常见问题应对手册

第一部分：实验内容问题

一、建库前

1.分离时我们需要注意什么吗？

回答：分离时我们要小心吸取上清不能吸到中间的白细胞。移液枪不要碰到采血管。

2.我们提取的DNA浓度过高是什么原因导致的？

回答：正常提取的DNA的浓度为0.1到0.3ng/ul，如果浓度太高可能是DNA含有杂质可能是漂洗的时候没洗好，也有可能是样品问题，血浆分离时浆白细胞吸到血清中，细胞经高速离心时破裂细胞中的DNA游离到血浆中导致DNA浓度过高。

二、建库及定量

1.我们文库构建后浓度很低？

回答：文库构建浓度过低的因素很多，试剂没混匀、温度、操作问题、PCR扩增前的晾干步骤没晾干或管壁含有酒精抑制PCR的扩增等。解决：办法规范操作，晾干前观察管壁是否有酒精，控制温度在25度。

2.接头污染了怎么办？

回答：接头污染可能是操作当造成的，我们要及时消毒台面，加接头是要注意换手套3-4 个换一次手套。

3. Qubit 定量不准确？

回答：仪器本身有一个精确度会产生一定差异，但这是可以在接受范围内的。但要注意每次测试样品前要校准曲线用同一次配的染色液。

4.稀释方法的选择？

回答：我们先有两种混样方法，一种是先稀释后混样，另一种是先混样后稀释，对于Qubit测出来的浓度采用后一种方法结果较好。

5.样品的数据量不均一怎么办？

回答:样品结果的不均一是由于混样量不均一导致的，原因是浓度测的不准确，混样时没有将样品充分混匀导致的。解决办法：放置太久的样品重新定量，用震荡器或移液枪充分混匀。

三、上机

1.怎么知道ot仪是否正常运行？

回答：ot每次运行完后仪器会有一份这次试验ot运行参数的文件（文件在关机后自动删除），通过查看运行的参数和图表对比正常运行的参数查看ot是否正常运行。

2.ot仪器程序不能正常运行？

回答：ot仪器不能正常运行有可能是实验室温度太高了，导致ot不能正常运行，要确室温保温度在20-25度。

3.仪器清洗的时间有什么要求？

回答：仪器每天要水洗一次，一周氯洗一次，超过72小时未使用也要氯洗一次。

4.清洗的芯片可以用固体配置的NaOH吗？

回答：可以但要在配好后用o.45um滤膜过滤才能使用，我们推荐用sigma的液态分子生物级的氢氧化钠。出事我们不负责。

5.移液枪打汽泡不够细腻？

回答：打汽泡不够细腻是由于移液枪本身的冲击力不足导致的，没有什么解决的办法唯一的办法就是换枪，但枪头放置在液体的中心正对ep管管低较好打出汽包。

6. Loading芯片时不小心打进气泡怎么办？

回答：打进气泡没有什么好的办法，只有重新加入试剂将气泡赶出来。

四、结果及数据分析

1. Loading率很低怎么办?

回答：loading率原因有很多，上样量不足，操作不当，ot仪器运行不正常，文库定量不准，保存不当等，解决方法：重新定量文库，调整上样量和混样方法。监控实验室温度和ot仪的温度，操作时注意不要把磁珠震起来或吸到磁珠，ot 完成后15分钟没有操作要重新离心。

2.片段结果片段很短小于正常值150bp左右？

回答：样品可能被污染了DNA酶，导致DNA样品降解了，解决办法：重新提取DNA。

3.Loading率高但有用的数据量不足？

回答：（1）首先观察芯片是否有异常，如果是芯片信号有缺损，形状边缘整齐形

状，颜色较蓝，怀疑芯片问题。

（2）芯片整块比较篮，颜色基本一致，颜色为浅蓝，这个可能是没用加酶或没加引物。

也可能是ot模板制备失败。

4.跟华大的数据分析比，优劣如何？

5.是否可检测其它染色体异常？准确率如何？

回答：按照原理我们是可以得到所有染色体DNA序列，但是由于其他染色体异常极其罕见，没有足够的样本来证明结果的可靠性，性染色体异常较常见但准确率达不到13、18、21三体的准确率。

6.插件分析的原理和具体过程如何？

回答：三体原理：每一条染色体上的碱基数占整个基因组碱基数比值是一个定值，如果是三体则它占整个染色体的比值会上升。通过Z值检验来确定三体准确性，我们首先将测序得到的数据（文件类型fastq）通过bowtie序列比对软件将测序得到的序列比对到人类基因组上，找到每条序列的确切位置。计算每条常染色体占整个染色体的比值（这两个都是测序的来的数据，由于文库构建存在一定的GC测序偏好性我们还要进行进行一个GC校准），通过

7.灰区的意义是什么？两次都在灰区如何处理？

灰度区划分是为了减少假阴性假阳性提高准确率。一次测序得到的数据量是一定的，经过数据分析的Z值也是一定的，唯一解决的方法就是从头重做,重新得到新的数据。

8.如何减少灰区出现频率？

答：首先灰度区和实验操作无关，是随机出现的，一般一套试剂会出现5~10个。

9.如果实验情况不好，能否从最后结果中分析出可能原因？如何分析？

实验结果我们一般关注的参数有loading率、多克隆、read的数量、read数据均一性、低质量、片段长度…..等信息。

10.如何分析sn/tn的report文件，以及下载的tn版本的archive压缩包里的文件。

11.如果出现样本间的相互污染，如何从结果中发现？怎么解决？

答：样本之间的污染是无法从结果发现的，解决办法：严格按照SOP操作，尽量避免出现污染。

第二部分：实验相关问题

一、场地环境

1.实验室分区？是否可以减少或增加？

回答：

（1）我们一般要求为4个实验区，分别是试剂准备间、样本准备与文库制备区、扩增与产物分析区，测序区。

（2）如果要减少，可以去掉试剂准备间。

（3）如果条件允许，可以增加样品接收和登记房间。

2.实验室洁净度、通风、气压要求？

回答：

（1）PCR实验室的洁净度要求。

（2）各房间独立通风。

（3）缓冲间为正压。样本提取房间为正压，扩增与产物分析区为负压，测序区为负压。

3.房间温湿度要求？达不到要求有什么影响，如何处理？

回答：

（1）温度20~25度，湿度40%-60%。

（2）温度过高影响仪器运行和实验结果。湿度过高影响仪器寿命。

（3）温度过高增加降温措施，湿度过高增加干燥措施。

4.房间及设备清洁和消毒？

回答：参考实验室实验室卫生管理规程。

5.人员服装要求？

回答：参考实验室实验室卫生管理规程。

二、实验仪器和软件

1.仪器是否有注册证?

DA8600仪器已通过CFDA认证，注册时间为2014年。产品技术要求编号：国械注准20143401961。产品注册编号：国械注准20143401961。生产许可证号: 粤食药监械生产许20040999号。

2. 系统和软件是否定时升级更新？如何更新？

并无定时更新。系统升级由试剂的更新决定。软件的更新升级有两种情况，一种是在系统升级后进行软件升级；另一种是生物信息部门推出了进一步优化，或者增加功能的软件版本后进行更新升级。系统和软件升级的完成参照操作文档来做。

3. 仪器的保修期多长，如何计算？

从装机完成之日开始计算，一年时间。

4.在培训完成后，仪器出问题如何处理？

答：仪器出现问题，客户首先联系我们公司相应的负责人，然后由我们公司联系相应的厂家，由我们公司和原厂家一起处理好相关的仪器售后问题。

三、实验试剂和耗材

1.试剂是否已注册？

答：我们的NIPT试剂已在CFDA注册，试剂注册证：20143401960。

2.是否有其它包装的试剂？

3.耗材包是否可单独购买？

4.qubit试剂与无创试剂的人份比例是多少？

5.当出现试剂问题时，如何确认？赔偿方案如何？

第三部分：其它问题

一、人员

1.驻点人员的水平如何?

回答：驻点人员出来之前，至少经过三个月的培训，加上在广州达瑞实验室的三个月实操经验。组长具有更多的经验。

2.培训时长需要多久？

集中培训下，培训完成一般需要1-2个月时间。

3.是否可以派人到达瑞学习？是否收费？

回答：如果已签订合同，在提前预约好之后，可以派人到广州达瑞NIPT实验室进行1周到2个月时长的学习，并不收取培训费用。旅费自行解决。在达瑞实习

生宿舍有空位的情况下，可提供1-2个住宿位（类似大学集体宿舍）。

4.实验出现问题时，技术支持人员能否到现场解决问题？是否收费？

二、报告

1.填写无创申请单和保险单要注意些什么？

回答：申请单和保险书写要规范字迹清晰信息真实可靠，必填的项目一定要勾选或填写。孕周大于26周的需填写知情同意。

2.如果有异体输血干细胞治疗…等不能做吗？

回答：是的，不过离治疗有一定的时间也是可以做的，具体时间查看申请单，如果符合对结果无影响。

3.我们需要采多少血？

回答：我们需要7-10ml的全血，用EDTA抗凝管或专业用采血管。

4.溶血了怎么办？

回答：将溶血的样品等记，通知孕妇重新采血。

5.收样的注意事项：

（1）样本采集要求：

由医院医生或护士按照外周采血标准采集8-10 mL（使用Streck Cell-Free DNA BCT 采血管或Ardent采血管）孕妇的外周血；EDTA抗凝管采集完后，轻微颠倒采血管10次，立即分离或将采血管放入4℃冰箱中暂存（不超过8h，EDTA抗凝管不适合用于运输）；Streck Cell-Free DNA BCT 采血管和Ardent管采血后立即缓慢的颠倒10 次使血液与管内成分混匀，15-30℃保存。

（2）样本保存要求：

EDTA抗凝管采血后立即分离或将采血管放入4℃-8℃冰箱中暂存（不超过8h）并及时送检，分离后血浆-25℃至-15℃保存送检（或干冰条件下运输）；Streck Cell-Free DNA BCT 采血管和Ardent管采血后常温（15-30℃）保存，及时送检，或72小时内完成血浆分离，分离后血浆-25℃至-15℃保存送检（或干冰条件下运输）。

（3）接收后编号，严格核对样本编号、确保编号唯一，勿搞混样品。

（4）注意不同采血管血浆分离的时间要求，避免样品过期导致溶血。

（5）全血样本检查是否溶血或凝血：

6.出报告对人员资质有什么要求？对医院实验室资质有什么要求？

答：

7.如果医院没有试点资质，应该如何处理报告、保险单、知情同意书问题？答：一、以达安临检的名义发报告；

二、公司和医院以科研服务的形式，出具科研报告；

三、公司、其它产品、其它部门

1.跟优生优育相关的产品有哪些？

答：NIPT、PGS、PGD、STR、产新筛。

2.哪些产品你们公司是做得比较完善的？哪些是在国内市场中比较新的？

答：

3.你们公司成立多长时间？发展如何？在各地业务分布情况如何？

答：

4.你们部门主要负责什么？跟科研部门有什么关系？

答：主要负责NGS平台项目售后技术培训服务，科研部门负责我们技术部门新产品和现有产品更新优化的技术培训。