

Fruit body

菌丝体

Mycelium

基质

Medium

糯米培养基Culture medium with sticky rice2.977cA0.743dB0.500cB20.060cA8.553cB4.400dC

粳米培养基Culture medium with non-glutinous rice3.870cA2.108cB2.187abB27.210bA15.760bB9.859cC

糯米+家蚕蛹浸提液培养基

Culture medium with sticky rice plus silkworm pupa extract6.453

bA3.730bB2.505aB35.680abA17.180bB13.260bC

粳米+家蚕蛹浸提液培养基

Culture medium with non-glutinous rice plus silkworm pupa extract15.377

aA4.608aB1.802bC39.967aA20.650aB16.160aB 表中同列数据后,不同小写字母表示差异达显著水平(P=0.05),不同大写字母表示差异达极显著水平(P=0.01)。

Different small letters following the data in the same column represent difference at significant level(P=0.05)and different capital letters represent difference at extremely significant level(P=0.01).

此外,用不同培养基培育的蛹虫草,其不同取样部位的虫草素含量总体表现为子实体>菌丝体>基质。粳米+家蚕蛹浸提液培养基培育蛹虫草不同取样部位表现出的差异最为明显,子实体中的虫草素含量是菌丝体和基质的3.3倍和8.5倍左右;其余3种培养基培育蛹虫草的菌丝体和基质中的虫草素含量差异并不显著。产生上述结果的原因尚有待进一步研究分析。

以粳米+家蚕蛹浸提液培育蛹虫草子实体中的虫草素含量最高,达到15.377mg/g。该数据显著高于李祥玲等[8]测定的人工蛹虫草中的虫草素含量(质量比为1.089mg/g),也高于Huang等[6]测定大米、蚕蛹、小麦培养基培育蛹虫草子实体中的虫草素含量[质量比分别为(3.412?0.01)、(1.848?0.01)、(2.720?0.03)mg/g]。分析认为,蛹虫草菌株能显著影响蛹虫草的虫草素含量,同时不同培养基质也能显著影响蛹虫草菌株的生长及代谢,因而使不同培养基中生长的蛹虫草中的活性物质有较大差别[6],并且培养基中不同的添加物对虫草素的合成也有影响[13]。

2.4不同培养基培育蛹虫草中的腺苷含量比较在选定的色谱条件下,以标准品的保留时间定性,外标法定量,腺苷提取液样品的出峰时间见图4。按回归方程Y(腺苷)=17219X-16424计算样品液中的腺苷含量(表2)。不同培养基上生长蛹虫草中的腺苷含量同样呈现显著差异,以子实体中的腺苷含量为例:粳米+家蚕蛹浸提液培养基>糯米+家蚕蛹浸提液培养基>粳米培养基>糯米培养基。其中,粳米+家蚕蛹浸提液培养基培育,蛹虫草子实体、菌丝体中的腺苷含量,较糯米培养基培育的分别提高近1倍和1.5倍,也显著高于李祥玲等[8]测定人工蛹虫草中的腺苷含量(质量比为2.350 mg/g)。该结果同样表明,不同培养基配方对蛹虫草中的腺苷含量有显著影响。

此外,不同培养基培育的蛹虫草,其不同取样部位腺苷含量均表现为子实体>菌丝体>基质,且差异显著。以粳米+家蚕蛹浸提液培养基处理为例,子实体中的腺苷质量比达到39.967mg/g,分别是菌丝体和基质的1.9倍和2.5倍左右

图4蛹虫草子实体提取腺苷样品的高效液相色谱图

Fig.4HPLC chromatogram of the adenosine sample

extracted from fruit body of Cordyceps militaris

1122蚕业科学2011;37(6)

3小结

本试验结果表明在不同培养基上生长的蛹虫草中的虫草素和腺苷含量不同,2种活性物质的含量为:粳米+家蚕蛹浸提液培养基>糯米+家蚕蛹浸提液培养基>粳米培养基>糯米培养基。以粳米+家蚕蛹浸提液培养的家蚕蛹虫草子实体中虫草素和腺苷最高,质量比分别达到15.377mg/g和39.967 mg/g,表明不同培养基配方对家蚕蛹虫草中的虫草素和腺苷含量有显著影响。不同培养基上生长的蛹虫草,其不同取样部位的虫草素和腺苷含量总体表现为子实体>菌丝体>基质。此外,蛹虫草在含有家蚕蛹浸提液的2种培养基上的生长速度也优于另外2种大米培养基。依据试验结果认为,在大米尤其是粳米培养基中添加家蚕蛹浸提液,有利于提高蛹虫草的药用品质。

HPLC法测定样品中的虫草素和腺苷含量,目标色谱峰分离效果较好,结果稳定可靠。虫草素和腺苷的水提液在室温下能稳定保存6h,10 12h后虫草素和腺苷发生变化,可能会产生新的物质,干扰目标峰[15],因此应尽快对样品进行测定。

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櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗

72-73

·稿件规范化与标准化·

统计学符号书写规则

统计学符号一般用斜体。本刊常用统计学符号:样本的算术平均数用英文小写珋

x,不用大写X,也不用Mean;标准差用英文小写s,不用SD;标准误用英文小写s珋

x,不用SE;t检验用英文小写t;F检验用英文大写F;卡方检验用希文小写χ2;相关系数用英文小写r;样本数用英文小写n;概率用英文大写P;自由度用英文小写v。

正体与斜体使用规则

物种的学名属名、种名(包括亚种、变种)用拉丁文斜体,首字母大写,其余小写;属以上用拉丁文正体,首字母大写。

限制性内切酶前3个字母用斜体,后面的字母和编码正体平排,例如:Bam HⅠ、Eco RⅠ、MspⅠ、Sau3AⅠ等。

氨基酸和碱基的缩写氨基酸缩写用3个字母表示时,仅第一个字母大写,其余小写,正体。碱基缩写为大写正体。

基因及表型产物的符号表示基因座名的英文缩写用斜体,一般为小写字母,如:sch。基因位点用正体大写,突变或等位基因的符号或数字用正体,如:大肠杆菌aro G基因、突变基因argSΔr245。基因表型产物符号用正体。蛋白质名称的英文缩写用正体,首写字母大写或全部大写。

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