苦参碱调节Aurora-A表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药的研究

1、项目名称：苦参碱调节Aurora-A表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药的研究

2、研究前景分析

胰腺癌的发病率逐年升高，在欧美居常见恶性肿瘤的第4位，在我国位于恶性肿瘤死亡的第9位。据报道胰腺癌在初次确诊后，1年内死亡率达80%，3年内为95%。转移患者的中位生存时间3-6 mon，局部晚期6-10 mon。存活率的提高主要源于手术切除率和外科治疗水平的提高。手术仍是目前惟一有希望治愈胰腺癌的措施，但由于缺乏早期诊断手段，只有10%～20%的病人就诊时适宜手术切除，总的切除率为14%。手术切除者，总的5年存活率为18%，淋巴结阴性的病人为32%，切缘和淋巴结均为阴性的病人可达到40%。70%～80%的病人由于肿瘤无法切除，必须通过非手术治疗来改善生活质量并延长生存期[1]。即使是肿瘤切除的病人，既往的随机对照研究也证明远期效果不理想，患者大多死于肝转移和局部复发。所以在手术同时配合辅助化疗，以期达到提高生活质量和延长生存时间的目的。但胰腺癌的化疗效果仍不是很理想，作为胰腺癌的首选药物的而吉西他滨，其化疗有效率仅为25%[2]。多药耐药（multidrug resistance，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因之一。MDR 是指抗某种细胞毒物药的耐药特征，可对许多结构上无关或作用机制上不同的其他细胞毒药物产生交叉抗药性，可由肿瘤细胞的MDR基因过表达或扩增所引起，但是其机制却不明确。

吉西他滨在胰腺癌的化疗中有着极其重要的地位。吉西他滨是一种属于新型抗嘧啶核苷酸代谢化疗药物，属细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期（即S期）的肿瘤细胞，是胰腺癌的标准一线化疗方案[3]。有报道指出，腹腔内吉西他滨灌注能有效抑制肿瘤生长，改善患者生活质量，并减轻全身毒性反应[4]。尽管吉西他滨单药方案已经成为胰腺癌辅助治疗的标准方案，但其疗效还不能令临床医生满意，尤其是对无手术指征的局部晚期和转移性胰腺癌，中位生存期的延长较传统的5-FU/LV也仅数月。多药耐药（multidrug resistance，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因之一。因此研究胰腺癌吉西他滨耐药机制，寻找逆转耐药的关键靶位，对提高胰腺癌吉西他滨化疗效果具有重要的意义。

目前已知的多药耐药机制包括MDR基因及其编码的P-糖蛋白过表达、拓扑异构酶Ⅱ的

改变、谷胱甘肽及其相关酶的改变、蛋白酶C改变、DNA损伤修复能力增强、细胞凋亡相关基因表达的增加[5]等。不管何种机制，细胞凋亡障碍或减少是引发耐药的重要因素。p53作为促凋亡基因已被肯定，p53基因缺失或其产物P53蛋白功能抑制是引起细胞凋亡减弱的重要原因，进一步的研究表明P53蛋白可能与肿瘤的化疗敏感性相关。P53蛋白在上游基因如Mus81等的调控下活性增强，从而介导细胞细胞凋亡，表现出对化疗药物的敏感[6]，而在抑制了P53的活性后，肿瘤细胞表现出对化疗药物的耐药。Cascalló等[7]研究发现在人胰腺癌移植瘤模型中，依次摄入吉西他滨和p53能明显抑制肿瘤生长，其抑制作用明显强于单用吉西他滨和p53，且两者联用时的化疗增敏作用与肿瘤的组织学特征相关(如增加肿瘤组织内纤维化和凋亡水平)。提出人胰腺癌体内移植模型中，恢复p53的抑瘤作用使吉西他滨化疗增敏的分子途径得以建立。Dong等[8]研究发现p53突变非独立的胰腺癌预后因素，但可以显著增加胰腺癌某些化疗药物的化疗敏感性。上述研究提示P53蛋白差异表达与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性有关。而Aurora-A 是p53的结合蛋白，p53通过位于Aurora-A N末端的Aurora-box直接与Aurora-A结合，抑制Aurora-A激酶的活性，抑制Aurora-A引起的中心体扩增，抑制Aurora-A转化NIH3T3细胞的能力。而Aurora-A可对p53 315位丝氨酸磷酸化，导致它通过泛素化途径降解。而无活性Aurora-A的情况下p53不能被降解[9]。提示Aurora-A通过调节p53活性参与细胞凋亡及耐药[10]。研究表明Aurora-A在胰腺癌中高表达，有可能作为胰腺癌的增殖性标记，与胰腺癌的预后相关。Dr V on Hoff的实验室经过进一步研究甚至已将其作为诊治胰腺癌的分子靶点。吉西他滨高耐药的胰腺癌预示着较差的预后，可能与Aurora-A正相关[11]。因此进一步研究意为黎明女神的Aurora-A与胰腺癌吉西他滨耐药性的关系具有重要的意义。

与化疗药物毒副反应大的特点相比，中草药具有独特的优势。随着对中草药研究的不断深入，发现了许多具有抗肿瘤作用的中草药。苦参是一味传统中药，含有多种生物碱。现代医学表明，苦参类生物碱不仅具有较高的抗肿瘤活性及免疫调节作用，近来研究表明还具有逆转肿瘤对化疗药物耐药的作用。丁艳芳[12]等研究了苦参碱逆转人白血病K562/ADM细胞对阿霉素耐药性的研究，其研究结果表明了苦参碱能部分逆转K562/ADM

细胞对ADM的耐药性，提高K562/ADM细胞对ADM的敏感性，进而促进细胞凋亡，从而初步证明了苦参碱既是一种抗肿瘤药物，又是一种耐药逆转剂。该研究反应了苦参碱对白血病K562/ADM细胞对阿霉素耐药的逆转现象，但缺乏对逆转机制的深入研究。陈雁鸿[13]等将苦参碱分别与长春新碱、阿霉素、平阳霉素、顺铂及环磷酰胺六种常用的化疗药物联合作于于喉癌KBV200耐药细胞株，通过测定耐药相关蛋白P糖蛋白（P-gp）表达判断苦参碱对耐药的逆转作用。研究结果发现苦参碱分别与长春新碱和阿霉素联合作用后可使KBV200耐药细胞株P-gp的表达水平下降，从而逆转其耐药性。其研究结果表明苦参碱具有逆转部分化疗药物耐药性的现象，并表明其逆转作用与下调P-gp表达有关，但上述研究均未涉及苦参碱对耐药菌株Aurora-A表达的影响，也无苦参碱逆转耐药与调节Aurora-A有关的结论。然而以往的研究表明[14]，苦参碱可明显上调p53基因及其表达产物P53蛋白的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。苦参碱具有调节P53蛋白表达的作用，Aurora-A可调控P53蛋白的活性，而P53蛋白表达与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性相关，因此，苦参碱可能通过调节Aurora-A的表达来调控P53蛋白表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药性，需要进行深入的研究证实。

构建相应动物及细胞模型是研究肿瘤发生发展重要的部分，建立具有明确特征的肿瘤模型是研究和揭示肿瘤分子机制的关键平台[15-17]。目前国内外对于胰腺癌吉西他滨耐药细胞系建立多采用体外细胞培养的方式。国外Togawa等[18] 通过体外吉西他滨阶梯浓度培养法建立了一个对吉西他滨耐药的胰腺癌细胞系，并通过该模型研究发现此细胞系同时也对5-FU 有耐药性，提示针对吉西他滨与5-FU 的耐药性通路可能有所重叠，或许与肿瘤的多药耐药有关。国内要洁等[19]通过亦逐步增加培养基中吉西他滨的浓度，在人胰腺癌细胞系SW1990中建立了对吉西他滨耐药的细胞系SW1990-GEM。并且研究表明SW1990和SW1990-GEM的半数抑制浓度(IC50)有显著性差异；SW1990-GEM，耐药性能明显、稳定，对5-FU、表柔比星、丝裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、泰素帝、长春新碱和依托泊苷产生交叉耐药，对顺铂、阿糖胞苷无交叉耐药。这些动物模型、细胞系的构建为胰腺癌及化疗耐药性的机制研究提供了平台。但这些模型不能真实反映临床上胰腺癌耐药多通过体内药物诱导逐步产生的实际

现象，构建更符合胰腺癌吉西他滨耐药发生发展过程的模型有助于获得更科学的实验结果。体外细胞株培养，构建胰腺癌动物模型，并运用体内化疗筛选出高耐药的瘤体并进行细胞

分离培养，反复循环筛选，最终获得的高耐药的细胞株及动物模型。该方法筛选的耐药细

胞株及构建的耐药模型更能模拟临床胰腺癌吉西他滨耐药的过程，区别于细胞株化疗药物

单纯体外阶梯浓度诱导获得耐药细胞株，在体内环境下具有更好的稳定性。本研究将以此

为实验平台，检测苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞株及动物模型中P53蛋白表达的影响，有助于提高实验结果的可靠性。

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3、研究内容

研究内容：胰腺癌对吉西他滨化疗敏感性具有显著的差异性，其差异性决定了胰腺癌患者术后及中晚期胰腺癌的预后。其敏感性是影响生存期的重要的因素之一。运用ELISA及免疫组化技术，以构建的具有相同遗传背景的胰腺癌吉西他滨高、低耐药模型为平台，测定Aurora-A在不同耐药表型动物模型血清和瘤体组织中的表达；通过苦参碱处理高耐药动物模型后Aurora-A在血清和瘤体组织中的表达及肿瘤恶性特征的变化验证其作用，为苦参碱对胰腺癌吉西他滨化疗耐药逆转机制的研究提供基础。

本课题主要有以下内容：

1)人胰腺癌细胞株panc-1接种于裸小鼠皮下，再行瘤块移植于胰腺尾部的方法建立裸鼠

胰腺癌模型。（此部分已经完成）。

2)通过循环筛选的方法构建具有相同遗传背景不同耐药表型的胰腺癌吉西他滨耐药模型。

3)ELISA分析两组血清中Aurora-A的表达，免疫组化方法分析两组瘤体组织中Aurora-A

的水平。

4)高耐药动物模型随机分组，分别予苦参碱、吉西他滨交替腹腔灌注和生理盐水、吉西他

滨交替腹腔灌注处理，检测模型血清和流体组织中Aurora-A表达，并分析相应模型的化疗效果，包括瘤体大小、周围侵犯、淋巴结、肝脏、腹膜等转移情况。

研究目标：通过体外细胞株培养-体内化疗药物诱导反复循环筛选的方法构建低耐药、高耐药表型的裸鼠胰腺癌吉西他滨化疗模型，ELISA和免疫组化方法分析Aurora-A的表达水平，

从而验证Aurora-A与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的关系。苦参碱处理高耐药模型，Aurora-A 表达和肿瘤恶性特征的变化验证苦参碱可通过调节Aurora-A表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药。

拟解决的问题：

1.建立一种区别于体外化疗药物阶梯浓度诱导耐药的新的、更科学的胰腺癌吉西他滨耐药

模型，更符合临床耐药性产生的过程。

2.分析Aurora-A在两组模型的血清中的表达差异及与化疗敏感性的关系。

3.分析Aurora-A在两组模型瘤体组织中的表达差异及与化疗敏感性的关系。

4.通过苦参碱处理后，高耐药模型Aurora-A的表达和瘤体大小、周围侵犯、淋巴结、肝

脏、腹膜等转移情况变化，明确苦参碱对胰腺癌吉西他滨化疗耐药的逆转作用。

5.研究方法和技术路线

研究方法及实验方案：

1. 胰腺癌模型组的构建：取100只裸鼠，将人胰腺癌细胞株panc-1细胞悬液皮下接种，瘤体成瘤后取1mm3大小的瘤块被膜下植入胰尾近脾门，缝合腹腔。

2. 化学治疗模型的构建：胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7天开始，健择240mg/kg，每周1次腹腔注射，共4次，第35天处死。

3. 重复筛选：取瘤体最大、淋巴转移及周围侵犯瘤最严重的瘤体组织制成细胞悬液按以上步骤复种于胰尾部，重复2轮筛选。

4.实验分组：取瘤体最小、淋巴转移及周围侵犯最轻的原发灶肿瘤细胞和第2轮筛选后的原发灶肿瘤细胞，进行原代培养。按瘤块移植、吉西他滨腹腔化疗方法，建立胰腺癌吉西他滨低耐药模型和高耐药模型。分别抽取血清，提取瘤体组织，记录瘤体重量、淋巴、腹膜、肝转移及周围侵犯情况。

4. ELISA方法测定两组血清中Aurora-A的表达情况，免疫组化方法测定两组瘤体组织中Aurora-A的表达情况。并统计分析两组Aurora-A表达差异，验证Aurora-A与胰腺癌吉西

他滨耐药关系。

5. 将高耐药模型随机分两组，一组予0.5mg/mL 苦参碱溶液和240mg/kg 健择交替腹腔灌注，另一组予等量生理盐水和240mg/kg 健择交替腹腔灌注，均每周1次，35天处死。ELISA 方法测定两组血清中Aurora-A 的表达情况，免疫组化方法测定两组瘤体组织中Aurora-A 的表达情况。记录相应的瘤体重量、淋巴、腹膜、肝转移及周围侵犯情况。

7. 统计分析两组血清、瘤体组织中Aurora-A 的表达差异及瘤体重量、淋巴、腹膜、肝转移及周围侵犯情况差异，得出实验结论。

技术路线：

技术路线一：

可行性分析：

1. 已掌握胰腺癌动物模型及胰腺癌吉西他滨化疗模型的建立和改良，模型稳定性满意。实验设计科学、合理，操作性强，能获得可靠的实验结果。

2. 前期免疫组化分析初步获得Aurora-A在胰腺癌耐药与非耐药模型中的差异表达，Aurora-A与胰腺癌吉西他滨耐药关系初步明确。

3. 理论上可行，苦参碱能通过调节Aurora-A进而调控p53基因及P53蛋白表达，诱导细

胞分化或凋亡，而P53蛋白表达被认为与肿瘤的化疗敏感性关系密切，苦参碱具有逆转肿瘤化疗耐药的作用。因此，苦参碱可通过调节Aurora-A表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药的假设具有研究基础和理论依据，可行性强。

4. 依托浙江省中医药大学动物实验室及浙江大学医学院肿瘤研究所，具备完成ELISA和免

疫组化等实验的设备和经验。

6.研究结果

课题的顺利实施将建立一种新的、更科学的胰腺癌吉西他滨耐药模型，为开展相应的基础研究提供实验平台；验证Aurora-A表达与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的关系，为进一步研究Aurora-A介导胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的研究机制提供方向；验证苦参碱通过调

节Aurora-A表达发挥对胰腺癌吉西他滨耐药的逆转作用，为临床应用苦参碱联合吉西他滨提高胰腺癌化疗效果提供实验依据；在国内外核心期刊发表论文2-3篇，SCI收录1篇。。

7.现有工作基础和条件

6.1已开展的与本课题相关的研究工作。

1.完成了胰腺癌动物模型及胰腺癌吉西他滨化疗模型的建立和改良，模型稳定性满意（见图1，2）。

图1 胰腺癌动物模型，箭头为胰腺癌瘤体图2 胰腺癌病理组织学检查结果

2.SELDI-TOF-MS质谱技术分析了高、低耐药组血清蛋白表达差异，筛选出核质比4295 m/z，3708 m/z，9475 m/z的三个蛋白质峰具有显著差异。以下为质谱分析结果：

表高耐药组和低耐药组三个蛋白质峰比较

蛋白质峰（m/z）低耐药组高耐药组P值

4295 3708 9475 2007.81±429.54

353.02±193.97

494.19±142.59

3131.75±640.32

715.39±335.03

4255.49±4491.25

0.0000034995

0.0000740640

0.0000007948

图3-5为质谱分析波谱结果：

图 3 m/z 4295

图4 m/z 3708

图5 m/z 9475

3.运用免疫组化检测Aurora-A在高低耐药组的表达情况，发现Aurora-A在高耐药模型瘤体组织中阳性率为10%（2/20），在低耐药即敏感模型中达90% (18/20)，提示Aurora-A与

胰腺癌吉西他滨耐药有关（图6）。

图6 胰腺癌吉西他滨低耐药模型Aurora-A阳性表达免疫组化图（Giemsa 染色；

左图×100，右图×400）

6.2 已取得的相关科研业绩。

1）近三年获得的科研项目

2）近三年来获得科技奖励情况

3）近三年已发表的主要论文