AriaII操作手册-分选20160402

FACSAri aⅡ流式细胞仪

一、开机准备

（一）准备液路

1.将流式细胞仪的上盖打开；

2.开启计算机，等待所有程序载入。

3.开主机电源Mainpower（右图），从电脑桌面上双

击打开FACSDiva软件，输入密码BDIS。打开激

光开关laser power（根据实验需要进行选择）；

开启实验所需激光器电源。

4.确认液流车中各种液体的液面水平（鞘液、废液、

去离子水、漂白剂、乙醇），倒空废液或加满其

他液体（下图）。

5.从软件的Cytometer菜单上选择Fluidic Startup(射流启动)，点击OK确认。

将出现如下窗口：

6．将液路和气路管道从酒精桶断开，连接到鞘液桶；完成后点Done；

7．将Closed-loop 喷嘴（闭环喷嘴）插入流

动室；完成后点Done；会出现右侧窗口，提

示液流开启进行中；

8．达到100%，移去Closed-loop喷嘴，完成

后点Done；

9．按照实验要求，插入直径合适的喷嘴（喷嘴直径应该是分选颗粒直径的3-6倍）；

10．然后点OK，完成整个过程；

11．从菜单上选择Sort(分类)>sort setup,确认setup模式与喷嘴大小匹配。

（二）开液流

1．打开液流窗口的液流；

?点击软件界面上（如下图）的按钮

打开分选液流窗口（如下图）

?点击分选液流窗口的按钮(stream 的前面按钮)，开启液流

2．打开分选仓前的门，检查液流。液流应为一条细线落入废液槽正中(可通过调整红色标志的键)；

（如果液流不稳，检查流动室中是否有气泡，将液流关闭，10秒钟

后再开，排除气泡。）

3．关上分选仓前的门。

（三）设定液流断点

1.调整液流震幅（Ampl），使断滴位于窗口上方1/3处。

（Ampl不要超过70，如果超过，检查流动室是否

有气泡；确认鞘液压力和震动频率是否合适）；

2.确认卫星液滴与大液滴融合，应该在断滴的6滴之

内融合（红色箭头数起，左图的左侧合格，右侧

不合格），如果没有融合，重新安装喷嘴。

二、建立实验模板

1.在软件界面左侧Browser面板下，依次点击New Folder、Experiment、Specimen （均可重命名），单击Specimen左侧“+”符号，显示下方的Tube，点击左侧灰色指示箭头，使之变成绿色（当前指示）。

2. 在软件（）Cytometer面板上，点击Parameters选项卡，选择实验

所需荧光通道（按Ctrl键可多选），并删除多余通道。选择荧光素名称、信号放大类型（log/lin）、信号脉冲类型（H/A/W），

3. 在()右侧worksheet页面中，画出实验所需模板(斜箭头)：首先画出点图（双参数：FSC-A和SSC-A），根据阴性对照（未染色的细胞）圈出细胞群P1；其次画出点图（双参数：荧光名称），利用鼠标右键Show Populations选项，选择P1，建立图之间的联系(如下图)。

4.至此，一个简单的实验模板基本建成。现在可以将样本管放在上样台上，点击上样面板的load，此时Acquire Data自动被激活或手动点击采集控制面板上的Acqire data按钮，仪器开始获取样本数据。

5.根据实验情况调整Cytometer面板中各通道电压，使FSC/SSC中信号位于利于观察的位置（细胞群落在中央位置）。调整阈值（Threshold），去除碎片和噪音信号。调整上样速度（Flow Rate）（最大为10）。

6.在FSC/SSC中调整门的位置、大小和形状，使之圈住感兴趣细胞群。调节荧光通道的电压，使荧光信号位于合适的位置。

7.在鼠标右键中打开数据显示，观察实验的实时结果。

8.实验条件调整完毕后，在上样面板中设置Events To Record等参数，点击Record Data，开始保存数据。

（三）液流关机

预备关机

1．关激激光电源；

2．从上样架上移去上样管；

3．关闭液流(stream 的前面按钮)；

4．倒空废液桶；

5．加满酒精桶

关机

1．从菜单上选择Cytometer>fluidics shutdown（关闭），会弹出下面窗口

2．从流动室上移去喷嘴；完成后点Done。

3．插入Closed-loop喷嘴，完成后点Done。

4．将鞘液桶的液流管和气管分别连接到酒精桶上，点Done。

5．按照提示，放上一管3ml 清洗液，完成后点Done ； 6．清洗完成后，按提示，点OK 。 7．关闭流式细胞仪主机电源； 8．退出软件，关计算机。

清洗外部

用软布沾次氯酸钠和蒸馏水清洗分选仓、偏转板、上样架、分选收集架，进行消毒和避免形成盐结晶。

酒精桶 鞘液桶 酒精桶

鞘液桶

气管

液流管

每日关机和日常维护

（一）日常关机

1．关闭液流

2．取下喷嘴，装上Closed Loop Nozzle。

3．从菜单上选择Cytometer> > Cleaning

Modes > Clean Flow Cell，会弹出右侧窗口：

放一管无菌水在上样台上。

4．完成后，按要求点击OK；

5. 用超纯水清洗Closed Loop Nozzle。

6．关闭流式细胞仪主机电源；

7．退出 FACSDiva软件，关电脑。

FACSDiva软件介绍

DIVA软件界面如下：

在①工具栏中，可以显示或隐藏某个工作窗口

1、工作界面工具栏

保存（Save）-保存实验模板及数据。直接退出软件时，软件将自动保存已建立的实验模板和已获取的实验数据。

浏览器（Browser）-点击可显示或隐藏浏览器窗口。

多孔板（Plate）-显示或隐藏多孔板实验窗口。

仪器设置（Cytometer）-显示或隐藏仪器设置窗口。

属性（Inspector）-显示或隐藏属性窗口。

工作表（Worksheet）-显示或隐藏工作表窗口

获取控制器（Acquisition Controls）-显示或隐藏获取面板

生物指数编辑器（Biexponential Editor）-显示或隐藏生物指数编辑器

分选设置（Sorting）-显示或隐藏分选设置

2、各窗口介绍

2.1 浏览器（Browser）

浏览器是创建实验模板和管理实验数据的窗口。如图：

窗口第一栏的浏览器工具栏（Browser toolbar）中包含了浏览器的所有构建模块，点击某个图标即可建立对应的项目。从左至右分别是：文件夹（Folders）

、实验（Experiments）、样本（Specimens）、样本管（Tubes）

、样本/样本管特异仪器设置（Specimen/Tube-specific cytometer settings）、分选版面（Sort layout）、总工作表（Global Worksheet）

、多孔板（Plate）。各新建的项目均可用鼠标右键菜单重命名。

2.2 仪器设置窗口（Cytometer）

仪器设置窗口是调节各通道电压、选择信号放大类型、脉冲类型、荧光补偿、阈值、激光延迟的界面。

2.3 属性窗口（Inspector）

当鼠标焦点位于某个窗口或图像、数据框时，属性窗口内显示该焦点的相关设置。

2.4 获取面板（Acquisition DashBoard）

在获取面板中，用户可以控制仪器上样、获取数据、设置停止门、设置保存细胞数量。

2.5 分选设置窗口（Sorting）

分选窗口包括两部分：侧液流窗和断点液流窗

?侧液流窗中可以控制电压开关、测试液流、滤光片、废液

抽屉、调整侧液流角度、液流聚焦、调整液滴延迟。

?断点液流窗可以开、关液流，开启断点监视（Sweet Spot）、

调整振幅（Ampl）、震荡频率（Freq）、设置Drop1和Gap

值。

2.6 工作表窗口（Worksheet）

在工作表窗口中，用户可以创建实验模板，包括直方图、散点图的绘制、各种门的创建以及进行数据分析。

实验模板建立常见问题

问题1：在选择通道参数时，待选项中没有自己要选的荧光名称。

1.打开Cytometer菜单下的View Configurations（视图设置）选项。

2.在跳出的窗口中双击仪器配置。

3.在新窗口的右侧Parameters中有各种染料的名称，将其拖拽至相应的检测器中。完成后点击OK。

4.点击Set configuration，点击OK。

★若3中仍找不到所需染料名称，则可在2的Parameters选项卡中添加，然后完成3、4过程即可。

问题2：如何在荧光通道中添加抗体名称？

1．在Experiment菜单下选择Experiment Layout（布局）。

2.在新窗口的Label栏中添加抗体名称，完成后点击OK。

亦可选中同一列Label批量添加抗体名称

手动调整补偿

以FITC/PE双染为例：

1.建立如下实验模板：

2.上阴性/同型对照（未染的细胞），调整参数的电压将细胞群调至第三象限（Q3）：

3.上FITC单染样本，调整Cytometer面板Compensation（补偿）中的值，使阳性信号落入单阳性范围(如下图右侧)。调整前后信号差别如下：

4.上PE单染样本，调整Cytometer面板Compensation中的值，使阳性信号落入