口服乳酸菌对尘螨致敏小鼠脾细胞的免疫调节作用

乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一类发酵碳水化合物主要产乳酸的细菌的统称，广泛分布于自然界中，是人类肠道中的共生菌。其具有多种生物效应，且还有很强的免疫调节作用。这种免疫调节作用有明显的菌株依赖性，一方面，很多乳酸菌菌株有很强的佐剂功能，作用于先天性免疫防御系统，诱导释放IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ等前炎因子，增强巨噬细胞、NK细胞等的非特异免疫应答的作用[1-3]。另一方面，与这些免疫增强作用相反的是它们具有的免疫抑制活性[4-6]。如一些菌株可以下调IL-4、IL-5水平，减少抗原诱导的IgE生成，抑制淋巴细胞的增殖以及合成释放抑制性细胞因子IL-10等。

最近发现口服变应原疫苗亦可达到满意的抗过

·论著·[文章编号]1000-8861（2011）03-0193-06

李理，蔡琳，于宝丹，徐军*

[摘要]目的探讨口服乳酸菌对尘螨致变应性气道炎症小鼠脾细胞免疫调节功能的影响。方法雌性C57BL/6小鼠分为对照组（N组），尘螨组（M组），尘螨+乳酸乳球菌组（L组）和尘螨+植物乳杆菌组（P组）。脾细胞分离培养，检测培养上清IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-10水平（ELISA法），脾细胞增殖情况（Brd U法），流式细胞术检测分泌IL-4/IFN-γ的CD3+CD4+细胞比例。结果在基础状态下，L组和P组脾细胞合成释放IL-4、IL-5及IFN-γ水平均明显低于M组，同时IL-10生成显著增加（P<0.05），以L组更明显。螨刺激下，L组脾细胞IL-4、IL-5的释放率要明显低于M组（P<0.05），IL-10的释放率则明显高于其余3组（P< 0.05）；细胞增殖试验示L组与P组细胞Brd U掺入量明显低于M组（P<0.001），与N组无差异；流式细胞术显示L组和P组，分泌IL-4的CD4+细胞减少的同时(23.1%&23.7%)，总CD4+细胞比例反而增高(51.6%&43.9%)，以L组为明显。结论口服乳酸菌诱导了小鼠脾细胞CD4+调节性T细胞亚群的增殖，主要通过释放IL-10下调Th1/Th2细胞因子水平，进而抑制了尘螨致变应性气道炎症。

[关键词]乳酸菌；尘螨；哮喘；脾细胞

[中图分类号]R503[文献标识码]A

Immunomodulatory effects of lactobacillus on splenocytes of dust mite-sensi－tized murine model

LI Li,CAI Lin,YU Baodan,XU Jun

Department of Respiratory Diseases,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510100,China

[Abstract]Lactic acid bacteria(LAB)are considered to be safe bacteria with a GRAS(generally regarded as safe)status and have difference kinds of immunoregulation effects.The present study is performed to investigate the immunoregulation effects of two kinds of LAB,Lactococcus lactis and Lactobacillus plantarum,on splenocytes of dust mite-sensitized mice.C57BL/6female mice,6-8weeks old,were randomly divided into4groups with10 mice in each.Mice in groups M,L and P,except for group N(saline control),were sensitized and challenged with mite extract.Mice in groups L and P were simultaneously fed with Lactococcus lactis and Lactobacillus,respec－tively.Then,the splenocytes isolated from the mice were subjected to the detection of the cells proliferation by BrdU incorporation in response to the mite https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ing ELISA,the levels of IL-4,IL-5,IFN-γand IL-10in the supernatant of the splenocytes were measured.We found that BrdU incorporation and the levels of IL-4and IL-5in the supernatant of the cells were lower markedly in group L than those in group M.Meanwhile,the analy－sis of flow cytometry revealed that the number of CD4+T cell secreting IL-10was increased significantly in group L.In conclusion,oral administration of Lactococcus lactis could induce an immune tolerance in splenocytes in re－sponse to mite by promoting CD4+T cell proliferation and IL-10expression.

[Key words]Lactic acid bacteria;Dust mite;Asthma;Splenocyte

基金项目：广东省自然科学基金项目(034649)

作者单位：510010，广州军区广州总医院呼吸内科（李理）；510520

广州，广东食品药品职业学院（蔡琳）；510020，广州医学院第一附属

医院广州呼吸疾病研究所（于宝丹，徐军）

*通信作者：徐军，Tel:020-********，E-mail:xufeili@https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,

敏效果，且副作用少。乳酸菌被人们公认为安全的细菌（GRAS），是理想的口服疫苗载体的最佳候选者。由于乳酸菌菌株间免疫学上的差异，以及不同菌株的生长特性、黏膜定植能力不同，因此研究乳酸菌具体菌株的免疫学特性，根据具体的疫苗的需要，选择一种具有较好协同作用的，能够诱导免疫应答或免疫耐受的载体乳酸菌是成功构建乳酸菌疫苗的关键环节。本研究通过给予尘螨致敏的小鼠模型乳酸菌灌胃，比较口服乳酸乳球菌及植物乳杆菌对尘螨致敏小鼠脾细胞的免疫调节作用，为下一步选择构建乳酸菌疫苗载体奠定基础。

1材料与方法

1.1试剂2%、4%尘螨粗提液（购自广州医学院附二院），植物乳杆菌（购自北京中科院微生物研究所），乳酸乳球菌(LM0230)（北京中科院微生物研究所还连栋老师惠赠），小鼠IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γELISA试剂盒（奥地利Bender Medsystem公司），RP－MI1640培养基（美国Gibco公司）。氢氧化铝干粉、蛋白转运抑制剂莫能霉素Monensin、刺激剂佛波酯PMA、刺激剂离子霉素Ionomycin（美国Sigma公司），intraPrep Permeabilization Reagent、mAb CD4-FITC/mAb Rat IgG2b-FITC（美国Beckman Coulter 公司）、Mouse CD3TRI-color conjugate、anti-Mouse IFN-gamma-RPE/Rat IgG1-RPE、anti-Mouse IL-4-RPE/Rat IgG1-RPE（美国Caltag公司）。

1.2实验动物和分组健康雌性C57BL/6小鼠40只，6～8周，体质量18~22g/只，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。随机分为4组：对照组（N组），尘螨组（M组），尘螨+乳酸乳球菌组（L 组）和尘螨+植物乳杆菌组（P组）。

1.3尘螨致敏激发小鼠动物模型建立及处理致敏激发：M组、L组、P组于第0、7、14天用含2%尘螨与凝胶1mg的混合溶液共100μl腹腔注射致敏；第21、22、23、24天以1%戊巴比妥麻醉后，4%尘螨50μl 滴鼻激发。N组用等体积0.9%生理盐水腹腔注射及滴鼻作为对照。乳酸菌处理：L组和P组每次致敏和开始激发日起连续5d分别给予109菌落形成单位(colony-forming units,CFU)灌胃；M组和N组每次致敏日起连续5d给予0.9%生理盐水100μl灌胃。于实验流程第27天即末次滴鼻激发后的第3天取材检测。

1.4肺组织病理检查小鼠摘眼球放血后，予颈椎脱臼处死，取肺组织置于10％中性甲醛固定液中固定24h以上。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色。1.5脾细胞分离、培养无菌条件下，以实验组为单位收集小鼠脾脏，在超净台内进行脾细胞的分离。小心去除脾脏外的包膜结缔、脂肪组织，用注射针芯碾磨脾脏使得脾细胞成悬液，先后滤过100目的铜网及300目的尼龙滤膜，离心1500r/min×5min，弃去上清，加入2ml红细胞裂解液，使得红细胞充分裂解，2～3min后加入RPMI1640中止反应。离心、弃去上清后RPMI1640洗涤离心细胞2次，参数同前。台盼蓝拒染试验进行脾细胞活力测定及细胞计数，活细胞数应在90％以上。

1.6脾细胞培养上清IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10水平检测将分离的脾细胞以每孔2×106/ml接种于24孔板，每个实验组均在加和不加尘螨刺激（20μg/ ml）的条件下培养72h（37℃、5％CO2），收集培养上清，浓缩5倍后ELISA法检测细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10水平。

1.7流式细胞术检测CD3+CD4+-IL-4/IFN-γ脾细胞用流式细胞分析技术在单个细胞水平上对各组脾细胞的细胞免疫状况进行检测(BECKMAN COULTER流式细胞仪)。主要检测Tc标记的CD3+T细胞、FITC标记的CD4+T细胞以及PE标记的细胞因子（IFN-γ或IL-4）的荧光强度。每管样品检测10000个细胞。每次检测阳性细胞百分率之前先以相应同型抗体染色细胞作阴性对照（Isotype）。以Tc标记的CD3+T细胞设门，采集的三色荧光标记二维点阵图，检测CD3+ CD4+、CD3+CD4-细胞及其分泌IL-4/IFN-γ细胞的比例。

1.8脾细胞增殖试验（Brd U法）脾细胞分离培养，以每孔5×104cell/100μl种96孔板（含尘螨20μg/ml），37℃，5％CO2，90％相对湿度培养48h，加入Brd U工作液（详细按说明书操作），OD

450nm

测定吸光度，检测脾细胞的增殖情况。

1.9统计学方法实验数据采用SPSS10.0软件进行统计分析，各组数据以均数+标准差表示，进行单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用LSD 法；P<0.05表示差异有显著性。

2结果

2.1小鼠肺组织病理改变N组小鼠支气管、小支气管、伴行小动脉及肺泡结构清晰，气道纤毛上皮排列整齐，气管/血管周围无明显炎性细胞的浸润、无充血水肿；与之相比较，M组小鼠支气管、细支气管上皮下和小血管周围可见明显炎性细胞浸润，以Eos 浸润为主，气道上皮结构紊乱，部分脱落，管腔内渗出增加，上皮下充血水肿明显，肺泡间质增厚，亦可见炎性细胞浸润。L组和P组肺部炎症改变较M组

N)control group;M)mite group;L)mite plus https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ctis ;P)mite plus L.plantarum .

图1各组小鼠肺病理切片HE 染色(×200)

Fig 1Pathologic findings of lung tissue by hematoxylin and

eosin stain (×

200)

有所减轻，以L 组更明显，镜下可见支气管、细支气

管和伴行小血管周围炎症细胞浸润程度减轻，

Eos 浸润减少，充血水肿状况改善，气道上皮结构趋于正常（图1）。

2.2脾细胞体外培养上清细胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ浓度测定见表1～表3。

2.3脾细胞三色荧光标记流式检测本实验采用新鲜分离的小鼠脾细胞体外培养，用PMA 和离子霉素短暂激活后，以Tc-CD3设门，进行CD4+IL4/CD4+IFN-γ的检测。表达CD4+细胞百分比为N(39.9%),M

(42.2%),L(51.6%),P(43.9%)；

表达IL-4+CD4+的细胞在4组中分别是N(21.2%),M(26.5%),L(23.1%),P (23.7%)，表达IFN-γ+CD4+的细胞在4组中分别是N (0.6%),M(1.9%),L(0.7%),P(0.7%)。对比IL-4+CD4细胞百分比可发现，N 组的CD4水平最低，M 组有所升高，与脾细胞培养上清IL-4水平变化一致；而在L 组和P 组，分泌IL-4的CD4+细胞减少的时候，

总的CD4+细胞比例反而增高，

以L 组为明显（图2、图3）。

2.4脾细胞增殖实验（Brd U 法）在基础状态（无尘

螨刺激）下，各组间细胞增殖水平相当，

Brd U 掺入量无明显差异(P >0.05)；尘螨刺激后，M 组细胞增殖明显，Brd U 掺入量明显高于其他各组（P <0.001），而N 组，L 组和P 组3组间Brd U 的掺入量无明显差异(P >0.05)，见表4。

表1免疫小鼠脾细胞体外培养上清IL-4、IL-5浓度测定

Tab 1The level of IL-4and IL-5in the supernatant of splenocytes

表2免疫小鼠脾细胞体外培养上清IFN-γ、IL-10浓度测定

Tab 2The level of IFN-γand IL-10in the supernatant of splenocytes

表3免疫小鼠脾细胞培养上清IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-10释放率

Tab 3The release rate of IL-4,IL-5,IFN-γ,and IL-10in the supernatant of splenocytes

M 53.9±7.969.9±6.2434.3±70.6541.8±46.5a L 40.6±8.5bd 46.0±8.0bd 342.2±51.4ac 367.6±41.7bd P

45.3±5.0c

53.3±5.7ad

349.4±64.4c

399.9±43.5bd

N 15.1±9.062.1±8.5414.7±69.0476.7±70.0c Group

IL-4(pg ·ml -1)

IL-5(pg ·ml -1)

groundstate mite stimulation groundstate mite stimulation M 416.2±46.7446.2±58.2277.8±8.2293.0±23.0L 318.1±47.3bd 336.1±44.8bd 301.7±27.1bc 370.5±70.2bd P

333.3±46.2ad

352.4±36.5bd

294.1±21.0a

330.8±32.0a

N 404.8±58.2427.5±50.0269.0±8.7278.4±20.1Group IFN-γ(pg ·ml -1)

IL-10(pg ·ml -1)

groundstate mite stimulation groundstate mite stimulation Group IL-4(%)IL-5(%)IFN-γ(%)IL-10(%)N 0.20±0.100.15±0.05c 0.06±0.040.03±0.04M 0.31±0.09a 0.26±0.12a 0.07±0.030.05±0.05L 0.14±0.08d 0.08±0.06d 0.06±0.050.22±0.13bd P

0.18±0.09c

0.16±0.13

0.06±0.05

0.12±0.05e

a)P <0.05,vs group N;b)P <0.01,vs group N;c)P <0.05,vs group M;d)P <0.01,vs group M.

a)P <0.05,vs group N;b)P <0.01vs group N;c)P <0.05,vs group M;d)P <0.01,vs group M;e)P <0.05,vs group L.

[F1][A]Ns.lmd:PMT2Log/PMT3Log ·ADC

[F1][A]M.lmd:PMT2Log/PMT3Log ·ADC

I L -4P E

[F1][A]L.lmd:PMT2Log/PMT3Log ·ADC

I L -4P E

[F1][A]P.lmd:PMT2Log/PMT3Log ·ADC

I L -4P E

CD4FITC

I L -4P E

N ）control group;M ）mite group;L ）mite plus https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ctis ;P ）mite plus L.plantarum .CD4-FITC/IL-4-PE was detected,with CD3-Tc as gate.

图2三色荧光标记流式检测口服不同乳酸菌对尘螨致敏小鼠脾细胞内表达IL-4的影响（以CD3-Tc 设门采集，检测CD4-FITC/

IL-4-PE ）Fig 2The expression of IL-4/CD3+CD4+

on mice splenocytes examined by flow cytometry

3讨论

变应性哮喘是一类由Th2细胞驱导的气道变态反应性炎症。遗传易感性因素在Th2的免疫偏移中起了重要作用。变应原一旦导致了Th2亚群的功能优势，这种倾斜往往会持续发展下去。各种Th2细胞因子在哮喘各种气道病理改变中起着广泛而复杂影

响，相互之间也构成相互调节的复杂网络。

其中，IL-4、IL-5释放增多是抗原激发导致哮喘特征性气道变态反应性炎症的基础，在过敏性哮喘发病机制中起重要作用。

近年研究发现，乳酸菌（LAB ）有很强的免疫调节功能。LAB 对机体免疫的调节是菌株依赖型的，不同LAB 诱导肠粘膜细胞生成不同的因子，对Th1/Th2平

衡可产生不同的影响。Foster 等报道，干酪乳杆菌（L.casei ）菌株预先灌胃可降低OVA 致敏、激发小鼠的脾细胞在体外OVA 刺激下IL-4的释放水平；喂了酪蛋白的DBA/2小鼠，给予L.plantarum 可抑制酪蛋白特异性IgE 水平，增加腹腔巨噬细胞产生IL-12的水平，同时抑制ConA 刺激下脾细胞产生IL-4的能力[7]。L.paracasei 能使小鼠脾细胞生成的IFN-γ、IL-4和IL-5减少，同时伴有IL-10生成的增加，以及CD4+T 细胞的低增殖[8]。乳酸菌诱导免疫应答的不同可能是其细胞壁组分或胞浆抗原等成分存在差异，从而导致激活的免疫调节信号的差别有关。

本部分实验比较了LAB 属两种菌型：乳酸乳球菌（工程菌LM0230）和植物乳杆菌（野生型）对尘螨

[F1][A]ifn-1.LMD:PMT2Log/PMT3Log ·ADC

[F1][A AND C]M.lmd:PMT2Log/PMT3Log

·ADC CD4FITC

CD4FITC

I F N -γ-P E

[F1][A AND C]L.lmd:PMT2Log/PMT3Log ·ADC

[F1][A]M.lmd:PMT2Log/PMT3Log ·ADC

I F N -γ-P E

N ）control group;M ）mite group;L ）mite plus https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ctis;P ）mite plus L.plantarum.CD4-FITC/IFN-γ-PE was detected,with CD3-Tc as gate.

图3三色荧光标记流式检测口服不同乳酸菌对尘螨致敏小鼠脾细胞内表达IFN-γ的影响（以CD3-Tc 设门采集，检测CD4-FITC/IFN-γ-PE ）

Fig 3The expression of IFN-γ/CD3+CD4+

on mice splenocytes examined by flow cytometry

表4免疫小鼠脾细胞BrdU 增殖实验

Tab 4BrdU test for the proliferation of splenocytes (A 450nm )

Group groundstate mite stimulated N 4.05×10－2±1.32×10-2 5.07×10－2±9.18×10-3a M 5.47×10－2±1.31×10-37.75×10－2±1.51×10-2L 4.68×10－2±1.16×10-2 5.07×10－2±9.91×10-3a P

4.72×10－2±1.98×10-2

5.20×10－2±5.59×10-3a

a)P <0.01,vs group M.

变应原诱导的小鼠变应性气道炎症的免疫调节作

用。肺部组织病理学检查可见口服乳酸菌组（L 组和P 组）小气道和小血管周围的嗜酸性粒细胞浸润减轻，气道上皮脱落和管腔内渗出均减少，以L 组更明显。同时，口服乳酸菌组脾细胞分泌Th2细胞因子IL-4、IL-5也明显地减少。我们发现口服https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ctis 比L.plantarum 有更明显的下调IL-4、IL-5的作用。IL-4、IL-5是参与变应性气道炎症性疾病，如哮喘发病

的关键性细胞因子。IL-4主要与B 细胞生成IgE 抗体有关。IL-5则与Eos 的气道浸润密切相关[9-10]。口

服乳酸菌使脾细胞培养上清中IL-4、

IL-5降低，同时相应减少了Eos 向气道募集，减轻了气道炎症。乳酸乳球菌（L 组）与植物乳杆菌（P 组）相比较，乳酸乳球菌对尘螨变应原所致的气道变应性炎症有更强的抑制作用。与此同时，基础状态下，喂服乳酸菌组（L 组和P 组）脾细胞分泌IL-10的水平均有不同程度

的增高；尘螨刺激后，L 组的IL-10释放率明显高于其余三组（P <0.05）。我们的研究表明口服乳酸乳球

菌和植物乳杆菌可以不同程度地诱导免疫小鼠脾细胞生成IL-10，这与先前已有的报道相同[8-11]。尘螨刺激后，L 组IL-10的释放率不仅明显高于M 组（P ＝0.001），而且高于P 组（P ＝0.04），说明L 组在尘螨的刺激下比P 组释放更多的IL-10。这些结果提示尘螨致敏激发同时喂食乳酸菌使IL-10生成增加，可

能抑制了尘螨致敏小鼠脾细胞分泌IL-4、IL-5的能力，减缓了脾细胞的增殖，从而显著减轻了气道EOS 炎症，提示口服乳酸菌，特别是乳球菌诱导了尘螨致敏小鼠产生了免疫耐受。

我们用流式细胞术检测脾细胞内细胞因子，结果显示L组分泌IL-4的CD4+细胞较M组减少。分泌IL-4的CD4+细胞在N组是21.2％，尘螨刺激后上升到26.5％（M组），L组和P组均较M组为低，分别为23.1％和23.7％。有趣的是，虽然L组和P组分泌IL-4的CD4+细胞减少，但总的CD4+细胞数却较N组和M 组有较大幅度的升高，而且以L组最高（51.9％）。结合对四组细胞因子水平变化的分析，我们推测是口服乳酸菌组分泌IL-10的调节性T细胞（Treg）增加的结果。很多事实表明调节性T细胞的主动抑制是体内自身或外源性抗原产生外周耐受的基础[12-14]。

关于L.plantarum与https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ctis口服对变态反应性疾病的影响，既往文献报道结果各异[15-16]。Repa的研究显示口服一定累积剂量的L.plantarum可诱导肠道免疫细胞发生以分泌IL-4为主导的免疫应答反应，高累积剂量可导致耐受。高剂量L.plantarum诱导的Th2免疫应答耐受必然相对增强了Th1免疫应答，至于是否这种相对增强的Th1反应能够抑制Th2为特点的免疫炎症则有赖于不同的高剂量和细菌本身的活力状态；而https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ctis并不引起肠道Th2免疫活化[15]。Perdigon的研究则认为二者对变态反应性疾病均无影响[16]。LAB对机体的调节作用具有剂量依赖性，且不同菌株的有效剂量亦不同，不同菌株同一剂量，或同一菌株不同剂量、不同的时间点引起的机体的免疫应答均不同[15]，这可能是研究者为什么得出不同结论的主要原因。我们实验采用的为每七天中连喂5d(109CFU/d)，观察到https://www.360docs.net/doc/7a2719961.html,ctis通过生成IL-10，降低Th1、Th2型反应，有效下调尘螨变应性气道炎症。我们的实验首次发现作为食品工业用的工程菌－乳酸乳球菌LM0230有较强的诱导免疫耐受的作用，较之L.plantarum更适于用作治疗变态反应性炎症的重组变应原疫苗载体。这一研究发现为我们下一步尘螨乳酸菌疫苗构建的研究奠定一定的基础。

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1108-1114.

（收稿日期：2010-11-10；修回日期：2011-01-11）

（编辑侯瑞）